抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计*
作者：贾战生 周永兴 连建奇 冯志华 李光玉 张文彬
单位：第四军医大学唐都医院传染病防治中心 陕西省西安市 710038
关键词：丙型肝炎病毒；核酶；计算机设计
世界华人消化杂志990408 摘 要
目的 设计可位点特异切割丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区(5’NCR)和C区的多位点核酶(RZ).
方法 根据“锤头结构”RZ的设计原理，以HCV-H(1a)株5’NCR和C区RNA为靶序列，计算机预测其二级结构，运用能量最低化程序，选择理论上理想的RZ切割位点，并比较5株HCV序列RZ切点两翼的同性.
结果 在HCV 5’NCR和C区124个自然切割位点(CUX和GUX)中选出213(CUC)，260(GUA)，407(GUC)和498(CUU)4个切割位点，不同株之间切点两翼RZ结合序列同源性为100%.
, 百拇医药
结论 计算机可作为抗病毒RZ设计的辅助工具；HCV上述4个位点可能是最理想的切割位点.
中国图书资料分类号 R512.6
Computerized design of hepatitis C virus RNA-directed hammerhead ribozymes*
JIA Zhan-Sheng, ZHOU Yong-Xing, LIAN Jian-Qi, FENG Zhi-Hua, LI Guang-Yu and ZHANG Wen-Bin
Tangdu Infectious Diseases Hospital, Fouth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Subject headings hepatitis C virus; ribozymes; computerized design
Abstract
AIM To design the hammerhead multi-unit ribozymes (RZ) which may specifically cleave 5'noncoding region (5'NCR) and core region of hepatitis C virus (HCV) RNA.
METHODS The possible secondary structures of RNA sequence of HCV-H (1a) strain which was taken as the targeting RNA was predicted, the ideal cleavage sites were selected, and their ribozymes were designed with computer according to the principle of the “hammerhead structure” RZ and the lowest energy. And then the homogenecity of the sequence (7-8nt) around the cleavage sites was compared with other 4 HCV strains.
, 百拇医药
RESULTS The four sites 213 (CUC), 260 (GUA), 407(GUC) and 498 (CUU) were selected from the 124 natural sites (CUX and GUX) in 5'NCR and C region of HCV-H RNA. The sequences (7-8nt) around the four sites which could be bound by their ribozymes were homogenous among 5 HCV strains.
CONCLUSION Computer may be used as a helpful aid for designing the ribozymes against various virus RNA or mRNA. The 213, 260, 407 and 498 in 5'NCR and C region of HCV RNA may be the most ideal cleavage sites.
, 百拇医药
0 引言
丙型肝炎病毒(HCV)是一个正链RNA病毒，其基因组由一个大的开放读码框与5’和3’端非编码区(NCR)组成，约9.4kb. 由于HCV的分子生物学特性和机体抗HCV免疫学特征，HCV疫苗的研制遇到一定的困难. 目前对HCV基因分型和结构功能的研究表明，HCV 5’NCR含核糖体结合位点，具有重要的生物学功能，在各病毒株之间5’NCR和C区高度保守，是HCV反义治疗策略的理想靶序列[1]. 核酶(ribozyme, RZ)作为基因治疗的重要手段之一，已在抗肿瘤和抗病毒研究中显示出巨大的应用价值. 近年来，RZ抗病毒的研究在不断深入，研究最早，取得成就最大的抗HIV RZ已在美国和澳大利亚批准临床试用. 抗肝炎病毒RZ是研究的又一热点. 我们设计构建的抗HBV C区mRNA多位点RZ，体外切割结果表明，可位点特异性切割靶mRNA[2]. Lieber et al[3]和Sakamoto et al[4]最近报道了应用抗HCV锤头结构RZ可以阻断病毒的基因表达和复制，国内未见抗HCV RZ的研究报道.
, 百拇医药
我们选择HCV-H株的5’NCR和C区为靶序列，根据Symons的“锤头结构”原理，应用计算机辅助设计，从HCV5’NCR和C区124个自然切点(CUX和GUX)中选出理论上理想的4个位点213(CUC)，260(GUA)，407(GUC)和498(CUU)，并比较了HCV不同株之间切割位点两翼序列的同源性，体外设计并合成RZ cDNA，已构建了真核表达载体pcDNA-Rz，并进行了细胞水平的研究，现报道抗HCV RZ的计算机设计.
