肝癌抑制基因治疗的研究现状
作者：孟照华 何振平
单位：济南军区总医院普外科 山东省济南市 250031
关键词：肝肿瘤/治疗；癌，肝细胞/治疗；基因治疗
世界华人消化杂志990424
Subject headings liver neoplasms/therapy; carcinoma, hepatocellular/therapy; gene therapy
中国图书资料分类号 R735.7
肝癌是严重危害人们生命与健康的一种常见的恶性肿瘤，若不予治疗自症状出现至死亡平均生存期仅4mo[1]，1995年国家卫生部统计肝癌死亡率占肿瘤死亡率的第二位[2]. 因此，努力提高肝癌诊治水平已成为本专业的当务之急. 进入本世纪90年代以来分子生物学的研究进展，已为提高肝癌诊治水平带来新的曙光，肝癌的治疗研究业已进入到基因水平并取得了较大进展，现简略综述如下.
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1 癌抑制基因治疗的种类与选择
目前通常所说抗癌基因亦称抑癌基因、肿瘤抑制基因、肿瘤易感基因、隐性癌基因等，本文统称为肝癌抑制基因，1997-11-20在美国加州圣地亚哥市召开的第六届国际肿瘤基因治疗会议(Sixth intermational confermce on Gene Therapy of cancer)，会议将肿瘤抑制基因划分为反义基因治疗、载体系统、造血干细胞基因转染治疗、自杀基因治疗、免疫基因治疗即5种类型.
1.1 反义基因治疗 反义基因是根据肝癌发病原因，导入反义寡核苷酸封闭肝癌基因的表达或用正常抑癌基因取代突变抑癌基因. 研究证明肿瘤的发生是多基因参与的多步骤过程，使与肿瘤相关的多种癌基因和突变的抑癌基因及其转录产物都可作为反义分子(DNA，RNA)的作用靶点. 国内较早报道含人N-ras cDNA反义密码顺序的RVV对人肝癌细胞系PKC/PPF/5的生长有明显的抑制作用，并伴有ras基因表达产物下降，荷人肝癌LRNM4的裸鼠肿瘤生长也受含N-ras cDNA反义密码顺序的RVV抑制. 黄贤明et al[3]构建了一个能表达c-ets-2, c-myc及N-ras三个癌基因联合反义RNA的重组RVV，转导人肝癌细胞系7721后，检测到联合反义RNA表达，并使细胞生长速度下降70%，软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力下降. 有人将可与鼠肝癌基因结合的肝脂肪酸糖蛋白L-FABP转染鼠肝癌细胞株，在亚油酸的剌激下，转染的细胞克隆表达的L-FABP通过亚油酸的氧合代谢抑制了肝癌的生长.
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另外，与肿瘤恶性表型相关的细胞生长因子及受体亦可作为反义基因治疗的靶点. TGFα在肝脏超表达使肝细胞大量繁殖从而诱发肝癌，用RVV将TGFα反义RNA转染到大鼠，表达反义TGFαRNA的细胞生长受到明显的抑制. 通常表达4种成纤维细胞生长因子2(FGF-2)蛋白的人肝癌细胞SK-HEPL转导产生靶向人FGF-2mRNA不同位点的反义RNAs的表达载体后，FGF-2合成比对照组显著下降，细胞软琼脂集落形成率及裸鼠体内成瘤率无降低，且这一作用不能被外源性FGF-2所逆转[4]. 携带功能性胰岛素样生长因子(IGF)受体的肝癌细胞能通过内生性IGF-1的合成促进自身的生长，增强无限生长能力的维持表型. 用定位表达IGF-IRcDNA反义分子的质粒载体转染H-59肝癌细胞后观察，被转染的细胞丢失IGF-1应答能力，此质粒注射体内后肝的微循环系数、肺和其他部位的转移瘤形成率均显著降低. 试验表明此方法治疗是有效的[5]. 研究认为肝癌的反义基因治疗同样也受到限制；因为不同的肝癌细胞其抑癌基因的突变谱及癌基因激活的程度和方式不可能一致性，相关生长因子的自分泌及受体表达也同样不同，目前尚难以发现一种广为适用的反义基因治疗方法，加上反义核酸对靶基因结合的位点特异性差及易被分解、灭活等问题，因而使本方法停留在对某一种和几种肝癌细胞系的实验研究阶段.
