一氧化氮在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用
作者：陈玺华 李正中 鲍民生 郑绘霞
单位：山西医科大学第一医院普外科 山西省太原市 030001
关键词：一氧化氮/药理学；肝/病理学；局部缺血/药物疗法；再灌注损伤
世界华人消化杂志990406 摘 要
目的 探讨一氧化氮(nitric oxide, NO)在大鼠肝缺血再灌注(I/R)损伤中的作用.
方法 采用大鼠肝脏原位I/R模型，预先经伤寒菌内毒素脂多糖(LPS， 500μg/kg)处理，术前腹腔注射L-精氨酸(L-Arg，500mg/kg)或L-硝基精氨酸(L-NNA， 20mg/kg)分别观察分析血清NO，ALT,AST；肝组织NO、脂质过氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)以及肝组织病理损伤.
, http://www.100md.com
结果 经LPS预处理后引起肝脏NO的大量合成(NO，μmol/L，108±21 vs 25±6，P<0.01， μmol/g，0.809±0.125 vs 0.208±0.071，P<0.01). 肝脏经过20min缺血和30min再灌注后导致明显的肝损伤(ALT，nmol/s，7552±783 vs 1317±367，P<0.01，AST，nmol/s，6535±1867 vs 2417±867，P<0.01). 注射L-NNA后，抑制了NO合成，同时更进一步加重了肝损伤(ALT，nmol/s，19754±6385 vs 7552±783，P<0.01，AST，nmol/s，19937±5985 vs 6535±1867，P<0.01). 而施加L-Arg后，增加了NO合成(NO，μmol/L，266±76 vs 157±49，P<0.01， nmol/g，1.195±0.469 vs 0.745±0.261， P<0.05)，却没有加重肝损伤(ALT，nmol/s，5651±1717 vs 7552±783，P>0.05，AST，nmol/s，7802±948 vs 6535±1876，P>0.05). 另外，I/R组和NNA组肝组织SOD活性明显降低(SOD，KNU/g，6.8±0.8 vs 8.4±1.3，P<0.05；6.7±0.9 vs 8.4±1.3，P<0.05)，注射L-Arg后SOD活性恢复(SOD，KNU/g，8.5±0.6 vs 6.8±0.8，P<0.05).
, 百拇医药
结论 在LPS存在的情况下，NO在大鼠肝I/R损伤中呈现出保护作用，其机制是NO灭活了氧自由基. 但NO的作用似乎有双重性.
中国图书资料分类号 R975.5
Effect of nitric oxide on liver ischemia/reperfusion injury in rats in vivo
CHEN Xi-Hua1, LI Zheng-Zhong1, BAO Min-Sheng1 and ZHENG Hui-Xia2
1Department of General Surgery, and 2Pathology, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
, 百拇医药
Subject headings nitric oxide/pharmacology; liver/pathology; ischemia/drug therapy; reperfusion injury
Abstract
AIM To investigate the effects of nitric oxide (NO) on hepatic ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats in vivo.
METHODS With in situ hepatic I/R injury model, the rats were pretreated with S.typhimurium lipopolysaccharide (LPS, 500μg/kg) and then intraperitoneally injected with L-arginine (L-Arg, 500mg/kg) or NG-nitro-L-arginine (L-NNA, 20mg/kg) before operation. NO content, ALT, AST activities in serum, NO and LPO contents and SOD activity in liver tissue as well as hepatic pathology were observed and assayed.