1 材料和方法
1.1 HCV靶基因序列和二级结构预测 以Grakoui et al[5]构建的pBRTM/HCV1-3011质粒为分析序列，其中含HCV-H株(GeneBank号为M67436)的cDNA，由美国华盛顿大学的Rice教授惠赠. 计算机预测5’NCR和C区(1-915nt)RNA的二级结构.
, http://www.100md.com
1.2 选择切割位点和RZ设计 根据Symons“锤头结构”模型，确定RZ中心催化区碱基序列(22nt)，采用中科院上海生化所陈农安研究员编制的核酶设计软件[6]. 根据预测的5’NCR和C区二级结构模型计算RZ自然切点(CUX和GUX)两翼碱基序列(7-8nt)的能级参数(AEs'). 选择AEs'较低的位点作为RZ的预选位点，并计算对应的RZ能级参数(AEr')，在RZ的5’和3’端分别设计XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，根据能量最低化原理预测RZ与底物结合的二级结构，选择理论上理想的切割位点，确定RZ分子序列. 并用加拿大国家科学院Zuker编写的pcFOLD软件计算RZ切割靶RNA的各能级参数，以确定最佳RZ切点.
1.3 RZ切点两翼靶RNA的同源性分析 采用NCBI GeneBank(美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)对5株HCV(即HCV-H，HCV-1，HCV-J，HC-C2和HC-G1 GeneBank号分别为M67463，M62321，D90208，D10934和D14853)RZ切点两翼(7-8nt)的同源性进行分析，以预测RZ抗HCV病毒的“广谱”性.
, 百拇医药
2 结果
HCV-H株5’NCR和C区有915nt，其中“锤头结构”RZ的切点(GUX和CUX，X为A，C或U)共有124个. 计算机发现213，260，407和498四个切点比较理想，RZ与底物RNA相互作用的能级参数比较低(表1).
表1 抗HCV RZ的4个理论切点的计算机分析 RZ
切点
切点
碱基
碱基对
能 级 参 数
5’端
, 百拇医药 3’端
△Es'
△Er'
(△Er')*
△E
RZ1
213
CUC
7
7
4.2
6.0
2.8
, 百拇医药
-28.9
RZ2
260
GUA
7
7
5.5
1.3
-24.8
RZ3
407
GUC
8
, 百拇医药
7
4.1
12.2
5.5
-26.8
RZ4
498
CUU
8
7
2.0
10.9
6.7
, 百拇医药
-26.1
△Es' 底物从稳定态变为松弛态所需的能级参数；△Er' 核酶从稳定态变为松弛态所需的能级参数；△E 底物与核酶形成二级结构所需的结合能；*改变碱基后核酶从稳定态变为松弛态所需的能级参数.
2.1 RZ与靶切点两翼RNA作用的二级结构 上述切点及两翼RNA序列形成突出的半环状结构，切点暴露，对应的RZ二级结构显示锤头状，RZ与靶RNA切点两翼的碱基作用的二级结构模型(图1).
图1 RZ与靶切点两翼RNA作用的二级结构模式.
2.2 RZ切点两翼HCV基因的同源性 在选择有代表性的5株HCV-H,HCV-1,HCV-J,HC-C2和HC-G1中，切点213，260，407和498两翼RZ配对的碱基(7-8nt)完全一致. 说明以HCV-H为靶序列设计的以上RZ，有可能切割其他株HCV RNA.
, 百拇医药
3 讨论
RZ作为抗病毒基因治疗的重要策略之一，近年来在抗肝炎病毒的研究方面引起了人们的极大兴趣. 已有研究表明，抗HBV表面抗原和核心抗原mRNA RZ，以及抗HCV 5’NCR和C区RZ可在无细胞和肝细胞内阻断病毒基因的表达和复制[2-4]. 然而对于目标RNA上切点的选择，RZ与靶RNA之间碱基配对长度的确定，以及RZ表达质粒的设计很大程度上仍然取决于研究者的经验. 许多研究表明，RZ切割效率的发挥，很大程度依赖于靶RNA切点的选择和RZ的设计. 选择理想的靶位点需要考虑[7]： ①靶位点所在的序列具有重要的生物学功能；②选择的位点及其周围序列具有高度保守性；③靶位点的易接近性. 我们选择的HCV 5’NCR和C在不同HCV株之间高度保守，对病毒的复制具有重要作用.