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1.2 载体系统 载体系统包括两类：一类是病毒载体(逆转录病毒载体和腺病毒载体)；另一类是非病毒载体，如阳离子脂质体等. 目前转基因治疗常用的载体，是逆转录病毒和腺病毒，这两种转基因载体各有其特点. 将自杀基因转导至肿瘤靶细胞所用的载体是自杀基因疗法能付诸于临床的一项关键技术. 肝癌自杀基因疗法中首先采用的是重组逆转录病毒载体. 逆转录病毒能携带外源基因整合到靶细胞基因组，实现目的基因持久稳定表达是其能成为首选目标的一个主要原因. 1991年Huber et al[6]首先采用逆转录病毒载体携带AFP/VZV-TK嵌合基因转染人肝癌细胞并联合araM治疗，达到了特异杀伤肝癌细胞的目的. Caruso et al[7]将HSV1-TK基因采用逆转录病毒包装细胞原位转导大鼠实验性肝转移癌，给予GCV后，肿瘤体积明显缩小，动物生存期延长，同时观察到旁观者效应和大量CD4+，CD8+淋巴细胞在瘤周浸润. Ido et al[8]将AFP/HSV-TK嵌合基因插入到重组逆转录病毒载体，构建成LNAF0.3TK并转染肝癌细胞，能特异性地杀伤分泌AFP的肝癌细胞.
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由于逆转录病毒载体只能转染正在分裂细胞，有插入致突变和激活癌基因的危险，因in vivc应用肝癌细胞低表达，故不适合直接体内基因转导[9]. 而重组腺病毒载体由于能产生更高的病毒滴度及在体内外对肝癌细胞有较高的转染效率[10]，近年来备受重视. Qian et al[11]应用重组腺病毒载体携带HSV-TK(Ad-cmvtk),转染肝癌细胞系HEP3B，plc/PRF/5，HEPG2,使TK基因成功表达，诱导出肝癌细胞对GCV的敏感性，且只需将10%的瘤细胞导入TK基因即可观察到旁观者效应，显示了腺病毒载体是将药物敏感基因转导肝癌细胞的有效载体. Kaneko et al[12]分别采用腺病毒载体介导AFP/HSV-TK基因转染肝癌细胞，均获得特异性表达. Kwong et al[13]将MOD细胞植入到动物肝脏，建立乳腺癌肝转移模型，然后采用腺病毒介导HSV-TK基因治疗，使得肝转移灶明显消退，动物生存期延长，显示了腺病毒载体在转移性肝癌自杀基因疗法中的价值. 但是腺病毒载体存着不能整合到靶细胞染色体、且不能长期稳定表达、转染靶细胞后产生免疫反应从而降低转染效率和限制重复应用及对肝细胞有损伤作用[14]等缺点. 因此，基因治疗载体应要求具有低毒、高效、大容量、可控基因转导及表达等特点. 到目前为止，尚无一种病毒载体能同时满足上述要求，需进一步加强对病毒载体的研究.
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另外非病毒类载体如脂质体在肝癌自杀基因治疗研究中也有报道. Ghoumari et al[15]运用脂质体携带含有HSV-TK基因的质粒分别转染鼠和人肝癌细胞系HEP1-6，HEPG2，结果显示携带双拷贝HSV-TK基因肪质体转染的肝癌细胞对GCV的敏感性要明显高于携带单拷贝者. 肪质体介导的基因转移方法具有简便、安全、可携带较大DNA分子等优点，但其转染效率低，缺乏细胞特异性，应用也受到限制. 应加强对其稳定性、靶向性和提高转染效率的研究.
1.3 基因转染治疗 肝癌抑制基因治疗尤其是自杀基因疗法、基因转染及表达的靶向性关系到治疗的高效性和是否对正常机体组织产生损害. Drazan et al[16]以腺病毒为载体经门静脉灌注将野生型p53基因转染部分肝脏切除后的大鼠肝脏，结果转染前后肝脏生理功能未见异常改变. 在靶向性转导方面，逆转录病毒只感染分裂细胞的特性使其所转导的细胞具有相对特异性，这对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适. 但是系统应用pin vivo法则对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛组织产生致死性杀伤作用，有产生与放、化疗相似副作用的危险性. Bookstein et al[17]建立了肝肿瘤原位p53基因转导方法，有效的抑制了肝癌生长及大肠癌肝转移形成. 腺病毒载体虽可因肝脏有丰富腺病毒受体而静脉注射时大量(可达90%)集中在肝脏组织，但由于腺病毒对分裂及静息细胞均有感染性，同样也达不到肝癌组织靶向性转导的目的. 于是研究者们更多地把目光投向自杀基因在肝癌组织靶向性表达方面. 即将自杀基因置于肝癌特异性转录调控序列(TRS)之下，以达到使自杀基因在肝癌组织特异性表达的目的. 目前研究较多的是AFP启动子/增强子. AFP基因上游5.1kb内的顺式调控元件含有多个增强子和沉寂子，即0.3kb的增强子A和0.4kb的增强子B及两个沉寂子SD(distal silencer),SP(proximal silencer)[18]，它们对调控的目的基因能在AFP阳性的肝癌细胞中特异性表达，而在AFP阴性的肝癌细胞及非肝癌细胞中不能表达或低表达.