, 百拇医药
RESULTS NO production by rat liver was induced in vivo by pretreatment with LPS (NO, μmol/L, 108±21 vs 25±6, P<0.01, μmol/g, 0.809±0.125 vs 0.208±0.071, P<0.01). Twenty min of ischemia and 30 min of reperfusion led to an increase in hepatic injury (ALT, nmol/s, 7552±783 vs 1317±367, P<0.01, AST, nmol/s, 6535±1867 vs 2417±867, P<0.01). Inhibition of NO synthesis with L-NNA decreased the LPS-induced increase in NO synthesis and markedly increased hepatic injury (ALT, nmol/s, 19754±6385 vs 7552±783, P<0.01, AST, nmol/s, 19 937±5985 vs 6535±1867, P<0.01). Elevation of NO (NO, μmol/L, 266±76 vs 157±49, P<0.01, nmol/g, 1.195±0.469 vs 0.745±0.261, P<0.05) synthesis with L-Arg showed no effects on hepatic injury (ALT, nmol/s, 5651±1717 vs 7552±783, P>0.05, AST, nmol/s, 7802±948 vs 6535±1876, P>0.05). SOD activity also decreased in the I/R and NNA groups (SOD, KNU/g, 6.8±0.8 vs 8.4±1.3, P<0.05, 6.7±0.9 vs 8.4±1.3, P<0.05), and the effect was ameliorated by the L-Arg (SOD, KNU/g, 8.5±0.6 vs 6.8±0.8, P<0.05).
, 百拇医药
CONCLUSION NO plays a protective role in hepatic I/R injury in rats during endotoxemia and this effect is mediated by superoxide anion inactivation. Its action seems to be double.
0 引言
一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种具有许多重要功能的亲脂性小分子物质，在体内受NO合酶(NO synthase, NOS)催化，由L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)的胍基氮原子与氧原子结合生成. 体内多种细胞如内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞、心肌细胞、枯氏细胞和肝细胞均可合成NO，它以细胞递质、信使或调节质的角色参与血液循环，神经传递、细胞分化、能量代谢、肝脏解毒等多种生理过程. 据报道NO参与了组织缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤，尤其在心肌I/R损伤中的研究较多，推测NO与肝脏I/R损伤中可能起重要作用，现探讨NO与肝脏I/R损伤之间的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ♂ Wistar大鼠，体重250g～300g，L-Arg及L-硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NNA)购自Sigma公司. 伤寒菌内毒素脂多糖(S.typhimurium lipopolysaccharide，LPS)由第二军医大学微生物教研室提供. ALT，AST药盒购于上海捷门生物技术公司. SOD药盒购于南京建成生物工程公司.
-1.2 方法 将动物随机分为5组，每组7只. ①Sham组；②LPS组：处死前8h腹腔注射LPS(500μg/kg)；③I/R组：在②的基础上肝脏缺血20min，再灌注30min；④Arg组：于术前8h和1h腹腔分别注射L-Arg(500mg/kg)，以后操作同③；⑤NNA组：于术前8h和1h腹腔分别注射L-NNA(20mg/kg)，以后操作同③. 实验前12h动物禁食，自由进水，按文献[1]方法，实验结束后，腹主动脉采血测NO，ALT，AST，取肝组织约1mm×1mm×1mm，20g/L戊二醛固定，2h后更换磷酸盐缓冲液，制样电镜观察. 另取左后叶肝脏，100g/L甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色. 剩余肝脏速置-30℃冰箱保存，待制匀浆测肝组织NO，超氧化物歧化酶(SOD)及脂质过氧化物(LPO). ALT，AST及SOD测定均依照说明书操作，LPO用改良八木国夫法，NO用镀铜镉还原法[2].
, 百拇医药
统计学处理 结果以
±s表示，并用SAS软件的单因素方差分析在微机上处理，均数间的两两比较用Q检验.
2 结果
2.1 ALT，AST变化 LPS组ALT，AST活性高于Sham组(P<0.01)；I/R组则显著高于LPS组(P<0.01)；NNA组ALT，AST活性升高更加明显，达峰值，与I/R组差异显著(P<0.01)；Arg组两种转氨酶活性与I/R组之间无差异(表1).
表1 各组血清NO含量及ALT，AST活性 (n=7，±s) 组别
ALT(nmol/s)
, 百拇医药
AST(nmol/s)
NO(μmol/L)
Sham
567±233
1000±217
25±6
LPS
1317±367b
2417±867b
108±21b
I/R
, http://www.100md.com 7552±783d
6535±1867d
157±49
Arg
5651±1717
7802±984
266±76f
NNA
19754±6385f
19937±5985f
130±28
, http://www.100md.com
bP<0.01, vs Sham组；dP<0.01, vs LPS组；fP<0.01, vs I/R组.