锤头结构RZ分子较小，设计简单，研究最多的抗病毒Rz. 目前Rz切点的选择和设计方法有RNAse H印迹法，RZ文库法，计算机辅助设计和以细胞为基础的设计筛选程序[7]. 我们选择了目前比较常用，也较为简单的计算机辅助设计，运用能量最低化原理，根据陆长德et al提出的Rz与底物相互作用模型，在HCV 5’NCR和C区选择了理论上最理想的4个切点，设计了4个锤头结构Rz，计算机模拟显示底物和Rz可形成理想的二级结构. 我们的结果表明，RZ 213，RZ 407和RZ 498经过改造，即锤头结构中的一个C换成G，△Er'明显变小. 5株HCV RZ切点两翼碱基(7-8nt)比较分析表明，同源性为100%. 提示该4个位点的RZ可能对其他4株也有切割作用.
, 百拇医药
我们设计的Rz两端有XhoⅠ和BamHⅠ位点，以便插入pGEVE8459v3[8]带自剪切RZ的体外转录载体，然后进一步将带自剪切RZ的目的RZ插入可调控逆转录病毒载体(pBPSTR1)导入细胞，研究RZ在细胞内对HCV RNA的切割作用，以及调控剂对RZ表达和阻断效应的影响. 我们设计的4个RZ是否理想，能否在细胞内有效的发挥抗病毒作用还有待进一步体外实验和细胞内研究所证实. 虽然复杂的细胞内环境对RZ活性的影响因素很多，但应用计算机辅助设计，以减少底物和RZ本身结构对切割活性的影响，对RZ抗病毒作用的研究也是必不可少的步骤之一.
作者简介：贾战生，男，1959-03-30生，陕西省西安市人，汉族. 副主任医师，副教授. 1983年第四军医大学医疗系本科毕业，1989年第二军医大学硕士毕业，1995/1998年在导师周永兴教授的指导下从事病毒性肝炎基因治疗的研究，1998-07毕业，获医学博士学位，多年来从事移植免疫、抗肿瘤治疗、病毒性肝炎的免疫学和抗病毒基因治疗等研究，共发表论文30篇，获军队科技成果奖5项，参加编写肝硬变专业书一部.
, http://www.100md.com
*本课题获得全军医药卫生科研基金项目资助，No.98D048.
1998-11在全国第九届病毒性肝炎学术会议大会报告.
通讯作者 贾战生，710038，陕西省西安市第四军医大学唐都医院传染病防治中心.
*Supported by the Military Medicine and Health Science Foundation of China, No.98D048.
Correspondence to:JIA Zhan-Sheng, Tangdu Infectious Diseases Hospital, Fouth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Tel. +86.29.5377152
E-mail Jiazsh@fmmu. edu. cn
4 参考文献
[1] Okamato H, Mishiro S. Genetic heterogenity of hepatitis C virus. Intervirology, 1994;73:67-68
[2] 连建奇，周永兴，金由辛. 抗乙型肝炎病毒核酶自剪切体外转录载体的构建. 第四军医大学学报，1997；18:376-378
[3] Lieber A, He CY, Polyak SJ, Gretch DB, Kay MA. Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocyte by adenovirus-mediated expression of ribozymes. J Virol, 1996;70:8782-8791
, 百拇医药
[4] Sakamoto N, Wu CH, Wu GY. Intracellular cleavage of hepatitis C virus RNA and inhibition of viral protein translation by hammerhead ribozymes. J Clin Invest, 1996;89:2720-2728
[5] Grakoui A, Wychowski C, Lin Chao, Feinstone SM, Rice CM. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J Virol, 1993;67:1385-1395
[6] 陆长德，陈农安，祁国荣. 核酶对靶RNA体外切割反应的计算机分析. 生物化学与生物物理学报，1996；28:279-285
, http://www.100md.com
[7] 贾战生，连建奇，周永兴. 抗病毒核酶的设计和细胞内导入. 第四军医大学学报，1997；23：119-122
[8] Taira K, Nakagawa K, Nishikawa S. Construction of a novel RNA-transcript-trimming plasmid which can be used both in vitro in place of run-off and (G)-free trascriptions and in vivo as mμ lti-sequences trnscription vectors. Nucleic Acids Res, 1991;19:5125-5130
收稿日期 1998-09-11, 百拇医药
单位：第四军医大学唐都医院传染病防治中心 陕西省西安市 710038
关键词：丙型肝炎病毒；核酶；计算机设计
世界华人消化杂志990408 摘 要
目的 设计可位点特异切割丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区(5’NCR)和C区的多位点核酶(RZ).