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采用逆转录病毒载体转导自杀基因在对肝癌细胞靶向性表达的研究中，Huber et al[6]将VZV-TK基因置于5.1kb的AFP基因上游转录调控区之下，Macri et al[19]采用的是7.6kb的小鼠AFP基因5'翼序列与HSV-TK基因相连，均达到了使自杀基因在分泌AFP的肝癌中表达的目的. Ido et al[8]则采用了0.3kb的AFP启动子调控HSV-TK基因特异性表达，同时观察到添加地塞米松可通过AFP启动子的糖皮质激素反应元件来调节TK基因表达并增强acyclovir的杀细胞作用.
在腺病毒载体转导方面，Kaneko et al[12]采用的是4.9kb的人类AFP启动子，Kanai et al[20]构建了1.1kb的人类AFP启动子来调控HSV -TK基因特异性表达，使得AFP阳性的肝癌细胞系HUH7,HEPG2获得对GCV的敏感性而被杀死. Kanai还将AFP启动子增强子序列与EC-CD基因相连，运用重组腺病毒载体转染肝癌细胞，在体内外实验中均能特异性地使CD基因在AFP阳性的肝癌细胞中表达，使产生的5-FU发挥特异性杀伤作用.
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1.4 自杀基因治疗 将某些细菌及病毒中特有的自杀基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类将原来无毒性的抗病毒药物或化疗药物前体代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为“自杀基因”. 此基因是目前较为有效并具有临床应用前景的基因疗法.
Huber et al[6]最早构建了水痘一带状疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(VZVTK)基因及甲胎蛋白(AFP)转录调节序列组成的嵌合基因，并经RVV选择性转导入肝癌细胞，使无毒性的药物前体6-甲氧嘌呤阿拉伯核苷(AraM)在肝癌细胞内VZV-TK酶的作用下代谢成毒性产物腺嘌呤阿拉伯核苷三磷酸并将肿瘤细胞杀伤. Caruso et al[7]构建了单纯疱疹病毒Ⅰ型TK(HSV-I-TK)基因并经RVV直接注射大鼠实验性肝肿瘤完成了HSV-I-TK基因的原位转导，被转导的肿瘤细胞产生TK酶将与核苷结构类似的无毒性抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)代谢成毒性产物并将肿瘤细胞杀伤，使肿瘤体积显著缩小，生存期延长. 磷酸化的GCV或被其杀伤的肿瘤细胞所释放的凋亡小体在癌细胞间传递可使未转导TK基因的肿瘤细胞也被杀伤，产生旁观者效应. 转导TK基因的肿瘤细胞可增强局部免疫反应，肿瘤组织被大量的巨噬幼稚和CD4+和CD8+淋巴细胞浸润. Kaneko et al[21]的实验中被杀伤的肿瘤细胞未发现核碎片及染色体DNA断裂，因此他们认为这种细胞死亡不属于凋亡. Kuriyama et al[22]发现无论未被转导的肝癌细胞紧密连接或分散生长，在体内和体外均可被旁观者效应杀伤，证实TK-肝癌细胞释放某些递质，使TK-肿瘤细胞产生自杀. Macri et al[19]经AFP的转录调控顺序调控的HSV-TK嵌合基因转导对肝癌的治疗作用，认为肝癌切除后预防性AFP/HSV-TK基因治疗可防止肝癌的复发. Ido et al[8]发现添加地塞米松可通过AFP启动子中的糖皮质激素反应性元件来调节TK基因的表达，增加了本疗法的可调性. 此后多位学者的实验表明腺病毒载体(AVV)也可完成HSV-TK对多株肝癌细胞系的转导，使其获得对GCV的敏感性，证实AVV可介导AFP-HSV-TK原位定向转导肝癌细胞使其被GCV杀伤. Kaneko et al[12]将携带识别AFP分泌信号的AV/AFP/TK1基因经AVV转染人肝癌细胞SK-Hep-1和HuH7,结果分泌AFP的HUH7转导产生TK酶并被GCV损伤，表明经AVV介导的嵌合TK基因转导可能定向和特异性杀伤肝癌细胞.