2.2 NO变化 LPS组血、肝组织NO较Sham组明显升高(P<0.01)；I/R组与LPS组之间无差异；Arg组血、肝组织NO达最高峰值，与I/R组有明显差异(P<0.01，P<0.05)；NNA组血NO绝对值降低，但与I/R组无差异(表1，2).
2.3 肝组织SOD和LPO变化 I/R组SOD活性明显低于LPS组和Sham组(P<0.05)；Arg组SOD活性恢复，显著高于I/R组(P<0.05)；NNA组SOD活性低于LPS组和Sham组，与I/R组无差异. LPO含量Arg组明显高于LPS组及Sham组(P<0.05)，与I/R组无统计学差异(表2).
表2 各组肝组织NO，LPO含量及SOD活性 (n=7，±s) 组别
, 百拇医药
NO(μmol/g)
LPO(μmol/g)
SOD(KNU/g)
Sham
0.208±0.071
0.385±0.010
8.4±1.8
LPS
0.809±0.125b
0.382±0.035
8.4±1.3
, 百拇医药 I/R
0.745±0.261
0.414±0.037
6.8±0.8a
Arg
1.195±0.469e
0.478±0.068bd
8.5±0.6e
NNA
0.794±0.412
0.437±0.065
, 百拇医药
6.7±0.9a
aP<0.05,bP<0.01, vs Sham组；dP<0.01, vs LPS组；eP<0.05, vs I/R组.
2.4 病理形态学变化 术中可见Sham组肝脏正常，光亮红润；LPS组呈暗褐色，缺血后肝脏呈灰白色，再灌注后色泽深红，并可见红白相间花斑；NNA组花斑更加明显，并可见深紫褐色斑片；Arg组病变基本同I/R组. 光镜下，Sham组肝细胞正常；LPS组肝窦轻度扩张，有大量RBC瘀积其内并有微血栓形成；I/R组近汇管区肝细胞水肿，呈轻度空泡状，肝窦扩张；NNA组整个肝小叶的肝细胞水肿，空泡明显加重，呈气球样变；Arg组变化同I/R组. 电镜下，Sham组肝细胞器分布均匀，线粒体正常，I/R组可见线粒体肿胀，嵴存在；NNA组线粒体明显肿胀呈空泡状，嵴疏松断裂，并可见线粒体破坏；Arg组线粒体肿胀，嵴无疏松及空泡样变.
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3 讨论
近年来研究发现，NO可能在介导组织损伤中起重要作用. 在I/R损伤中的作用目前仍不清楚，一些研究表明，NO作为一种血管扩张剂在长时间缺血中起保护作用，其他文献表明NO引发了I/R损伤. 在肝组织中，肝细胞、枯氏细胞及窦内皮细胞均可生成NO，内毒素(endotoxin, ET)是刺激NO生成的主要激动剂[3]. 细胞因子如IL-1，TNF-α，IFN-γ均可刺激NO生成，特别是与LPS共同作用时，肝组织生成NO量最大. 本实验可见LPS组血、肝组织NO，ALT，AST均高于Sham组，说明LPS诱发肝脏产生了大量NO，同时引发了轻度的ET性肝损害. I/R组转氨酶活性进一步升高，肝细胞轻度水肿，线粒体肿胀，可见I/R导致了肝损伤. 有资料表明，在正常情况下，体内有足够的L-Arg供合成NO，增加L-Arg并不能增加NO的产生，但在I/R、缺氧等情况下，机体利用L-Arg的能力下降，NO合成量减少[4]，此时增加L-Arg可增加NO的合成而发挥作用[5]. 本实验可见I/R组血、肝组织NO与LPS无统计学差异，这极可能是因为I/R后，肝脏利用L-Arg能力下降所致. 当施加L-Arg后，NO明显升高，转氨酶活性未升高，光镜、电镜形态学观察与I/R组无明显变化. 而注射非选择性NOS抑制剂L-NNA后，NO合成受抑，ALT，AST活性急剧增高达峰值；肉眼见肝脏花斑更趋严重；光镜下肝细胞水肿加重呈空泡样；电镜显示线粒体肿胀加剧并伴破坏，嵴紊乱消失并呈空泡样变. 实验表明，增加NO合成没有加重肝损伤，而抑制NO合成却加重了肝损伤. 可见，在LPS存在的情况下，NO在大鼠肝脏I/R损伤中起保护作用. 这可能是因为NO作为一种内源性舒张因子保护肝组织免受缺血性损伤；也可能是因为NO抑制了中性粒细胞与内皮细胞的粘附和血小板的聚集；还可能是因为NO灭活了氧自由基[6]. 本实验可见，I/R后肝组织SOD活性明显下降，说明I/R抑制了肝组织SOD活性，使O-2灭活减少，从而引起肝细胞损伤. 注射L-NNA后SOD活性无恢复，应用L-Arg后SOD活性增高，说明NO参与了氧自由基的灭活，从而缓解了肝损伤.