方法 根据“锤头结构”RZ的设计原理，以HCV-H(1a)株5’NCR和C区RNA为靶序列，计算机预测其二级结构，运用能量最低化程序，选择理论上理想的RZ切割位点，并比较5株HCV序列RZ切点两翼的同性.
结果 在HCV 5’NCR和C区124个自然切割位点(CUX和GUX)中选出213(CUC)，260(GUA)，407(GUC)和498(CUU)4个切割位点，不同株之间切点两翼RZ结合序列同源性为100%.
, 百拇医药
结论 计算机可作为抗病毒RZ设计的辅助工具；HCV上述4个位点可能是最理想的切割位点.
中国图书资料分类号 R512.6
Computerized design of hepatitis C virus RNA-directed hammerhead ribozymes*
JIA Zhan-Sheng, ZHOU Yong-Xing, LIAN Jian-Qi, FENG Zhi-Hua, LI Guang-Yu and ZHANG Wen-Bin
Tangdu Infectious Diseases Hospital, Fouth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Subject headings hepatitis C virus; ribozymes; computerized design
Abstract
AIM To design the hammerhead multi-unit ribozymes (RZ) which may specifically cleave 5'noncoding region (5'NCR) and core region of hepatitis C virus (HCV) RNA.
METHODS The possible secondary structures of RNA sequence of HCV-H (1a) strain which was taken as the targeting RNA was predicted, the ideal cleavage sites were selected, and their ribozymes were designed with computer according to the principle of the “hammerhead structure” RZ and the lowest energy. And then the homogenecity of the sequence (7-8nt) around the cleavage sites was compared with other 4 HCV strains.
, 百拇医药
RESULTS The four sites 213 (CUC), 260 (GUA), 407(GUC) and 498 (CUU) were selected from the 124 natural sites (CUX and GUX) in 5'NCR and C region of HCV-H RNA. The sequences (7-8nt) around the four sites which could be bound by their ribozymes were homogenous among 5 HCV strains.
CONCLUSION Computer may be used as a helpful aid for designing the ribozymes against various virus RNA or mRNA. The 213, 260, 407 and 498 in 5'NCR and C region of HCV RNA may be the most ideal cleavage sites.
, 百拇医药
0 引言
丙型肝炎病毒(HCV)是一个正链RNA病毒，其基因组由一个大的开放读码框与5’和3’端非编码区(NCR)组成，约9.4kb. 由于HCV的分子生物学特性和机体抗HCV免疫学特征，HCV疫苗的研制遇到一定的困难. 目前对HCV基因分型和结构功能的研究表明，HCV 5’NCR含核糖体结合位点，具有重要的生物学功能，在各病毒株之间5’NCR和C区高度保守，是HCV反义治疗策略的理想靶序列[1]. 核酶(ribozyme, RZ)作为基因治疗的重要手段之一，已在抗肿瘤和抗病毒研究中显示出巨大的应用价值. 近年来，RZ抗病毒的研究在不断深入，研究最早，取得成就最大的抗HIV RZ已在美国和澳大利亚批准临床试用. 抗肝炎病毒RZ是研究的又一热点. 我们设计构建的抗HBV C区mRNA多位点RZ，体外切割结果表明，可位点特异性切割靶mRNA[2]. Lieber et al[3]和Sakamoto et al[4]最近报道了应用抗HCV锤头结构RZ可以阻断病毒的基因表达和复制，国内未见抗HCV RZ的研究报道.
, 百拇医药
我们选择HCV-H株的5’NCR和C区为靶序列，根据Symons的“锤头结构”原理，应用计算机辅助设计，从HCV5’NCR和C区124个自然切点(CUX和GUX)中选出理论上理想的4个位点213(CUC)，260(GUA)，407(GUC)和498(CUU)，并比较了HCV不同株之间切割位点两翼序列的同源性，体外设计并合成RZ cDNA，已构建了真核表达载体pcDNA-Rz，并进行了细胞水平的研究，现报道抗HCV RZ的计算机设计.