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Austin et al[23]则构建了大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因，并经RVV转导入人大肠癌细胞系，CD酶将非毒性5-氟胞嘧啶(5-FC)代谢成毒性产物5-氟尿嘧啶(5-FU)，引起大肠癌细胞自杀. Huber et al[24]在此基础上将CEA基因与CD基因相嵌合，使CD基因选择性转导分泌CEA的大肠癌及肝转移癌细胞，特异性地杀伤肿瘤，他们的实验认为2%的肿瘤细胞转导表达CD基因即可通过旁观效应对整体肿瘤产生显著的抗肿瘤作用.
自杀基因疗法可以实现选择性的原位转导和特异性的杀伤. 避免了体外基因疗法中步骤繁多、技术要求高、难度大的靶细胞获取、培养、目的基因转导、微小筛选、回接种等过程，使本方法较早获得美国国立卫生研究院(NIH)和重组DNA顾问委员会(RAC)的批准并应用于临床，显示了良好的应用前景.
1.5免疫基因治疗 大量资料表明，随着肝癌的生长，尤其合并肝硬变的中晚期肝癌机体免疫功能下降，这主要是以下两方面的原因：一是肿瘤细胞免疫原性降低，二是机体抗瘤免疫力系统功能低下，因此应用免疫基因可通过改善以上两方面从而提高机体抗瘤免疫力来达到消除肿瘤之目的. 目前肝癌是以细胞因子基因治疗为代表的免疫基因治疗研究最多的一种肿瘤. Goldfarb et al[25]发现荧光标记的IL-2基因转染后的自然杀伤细胞(A-NK)能选择性地与肝转移的肿瘤细胞结合，靶向地发挥其抗肿瘤作用，活化的A-NK细胞在活体及临床上也显示出抗肿瘤转移的疗效，且基因转染诱发自体产生其他的细胞因子也加强了抗肿瘤转移的能力. 曹雪涛et al以成纤维细胞等容易培养和基因转染的细胞为载体，将IL-2基因导入体内，使IL-2在体内持续高表达15d之久，体内免疫功能显著提高，然后将LAK细胞经腹腔注射入腹水型肝癌小鼠，不用IL-2注射即取得了比常规IL-2/LAK细胞过继免疫治疗更强的抗肿瘤效果. 有人将携带编码IL-2基因的RVV的包装细胞直接注入腹腔，抑制了腹水型肝癌的生长，实验发现：经大鼠或兔肝动脉、门静脉及脾动脉注入抗肝癌免疫核糖核酸(RNA)可显著提高机体免疫功能，若RNA与IL-2或干扰素联合应用则效果更为优越.
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冯学胜et al[26]用含人TNF基因的RVV转导7721细胞，使其分泌TNF达90UI/mL，虽然体外生长能力无明显变化，但在裸鼠中的致瘤性显著下降，裸鼠体内接种的肿瘤经瘤内载体注射后外周血TNF水平也有一过性增高，3wk后肿瘤体积显著小于对照组，生存期延长. 张腾飞et al将IFNγ基因修饰后的细胞增殖减慢，HLA-Ⅰ，Ⅱ类表达都有不同程度的增加，致瘤降低甚至消失. 将肿瘤坏死因子(TNF)基因转染LAK细胞，增强了其杀伤活性，腹腔内注射后对腹水型肝癌小鼠的疗效也强于常规LAK细胞.
2 联合基因治疗
不同的肝癌基因疗法是根据肝癌发病的原因、发病过程的各个阶段及肝癌的特殊生物学特性设计的，杀伤的机制和作用途径也各不相同. 这就使不同的基因治疗策略的联合应用有可能相互协同、增强抗肿瘤效果. 自杀基因方法的一个发展方向就是与免疫基因治疗联合应用. 这种联合基因治疗已引起人们关注，Chen et al用HSV-TK基因和IFN基因联合转导MCA-26肝转移小鼠. 不但使转移性肝癌消退，还激发机体特异性的抗肿瘤免疫功能，伴随着肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T淋巴细胞的增多，可以抑制远处接种的亲代肿瘤细胞成瘤. 而HSV-TK和IFN两种基因单用转导的方法均无特异性的抗肿瘤免疫应答[27]. Hurford et al[28]将携带IL-2和IL-4的RVV脾内注射转导同一途径建立的小鼠实验性肝转移癌，得到IL-2和IL-4的表达激发抗肿瘤免疫反应抑制肿瘤生长. 曹雪涛et al建立了经成纤维细胞介导IFNα基因转导人肝癌细胞系7721的方法，并联合应用LAK细胞/IL-2/DOX(阿霉素)过继免疫化疗治疗人肝癌裸鼠，其疗效化比任何单一疗法更显著.