, 百拇医药
值得注意的是，应用L-Arg后，NO合成增加，转氨酶活性较I/R组无明显下降，病理变化较I/R组无明显好转，加之肝组织LPO含量在各组中最高，虽与I/R组无统计学意义，但提示我们NO在大鼠肝I/R损伤中似乎有双重作用[7]. 实验中我们之所以应用少量LPS，首先因为正常情况下门静脉血就含有一定量的LPS；其次在行伴阻塞性黄疸(OJ)的肝脏肿瘤切除时，OJ使肠道ET池扩大，细菌及ET易位，引起严重的内毒素血症(ETM)；第三，肝硬变肝脏手术时，由于门腔侧支循环开放，胃肠道ET直接进入体循环，同时肝脏灭活ET能力下降，致使血中ET升高；第四，肝脏移植时，许多保存时间较长的肝脏含有较高水平的LPS和细胞因子. 我们认为，在研究肝脏I/R损伤时，应充分考虑到ET的存在及作用. Esteban et al[8]认为肝脏I/R损伤与NO及强烈的炎性递质密切相关.
总之，探明NO在肝I/R损伤中的作用机制，充分发挥其保护作用，消除或减轻其损伤作用，甚至发展药物来预防肝I/R损伤，将有广泛的临床应用前景. 但也要注意，NO毕竟有毒性，L-NNA的生物效应也并非限于对NOS的阻断[9].
, 百拇医药
作者简介：
陈玺华，男，1962-05-23生，内蒙古卓资县人，汉族. 1981年山西大同医专毕业，1997年山西医科大学硕士研究生毕业，主治医师，主要从 事消化系统疾病的病理生理及临床研究，发表论文5篇.
通讯作者 陈玺华，030001，山西省太原市，山西医科大学第一医院普外科.
Correspondence to:Dr. CHEN Xi-Hua, Department of General Surgery, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Tel. +86.351.6126736, Fax. +86.351.6126736
, 百拇医药
4 参考文献
[1] 陈玺华，李正中，鲍民生. 缺血预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护. 新消化病学杂志，1997；5：763-764
[2] 王斌，俞红，周霞秋. 急性肝坏死大鼠NO水平的动态变化和作用. 华人消化杂志，1998；6：499-501
[3] 汪义军，李宁，吴性江，黎介寿. 肝硬变患者血清一氧化氮和细胞因子检测及其临床意义. 华人消化杂志，1998；6：543
[4] Tsao PS, Aoki N, Lefer DJ. Time course of endothelial dysfunction and myocardial injury during myocardial ischemia and reperfusion in the cat. Circulation, 1990;80:1402-1409
, 百拇医药
[5] Weyrich AS, Ma XL, Lefer AM. The role of L-arginine in ameliorating reperfusion injury after myocardial ischemia in the cat. Circulation, 1992;86:279-288
[6] Ma TT, Ischiropoulos H, Brass CA. Endotoxin-stimulated nitric oxide production increases injury and reduces rat liver chemiluminescene during reperfusion. Gastroenterology, 1995;108:463-469
[7] 王根生，刘耕陶. 一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用. 中华医学杂志，1996；76：203-205
[8] Esteban F, Gomez-Jimenez J, Martin MC. Nitric oxide and hepatic ischemic injury in human orthotopic liver transplantation. Transplantation Proc, 1995;27:2283-2285
[9] 孙长凯，鞠躬，王栋，王多宁. 一氧化氮研究的几个基本问题. 中华医学杂志，1996；76：626-628
收稿日期 1998-01-20, 百拇医药
单位：山西医科大学第一医院普外科 山西省太原市 030001
关键词：一氧化氮/药理学；肝/病理学；局部缺血/药物疗法；再灌注损伤
世界华人消化杂志990406 摘 要
目的 探讨一氧化氮(nitric oxide, NO)在大鼠肝缺血再灌注(I/R)损伤中的作用.