1 材料和方法
1.1 HCV靶基因序列和二级结构预测 以Grakoui et al[5]构建的pBRTM/HCV1-3011质粒为分析序列，其中含HCV-H株(GeneBank号为M67436)的cDNA，由美国华盛顿大学的Rice教授惠赠. 计算机预测5’NCR和C区(1-915nt)RNA的二级结构.
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1.2 选择切割位点和RZ设计 根据Symons“锤头结构”模型，确定RZ中心催化区碱基序列(22nt)，采用中科院上海生化所陈农安研究员编制的核酶设计软件[6]. 根据预测的5’NCR和C区二级结构模型计算RZ自然切点(CUX和GUX)两翼碱基序列(7-8nt)的能级参数(AEs'). 选择AEs'较低的位点作为RZ的预选位点，并计算对应的RZ能级参数(AEr')，在RZ的5’和3’端分别设计XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，根据能量最低化原理预测RZ与底物结合的二级结构，选择理论上理想的切割位点，确定RZ分子序列. 并用加拿大国家科学院Zuker编写的pcFOLD软件计算RZ切割靶RNA的各能级参数，以确定最佳RZ切点.
1.3 RZ切点两翼靶RNA的同源性分析 采用NCBI GeneBank(美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)对5株HCV(即HCV-H，HCV-1，HCV-J，HC-C2和HC-G1 GeneBank号分别为M67463，M62321，D90208，D10934和D14853)RZ切点两翼(7-8nt)的同源性进行分析，以预测RZ抗HCV病毒的“广谱”性.
, 百拇医药
2 结果
HCV-H株5’NCR和C区有915nt，其中“锤头结构”RZ的切点(GUX和CUX，X为A，C或U)共有124个. 计算机发现213，260，407和498四个切点比较理想，RZ与底物RNA相互作用的能级参数比较低(表1).
表1 抗HCV RZ的4个理论切点的计算机分析 RZ
切点
切点
碱基
碱基对
能 级 参 数
5’端
, 百拇医药 3’端
△Es'
△Er'
(△Er')*
△E
RZ1
213
CUC
7
7
4.2
6.0
2.8
, 百拇医药
-28.9
RZ2
260
GUA
7
7
5.5
1.3
-24.8
RZ3
407
GUC
8
, 百拇医药
7
4.1
12.2
5.5
-26.8
RZ4
498
CUU
8
7
2.0
10.9
6.7
, 百拇医药
-26.1
△Es' 底物从稳定态变为松弛态所需的能级参数；△Er' 核酶从稳定态变为松弛态所需的能级参数；△E 底物与核酶形成二级结构所需的结合能；*改变碱基后核酶从稳定态变为松弛态所需的能级参数.
2.1 RZ与靶切点两翼RNA作用的二级结构 上述切点及两翼RNA序列形成突出的半环状结构，切点暴露，对应的RZ二级结构显示锤头状，RZ与靶RNA切点两翼的碱基作用的二级结构模型(图1).
图1 RZ与靶切点两翼RNA作用的二级结构模式.
2.2 RZ切点两翼HCV基因的同源性 在选择有代表性的5株HCV-H,HCV-1,HCV-J,HC-C2和HC-G1中，切点213，260，407和498两翼RZ配对的碱基(7-8nt)完全一致. 说明以HCV-H为靶序列设计的以上RZ，有可能切割其他株HCV RNA.
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3 讨论
RZ作为抗病毒基因治疗的重要策略之一，近年来在抗肝炎病毒的研究方面引起了人们的极大兴趣. 已有研究表明，抗HBV表面抗原和核心抗原mRNA RZ，以及抗HCV 5’NCR和C区RZ可在无细胞和肝细胞内阻断病毒基因的表达和复制[2-4]. 然而对于目标RNA上切点的选择，RZ与靶RNA之间碱基配对长度的确定，以及RZ表达质粒的设计很大程度上仍然取决于研究者的经验. 许多研究表明，RZ切割效率的发挥，很大程度依赖于靶RNA切点的选择和RZ的设计. 选择理想的靶位点需要考虑[7]： ①靶位点所在的序列具有重要的生物学功能；②选择的位点及其周围序列具有高度保守性；③靶位点的易接近性. 我们选择的HCV 5’NCR和C在不同HCV株之间高度保守，对病毒的复制具有重要作用.