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通讯作者 孟照华
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收稿日期 1998-11-09 修回日期 1999-01-04, 百拇医药
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关键词：肝肿瘤/治疗；癌，肝细胞/治疗；基因治疗
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1.1 反义基因治疗 反义基因是根据肝癌发病原因，导入反义寡核苷酸封闭肝癌基因的表达或用正常抑癌基因取代突变抑癌基因. 研究证明肿瘤的发生是多基因参与的多步骤过程，使与肿瘤相关的多种癌基因和突变的抑癌基因及其转录产物都可作为反义分子(DNA，RNA)的作用靶点. 国内较早报道含人N-ras cDNA反义密码顺序的RVV对人肝癌细胞系PKC/PPF/5的生长有明显的抑制作用，并伴有ras基因表达产物下降，荷人肝癌LRNM4的裸鼠肿瘤生长也受含N-ras cDNA反义密码顺序的RVV抑制. 黄贤明et al[3]构建了一个能表达c-ets-2, c-myc及N-ras三个癌基因联合反义RNA的重组RVV，转导人肝癌细胞系7721后，检测到联合反义RNA表达，并使细胞生长速度下降70%，软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力下降. 有人将可与鼠肝癌基因结合的肝脂肪酸糖蛋白L-FABP转染鼠肝癌细胞株，在亚油酸的剌激下，转染的细胞克隆表达的L-FABP通过亚油酸的氧合代谢抑制了肝癌的生长.
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另外，与肿瘤恶性表型相关的细胞生长因子及受体亦可作为反义基因治疗的靶点. TGFα在肝脏超表达使肝细胞大量繁殖从而诱发肝癌，用RVV将TGFα反义RNA转染到大鼠，表达反义TGFαRNA的细胞生长受到明显的抑制. 通常表达4种成纤维细胞生长因子2(FGF-2)蛋白的人肝癌细胞SK-HEPL转导产生靶向人FGF-2mRNA不同位点的反义RNAs的表达载体后，FGF-2合成比对照组显著下降，细胞软琼脂集落形成率及裸鼠体内成瘤率无降低，且这一作用不能被外源性FGF-2所逆转[4]. 携带功能性胰岛素样生长因子(IGF)受体的肝癌细胞能通过内生性IGF-1的合成促进自身的生长，增强无限生长能力的维持表型. 用定位表达IGF-IRcDNA反义分子的质粒载体转染H-59肝癌细胞后观察，被转染的细胞丢失IGF-1应答能力，此质粒注射体内后肝的微循环系数、肺和其他部位的转移瘤形成率均显著降低. 试验表明此方法治疗是有效的[5]. 研究认为肝癌的反义基因治疗同样也受到限制；因为不同的肝癌细胞其抑癌基因的突变谱及癌基因激活的程度和方式不可能一致性，相关生长因子的自分泌及受体表达也同样不同，目前尚难以发现一种广为适用的反义基因治疗方法，加上反义核酸对靶基因结合的位点特异性差及易被分解、灭活等问题，因而使本方法停留在对某一种和几种肝癌细胞系的实验研究阶段.
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1.2 载体系统 载体系统包括两类：一类是病毒载体(逆转录病毒载体和腺病毒载体)；另一类是非病毒载体，如阳离子脂质体等. 目前转基因治疗常用的载体，是逆转录病毒和腺病毒，这两种转基因载体各有其特点. 将自杀基因转导至肿瘤靶细胞所用的载体是自杀基因疗法能付诸于临床的一项关键技术. 肝癌自杀基因疗法中首先采用的是重组逆转录病毒载体. 逆转录病毒能携带外源基因整合到靶细胞基因组，实现目的基因持久稳定表达是其能成为首选目标的一个主要原因. 1991年Huber et al[6]首先采用逆转录病毒载体携带AFP/VZV-TK嵌合基因转染人肝癌细胞并联合araM治疗，达到了特异杀伤肝癌细胞的目的. Caruso et al[7]将HSV1-TK基因采用逆转录病毒包装细胞原位转导大鼠实验性肝转移癌，给予GCV后，肿瘤体积明显缩小，动物生存期延长，同时观察到旁观者效应和大量CD4+，CD8+淋巴细胞在瘤周浸润. Ido et al[8]将AFP/HSV-TK嵌合基因插入到重组逆转录病毒载体，构建成LNAF0.3TK并转染肝癌细胞，能特异性地杀伤分泌AFP的肝癌细胞.