方法 采用大鼠肝脏原位I/R模型，预先经伤寒菌内毒素脂多糖(LPS， 500μg/kg)处理，术前腹腔注射L-精氨酸(L-Arg，500mg/kg)或L-硝基精氨酸(L-NNA， 20mg/kg)分别观察分析血清NO，ALT,AST；肝组织NO、脂质过氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)以及肝组织病理损伤.
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结果 经LPS预处理后引起肝脏NO的大量合成(NO，μmol/L，108±21 vs 25±6，P<0.01， μmol/g，0.809±0.125 vs 0.208±0.071，P<0.01). 肝脏经过20min缺血和30min再灌注后导致明显的肝损伤(ALT，nmol/s，7552±783 vs 1317±367，P<0.01，AST，nmol/s，6535±1867 vs 2417±867，P<0.01). 注射L-NNA后，抑制了NO合成，同时更进一步加重了肝损伤(ALT，nmol/s，19754±6385 vs 7552±783，P<0.01，AST，nmol/s，19937±5985 vs 6535±1867，P<0.01). 而施加L-Arg后，增加了NO合成(NO，μmol/L，266±76 vs 157±49，P<0.01， nmol/g，1.195±0.469 vs 0.745±0.261， P<0.05)，却没有加重肝损伤(ALT，nmol/s，5651±1717 vs 7552±783，P>0.05，AST，nmol/s，7802±948 vs 6535±1876，P>0.05). 另外，I/R组和NNA组肝组织SOD活性明显降低(SOD，KNU/g，6.8±0.8 vs 8.4±1.3，P<0.05；6.7±0.9 vs 8.4±1.3，P<0.05)，注射L-Arg后SOD活性恢复(SOD，KNU/g，8.5±0.6 vs 6.8±0.8，P<0.05).
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结论 在LPS存在的情况下，NO在大鼠肝I/R损伤中呈现出保护作用，其机制是NO灭活了氧自由基. 但NO的作用似乎有双重性.
中国图书资料分类号 R975.5
Effect of nitric oxide on liver ischemia/reperfusion injury in rats in vivo
CHEN Xi-Hua1, LI Zheng-Zhong1, BAO Min-Sheng1 and ZHENG Hui-Xia2
1Department of General Surgery, and 2Pathology, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
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Subject headings nitric oxide/pharmacology; liver/pathology; ischemia/drug therapy; reperfusion injury
Abstract
AIM To investigate the effects of nitric oxide (NO) on hepatic ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats in vivo.
METHODS With in situ hepatic I/R injury model, the rats were pretreated with S.typhimurium lipopolysaccharide (LPS, 500μg/kg) and then intraperitoneally injected with L-arginine (L-Arg, 500mg/kg) or NG-nitro-L-arginine (L-NNA, 20mg/kg) before operation. NO content, ALT, AST activities in serum, NO and LPO contents and SOD activity in liver tissue as well as hepatic pathology were observed and assayed.