锤头结构RZ分子较小，设计简单，研究最多的抗病毒Rz. 目前Rz切点的选择和设计方法有RNAse H印迹法，RZ文库法，计算机辅助设计和以细胞为基础的设计筛选程序[7]. 我们选择了目前比较常用，也较为简单的计算机辅助设计，运用能量最低化原理，根据陆长德et al提出的Rz与底物相互作用模型，在HCV 5’NCR和C区选择了理论上最理想的4个切点，设计了4个锤头结构Rz，计算机模拟显示底物和Rz可形成理想的二级结构. 我们的结果表明，RZ 213，RZ 407和RZ 498经过改造，即锤头结构中的一个C换成G，△Er'明显变小. 5株HCV RZ切点两翼碱基(7-8nt)比较分析表明，同源性为100%. 提示该4个位点的RZ可能对其他4株也有切割作用.
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我们设计的Rz两端有XhoⅠ和BamHⅠ位点，以便插入pGEVE8459v3[8]带自剪切RZ的体外转录载体，然后进一步将带自剪切RZ的目的RZ插入可调控逆转录病毒载体(pBPSTR1)导入细胞，研究RZ在细胞内对HCV RNA的切割作用，以及调控剂对RZ表达和阻断效应的影响. 我们设计的4个RZ是否理想，能否在细胞内有效的发挥抗病毒作用还有待进一步体外实验和细胞内研究所证实. 虽然复杂的细胞内环境对RZ活性的影响因素很多，但应用计算机辅助设计，以减少底物和RZ本身结构对切割活性的影响，对RZ抗病毒作用的研究也是必不可少的步骤之一.
作者简介：贾战生，男，1959-03-30生，陕西省西安市人，汉族. 副主任医师，副教授. 1983年第四军医大学医疗系本科毕业，1989年第二军医大学硕士毕业，1995/1998年在导师周永兴教授的指导下从事病毒性肝炎基因治疗的研究，1998-07毕业，获医学博士学位，多年来从事移植免疫、抗肿瘤治疗、病毒性肝炎的免疫学和抗病毒基因治疗等研究，共发表论文30篇，获军队科技成果奖5项，参加编写肝硬变专业书一部.
, http://www.100md.com
*本课题获得全军医药卫生科研基金项目资助，No.98D048.
1998-11在全国第九届病毒性肝炎学术会议大会报告.
通讯作者 贾战生，710038，陕西省西安市第四军医大学唐都医院传染病防治中心.
*Supported by the Military Medicine and Health Science Foundation of China, No.98D048.
Correspondence to:JIA Zhan-Sheng, Tangdu Infectious Diseases Hospital, Fouth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Tel. +86.29.5377152
E-mail Jiazsh@fmmu. edu. cn
4 参考文献
[1] Okamato H, Mishiro S. Genetic heterogenity of hepatitis C virus. Intervirology, 1994;73:67-68
[2] 连建奇，周永兴，金由辛. 抗乙型肝炎病毒核酶自剪切体外转录载体的构建. 第四军医大学学报，1997；18:376-378
[3] Lieber A, He CY, Polyak SJ, Gretch DB, Kay MA. Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocyte by adenovirus-mediated expression of ribozymes. J Virol, 1996;70:8782-8791
, 百拇医药
[4] Sakamoto N, Wu CH, Wu GY. Intracellular cleavage of hepatitis C virus RNA and inhibition of viral protein translation by hammerhead ribozymes. J Clin Invest, 1996;89:2720-2728
[5] Grakoui A, Wychowski C, Lin Chao, Feinstone SM, Rice CM. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J Virol, 1993;67:1385-1395
[6] 陆长德，陈农安，祁国荣. 核酶对靶RNA体外切割反应的计算机分析. 生物化学与生物物理学报，1996；28:279-285
, http://www.100md.com
[7] 贾战生，连建奇，周永兴. 抗病毒核酶的设计和细胞内导入. 第四军医大学学报，1997；23：119-122
[8] Taira K, Nakagawa K, Nishikawa S. Construction of a novel RNA-transcript-trimming plasmid which can be used both in vitro in place of run-off and (G)-free trascriptions and in vivo as mμ lti-sequences trnscription vectors. Nucleic Acids Res, 1991;19:5125-5130
收稿日期 1998-09-11, 百拇医药