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由于逆转录病毒载体只能转染正在分裂细胞，有插入致突变和激活癌基因的危险，因in vivc应用肝癌细胞低表达，故不适合直接体内基因转导[9]. 而重组腺病毒载体由于能产生更高的病毒滴度及在体内外对肝癌细胞有较高的转染效率[10]，近年来备受重视. Qian et al[11]应用重组腺病毒载体携带HSV-TK(Ad-cmvtk),转染肝癌细胞系HEP3B，plc/PRF/5，HEPG2,使TK基因成功表达，诱导出肝癌细胞对GCV的敏感性，且只需将10%的瘤细胞导入TK基因即可观察到旁观者效应，显示了腺病毒载体是将药物敏感基因转导肝癌细胞的有效载体. Kaneko et al[12]分别采用腺病毒载体介导AFP/HSV-TK基因转染肝癌细胞，均获得特异性表达. Kwong et al[13]将MOD细胞植入到动物肝脏，建立乳腺癌肝转移模型，然后采用腺病毒介导HSV-TK基因治疗，使得肝转移灶明显消退，动物生存期延长，显示了腺病毒载体在转移性肝癌自杀基因疗法中的价值. 但是腺病毒载体存着不能整合到靶细胞染色体、且不能长期稳定表达、转染靶细胞后产生免疫反应从而降低转染效率和限制重复应用及对肝细胞有损伤作用[14]等缺点. 因此，基因治疗载体应要求具有低毒、高效、大容量、可控基因转导及表达等特点. 到目前为止，尚无一种病毒载体能同时满足上述要求，需进一步加强对病毒载体的研究.
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另外非病毒类载体如脂质体在肝癌自杀基因治疗研究中也有报道. Ghoumari et al[15]运用脂质体携带含有HSV-TK基因的质粒分别转染鼠和人肝癌细胞系HEP1-6，HEPG2，结果显示携带双拷贝HSV-TK基因肪质体转染的肝癌细胞对GCV的敏感性要明显高于携带单拷贝者. 肪质体介导的基因转移方法具有简便、安全、可携带较大DNA分子等优点，但其转染效率低，缺乏细胞特异性，应用也受到限制. 应加强对其稳定性、靶向性和提高转染效率的研究.
1.3 基因转染治疗 肝癌抑制基因治疗尤其是自杀基因疗法、基因转染及表达的靶向性关系到治疗的高效性和是否对正常机体组织产生损害. Drazan et al[16]以腺病毒为载体经门静脉灌注将野生型p53基因转染部分肝脏切除后的大鼠肝脏，结果转染前后肝脏生理功能未见异常改变. 在靶向性转导方面，逆转录病毒只感染分裂细胞的特性使其所转导的细胞具有相对特异性，这对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适. 但是系统应用pin vivo法则对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛组织产生致死性杀伤作用，有产生与放、化疗相似副作用的危险性. Bookstein et al[17]建立了肝肿瘤原位p53基因转导方法，有效的抑制了肝癌生长及大肠癌肝转移形成. 腺病毒载体虽可因肝脏有丰富腺病毒受体而静脉注射时大量(可达90%)集中在肝脏组织，但由于腺病毒对分裂及静息细胞均有感染性，同样也达不到肝癌组织靶向性转导的目的. 于是研究者们更多地把目光投向自杀基因在肝癌组织靶向性表达方面. 即将自杀基因置于肝癌特异性转录调控序列(TRS)之下，以达到使自杀基因在肝癌组织特异性表达的目的. 目前研究较多的是AFP启动子/增强子. AFP基因上游5.1kb内的顺式调控元件含有多个增强子和沉寂子，即0.3kb的增强子A和0.4kb的增强子B及两个沉寂子SD(distal silencer),SP(proximal silencer)[18]，它们对调控的目的基因能在AFP阳性的肝癌细胞中特异性表达，而在AFP阴性的肝癌细胞及非肝癌细胞中不能表达或低表达.