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RESULTS NO production by rat liver was induced in vivo by pretreatment with LPS (NO, μmol/L, 108±21 vs 25±6, P<0.01, μmol/g, 0.809±0.125 vs 0.208±0.071, P<0.01). Twenty min of ischemia and 30 min of reperfusion led to an increase in hepatic injury (ALT, nmol/s, 7552±783 vs 1317±367, P<0.01, AST, nmol/s, 6535±1867 vs 2417±867, P<0.01). Inhibition of NO synthesis with L-NNA decreased the LPS-induced increase in NO synthesis and markedly increased hepatic injury (ALT, nmol/s, 19754±6385 vs 7552±783, P<0.01, AST, nmol/s, 19 937±5985 vs 6535±1867, P<0.01). Elevation of NO (NO, μmol/L, 266±76 vs 157±49, P<0.01, nmol/g, 1.195±0.469 vs 0.745±0.261, P<0.05) synthesis with L-Arg showed no effects on hepatic injury (ALT, nmol/s, 5651±1717 vs 7552±783, P>0.05, AST, nmol/s, 7802±948 vs 6535±1876, P>0.05). SOD activity also decreased in the I/R and NNA groups (SOD, KNU/g, 6.8±0.8 vs 8.4±1.3, P<0.05, 6.7±0.9 vs 8.4±1.3, P<0.05), and the effect was ameliorated by the L-Arg (SOD, KNU/g, 8.5±0.6 vs 6.8±0.8, P<0.05).
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CONCLUSION NO plays a protective role in hepatic I/R injury in rats during endotoxemia and this effect is mediated by superoxide anion inactivation. Its action seems to be double.
0 引言
一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种具有许多重要功能的亲脂性小分子物质，在体内受NO合酶(NO synthase, NOS)催化，由L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)的胍基氮原子与氧原子结合生成. 体内多种细胞如内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞、心肌细胞、枯氏细胞和肝细胞均可合成NO，它以细胞递质、信使或调节质的角色参与血液循环，神经传递、细胞分化、能量代谢、肝脏解毒等多种生理过程. 据报道NO参与了组织缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤，尤其在心肌I/R损伤中的研究较多，推测NO与肝脏I/R损伤中可能起重要作用，现探讨NO与肝脏I/R损伤之间的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 ♂ Wistar大鼠，体重250g～300g，L-Arg及L-硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NNA)购自Sigma公司. 伤寒菌内毒素脂多糖(S.typhimurium lipopolysaccharide，LPS)由第二军医大学微生物教研室提供. ALT，AST药盒购于上海捷门生物技术公司. SOD药盒购于南京建成生物工程公司.
-1.2 方法 将动物随机分为5组，每组7只. ①Sham组；②LPS组：处死前8h腹腔注射LPS(500μg/kg)；③I/R组：在②的基础上肝脏缺血20min，再灌注30min；④Arg组：于术前8h和1h腹腔分别注射L-Arg(500mg/kg)，以后操作同③；⑤NNA组：于术前8h和1h腹腔分别注射L-NNA(20mg/kg)，以后操作同③. 实验前12h动物禁食，自由进水，按文献[1]方法，实验结束后，腹主动脉采血测NO，ALT，AST，取肝组织约1mm×1mm×1mm，20g/L戊二醛固定，2h后更换磷酸盐缓冲液，制样电镜观察. 另取左后叶肝脏，100g/L甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色. 剩余肝脏速置-30℃冰箱保存，待制匀浆测肝组织NO，超氧化物歧化酶(SOD)及脂质过氧化物(LPO). ALT，AST及SOD测定均依照说明书操作，LPO用改良八木国夫法，NO用镀铜镉还原法[2].
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统计学处理 结果以
±s表示，并用SAS软件的单因素方差分析在微机上处理，均数间的两两比较用Q检验.2 结果
2.1 ALT，AST变化 LPS组ALT，AST活性高于Sham组(P<0.01)；I/R组则显著高于LPS组(P<0.01)；NNA组ALT，AST活性升高更加明显，达峰值，与I/R组差异显著(P<0.01)；Arg组两种转氨酶活性与I/R组之间无差异(表1).