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采用逆转录病毒载体转导自杀基因在对肝癌细胞靶向性表达的研究中，Huber et al[6]将VZV-TK基因置于5.1kb的AFP基因上游转录调控区之下，Macri et al[19]采用的是7.6kb的小鼠AFP基因5'翼序列与HSV-TK基因相连，均达到了使自杀基因在分泌AFP的肝癌中表达的目的. Ido et al[8]则采用了0.3kb的AFP启动子调控HSV-TK基因特异性表达，同时观察到添加地塞米松可通过AFP启动子的糖皮质激素反应元件来调节TK基因表达并增强acyclovir的杀细胞作用.
在腺病毒载体转导方面，Kaneko et al[12]采用的是4.9kb的人类AFP启动子，Kanai et al[20]构建了1.1kb的人类AFP启动子来调控HSV -TK基因特异性表达，使得AFP阳性的肝癌细胞系HUH7,HEPG2获得对GCV的敏感性而被杀死. Kanai还将AFP启动子增强子序列与EC-CD基因相连，运用重组腺病毒载体转染肝癌细胞，在体内外实验中均能特异性地使CD基因在AFP阳性的肝癌细胞中表达，使产生的5-FU发挥特异性杀伤作用.
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1.4 自杀基因治疗 将某些细菌及病毒中特有的自杀基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类将原来无毒性的抗病毒药物或化疗药物前体代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为“自杀基因”. 此基因是目前较为有效并具有临床应用前景的基因疗法.
Huber et al[6]最早构建了水痘一带状疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(VZVTK)基因及甲胎蛋白(AFP)转录调节序列组成的嵌合基因，并经RVV选择性转导入肝癌细胞，使无毒性的药物前体6-甲氧嘌呤阿拉伯核苷(AraM)在肝癌细胞内VZV-TK酶的作用下代谢成毒性产物腺嘌呤阿拉伯核苷三磷酸并将肿瘤细胞杀伤. Caruso et al[7]构建了单纯疱疹病毒Ⅰ型TK(HSV-I-TK)基因并经RVV直接注射大鼠实验性肝肿瘤完成了HSV-I-TK基因的原位转导，被转导的肿瘤细胞产生TK酶将与核苷结构类似的无毒性抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)代谢成毒性产物并将肿瘤细胞杀伤，使肿瘤体积显著缩小，生存期延长. 磷酸化的GCV或被其杀伤的肿瘤细胞所释放的凋亡小体在癌细胞间传递可使未转导TK基因的肿瘤细胞也被杀伤，产生旁观者效应. 转导TK基因的肿瘤细胞可增强局部免疫反应，肿瘤组织被大量的巨噬幼稚和CD4+和CD8+淋巴细胞浸润. Kaneko et al[21]的实验中被杀伤的肿瘤细胞未发现核碎片及染色体DNA断裂，因此他们认为这种细胞死亡不属于凋亡. Kuriyama et al[22]发现无论未被转导的肝癌细胞紧密连接或分散生长，在体内和体外均可被旁观者效应杀伤，证实TK-肝癌细胞释放某些递质，使TK-肿瘤细胞产生自杀. Macri et al[19]经AFP的转录调控顺序调控的HSV-TK嵌合基因转导对肝癌的治疗作用，认为肝癌切除后预防性AFP/HSV-TK基因治疗可防止肝癌的复发. Ido et al[8]发现添加地塞米松可通过AFP启动子中的糖皮质激素反应性元件来调节TK基因的表达，增加了本疗法的可调性. 此后多位学者的实验表明腺病毒载体(AVV)也可完成HSV-TK对多株肝癌细胞系的转导，使其获得对GCV的敏感性，证实AVV可介导AFP-HSV-TK原位定向转导肝癌细胞使其被GCV杀伤. Kaneko et al[12]将携带识别AFP分泌信号的AV/AFP/TK1基因经AVV转染人肝癌细胞SK-Hep-1和HuH7,结果分泌AFP的HUH7转导产生TK酶并被GCV损伤，表明经AVV介导的嵌合TK基因转导可能定向和特异性杀伤肝癌细胞.
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Austin et al[23]则构建了大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因，并经RVV转导入人大肠癌细胞系，CD酶将非毒性5-氟胞嘧啶(5-FC)代谢成毒性产物5-氟尿嘧啶(5-FU)，引起大肠癌细胞自杀. Huber et al[24]在此基础上将CEA基因与CD基因相嵌合，使CD基因选择性转导分泌CEA的大肠癌及肝转移癌细胞，特异性地杀伤肿瘤，他们的实验认为2%的肿瘤细胞转导表达CD基因即可通过旁观效应对整体肿瘤产生显著的抗肿瘤作用.
自杀基因疗法可以实现选择性的原位转导和特异性的杀伤. 避免了体外基因疗法中步骤繁多、技术要求高、难度大的靶细胞获取、培养、目的基因转导、微小筛选、回接种等过程，使本方法较早获得美国国立卫生研究院(NIH)和重组DNA顾问委员会(RAC)的批准并应用于临床，显示了良好的应用前景.
1.5免疫基因治疗 大量资料表明，随着肝癌的生长，尤其合并肝硬变的中晚期肝癌机体免疫功能下降，这主要是以下两方面的原因：一是肿瘤细胞免疫原性降低，二是机体抗瘤免疫力系统功能低下，因此应用免疫基因可通过改善以上两方面从而提高机体抗瘤免疫力来达到消除肿瘤之目的. 目前肝癌是以细胞因子基因治疗为代表的免疫基因治疗研究最多的一种肿瘤. Goldfarb et al[25]发现荧光标记的IL-2基因转染后的自然杀伤细胞(A-NK)能选择性地与肝转移的肿瘤细胞结合，靶向地发挥其抗肿瘤作用，活化的A-NK细胞在活体及临床上也显示出抗肿瘤转移的疗效，且基因转染诱发自体产生其他的细胞因子也加强了抗肿瘤转移的能力. 曹雪涛et al以成纤维细胞等容易培养和基因转染的细胞为载体，将IL-2基因导入体内，使IL-2在体内持续高表达15d之久，体内免疫功能显著提高，然后将LAK细胞经腹腔注射入腹水型肝癌小鼠，不用IL-2注射即取得了比常规IL-2/LAK细胞过继免疫治疗更强的抗肿瘤效果. 有人将携带编码IL-2基因的RVV的包装细胞直接注入腹腔，抑制了腹水型肝癌的生长，实验发现：经大鼠或兔肝动脉、门静脉及脾动脉注入抗肝癌免疫核糖核酸(RNA)可显著提高机体免疫功能，若RNA与IL-2或干扰素联合应用则效果更为优越.
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冯学胜et al[26]用含人TNF基因的RVV转导7721细胞，使其分泌TNF达90UI/mL，虽然体外生长能力无明显变化，但在裸鼠中的致瘤性显著下降，裸鼠体内接种的肿瘤经瘤内载体注射后外周血TNF水平也有一过性增高，3wk后肿瘤体积显著小于对照组，生存期延长. 张腾飞et al将IFNγ基因修饰后的细胞增殖减慢，HLA-Ⅰ，Ⅱ类表达都有不同程度的增加，致瘤降低甚至消失. 将肿瘤坏死因子(TNF)基因转染LAK细胞，增强了其杀伤活性，腹腔内注射后对腹水型肝癌小鼠的疗效也强于常规LAK细胞.
2 联合基因治疗
不同的肝癌基因疗法是根据肝癌发病的原因、发病过程的各个阶段及肝癌的特殊生物学特性设计的，杀伤的机制和作用途径也各不相同. 这就使不同的基因治疗策略的联合应用有可能相互协同、增强抗肿瘤效果. 自杀基因方法的一个发展方向就是与免疫基因治疗联合应用. 这种联合基因治疗已引起人们关注，Chen et al用HSV-TK基因和IFN基因联合转导MCA-26肝转移小鼠. 不但使转移性肝癌消退，还激发机体特异性的抗肿瘤免疫功能，伴随着肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T淋巴细胞的增多，可以抑制远处接种的亲代肿瘤细胞成瘤. 而HSV-TK和IFN两种基因单用转导的方法均无特异性的抗肿瘤免疫应答[27]. Hurford et al[28]将携带IL-2和IL-4的RVV脾内注射转导同一途径建立的小鼠实验性肝转移癌，得到IL-2和IL-4的表达激发抗肿瘤免疫反应抑制肿瘤生长. 曹雪涛et al建立了经成纤维细胞介导IFNα基因转导人肝癌细胞系7721的方法，并联合应用LAK细胞/IL-2/DOX(阿霉素)过继免疫化疗治疗人肝癌裸鼠，其疗效化比任何单一疗法更显著.
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通讯作者 孟照华
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收稿日期 1998-11-09 修回日期 1999-01-04, 百拇医药