表1 各组血清NO含量及ALT，AST活性 (n=7，
±s) 组别ALT(nmol/s)
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AST(nmol/s)
NO(μmol/L)
Sham
567±233
1000±217
25±6
LPS
1317±367b
2417±867b
108±21b
I/R
, http://www.100md.com 7552±783d
6535±1867d
157±49
Arg
5651±1717
7802±984
266±76f
NNA
19754±6385f
19937±5985f
130±28
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bP<0.01, vs Sham组；dP<0.01, vs LPS组；fP<0.01, vs I/R组.
2.2 NO变化 LPS组血、肝组织NO较Sham组明显升高(P<0.01)；I/R组与LPS组之间无差异；Arg组血、肝组织NO达最高峰值，与I/R组有明显差异(P<0.01，P<0.05)；NNA组血NO绝对值降低，但与I/R组无差异(表1，2).
2.3 肝组织SOD和LPO变化 I/R组SOD活性明显低于LPS组和Sham组(P<0.05)；Arg组SOD活性恢复，显著高于I/R组(P<0.05)；NNA组SOD活性低于LPS组和Sham组，与I/R组无差异. LPO含量Arg组明显高于LPS组及Sham组(P<0.05)，与I/R组无统计学差异(表2).
表2 各组肝组织NO，LPO含量及SOD活性 (n=7，
±s) 组别, 百拇医药
NO(μmol/g)
LPO(μmol/g)
SOD(KNU/g)
Sham
0.208±0.071
0.385±0.010
8.4±1.8
LPS
0.809±0.125b
0.382±0.035
8.4±1.3
, 百拇医药 I/R
0.745±0.261
0.414±0.037
6.8±0.8a
Arg
1.195±0.469e
0.478±0.068bd
8.5±0.6e
NNA
0.794±0.412
0.437±0.065
, 百拇医药
6.7±0.9a
aP<0.05,bP<0.01, vs Sham组；dP<0.01, vs LPS组；eP<0.05, vs I/R组.
2.4 病理形态学变化 术中可见Sham组肝脏正常，光亮红润；LPS组呈暗褐色，缺血后肝脏呈灰白色，再灌注后色泽深红，并可见红白相间花斑；NNA组花斑更加明显，并可见深紫褐色斑片；Arg组病变基本同I/R组. 光镜下，Sham组肝细胞正常；LPS组肝窦轻度扩张，有大量RBC瘀积其内并有微血栓形成；I/R组近汇管区肝细胞水肿，呈轻度空泡状，肝窦扩张；NNA组整个肝小叶的肝细胞水肿，空泡明显加重，呈气球样变；Arg组变化同I/R组. 电镜下，Sham组肝细胞器分布均匀，线粒体正常，I/R组可见线粒体肿胀，嵴存在；NNA组线粒体明显肿胀呈空泡状，嵴疏松断裂，并可见线粒体破坏；Arg组线粒体肿胀，嵴无疏松及空泡样变.
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3 讨论
近年来研究发现，NO可能在介导组织损伤中起重要作用. 在I/R损伤中的作用目前仍不清楚，一些研究表明，NO作为一种血管扩张剂在长时间缺血中起保护作用，其他文献表明NO引发了I/R损伤. 在肝组织中，肝细胞、枯氏细胞及窦内皮细胞均可生成NO，内毒素(endotoxin, ET)是刺激NO生成的主要激动剂[3]. 细胞因子如IL-1，TNF-α，IFN-γ均可刺激NO生成，特别是与LPS共同作用时，肝组织生成NO量最大. 本实验可见LPS组血、肝组织NO，ALT，AST均高于Sham组，说明LPS诱发肝脏产生了大量NO，同时引发了轻度的ET性肝损害. I/R组转氨酶活性进一步升高，肝细胞轻度水肿，线粒体肿胀，可见I/R导致了肝损伤. 有资料表明，在正常情况下，体内有足够的L-Arg供合成NO，增加L-Arg并不能增加NO的产生，但在I/R、缺氧等情况下，机体利用L-Arg的能力下降，NO合成量减少[4]，此时增加L-Arg可增加NO的合成而发挥作用[5]. 本实验可见I/R组血、肝组织NO与LPS无统计学差异，这极可能是因为I/R后，肝脏利用L-Arg能力下降所致. 当施加L-Arg后，NO明显升高，转氨酶活性未升高，光镜、电镜形态学观察与I/R组无明显变化. 而注射非选择性NOS抑制剂L-NNA后，NO合成受抑，ALT，AST活性急剧增高达峰值；肉眼见肝脏花斑更趋严重；光镜下肝细胞水肿加重呈空泡样；电镜显示线粒体肿胀加剧并伴破坏，嵴紊乱消失并呈空泡样变. 实验表明，增加NO合成没有加重肝损伤，而抑制NO合成却加重了肝损伤. 可见，在LPS存在的情况下，NO在大鼠肝脏I/R损伤中起保护作用. 这可能是因为NO作为一种内源性舒张因子保护肝组织免受缺血性损伤；也可能是因为NO抑制了中性粒细胞与内皮细胞的粘附和血小板的聚集；还可能是因为NO灭活了氧自由基[6]. 本实验可见，I/R后肝组织SOD活性明显下降，说明I/R抑制了肝组织SOD活性，使O-2灭活减少，从而引起肝细胞损伤. 注射L-NNA后SOD活性无恢复，应用L-Arg后SOD活性增高，说明NO参与了氧自由基的灭活，从而缓解了肝损伤.
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值得注意的是，应用L-Arg后，NO合成增加，转氨酶活性较I/R组无明显下降，病理变化较I/R组无明显好转，加之肝组织LPO含量在各组中最高，虽与I/R组无统计学意义，但提示我们NO在大鼠肝I/R损伤中似乎有双重作用[7]. 实验中我们之所以应用少量LPS，首先因为正常情况下门静脉血就含有一定量的LPS；其次在行伴阻塞性黄疸(OJ)的肝脏肿瘤切除时，OJ使肠道ET池扩大，细菌及ET易位，引起严重的内毒素血症(ETM)；第三，肝硬变肝脏手术时，由于门腔侧支循环开放，胃肠道ET直接进入体循环，同时肝脏灭活ET能力下降，致使血中ET升高；第四，肝脏移植时，许多保存时间较长的肝脏含有较高水平的LPS和细胞因子. 我们认为，在研究肝脏I/R损伤时，应充分考虑到ET的存在及作用. Esteban et al[8]认为肝脏I/R损伤与NO及强烈的炎性递质密切相关.
总之，探明NO在肝I/R损伤中的作用机制，充分发挥其保护作用，消除或减轻其损伤作用，甚至发展药物来预防肝I/R损伤，将有广泛的临床应用前景. 但也要注意，NO毕竟有毒性，L-NNA的生物效应也并非限于对NOS的阻断[9].
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作者简介：
陈玺华，男，1962-05-23生，内蒙古卓资县人，汉族. 1981年山西大同医专毕业，1997年山西医科大学硕士研究生毕业，主治医师，主要从 事消化系统疾病的病理生理及临床研究，发表论文5篇.
通讯作者 陈玺华，030001，山西省太原市，山西医科大学第一医院普外科.
Correspondence to:Dr. CHEN Xi-Hua, Department of General Surgery, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Tel. +86.351.6126736, Fax. +86.351.6126736
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4 参考文献
[1] 陈玺华，李正中，鲍民生. 缺血预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护. 新消化病学杂志，1997；5：763-764
[2] 王斌，俞红，周霞秋. 急性肝坏死大鼠NO水平的动态变化和作用. 华人消化杂志，1998；6：499-501
[3] 汪义军，李宁，吴性江，黎介寿. 肝硬变患者血清一氧化氮和细胞因子检测及其临床意义. 华人消化杂志，1998；6：543
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收稿日期 1998-01-20, 百拇医药