CEA－重组痘苗病毒预防CEA阳性肿瘤的动物实验研究
作者：卢方安 黄冰 杨洁 罗超权 杨英浩 伍新尧
单位：
卢方安 杨洁 罗超权 杨英浩 伍新尧中山医科大学 生物化学教研室；黄冰 实验动物中心(广州，51008)现在通讯处：郧阳医学院生物化学教研室(湖北,十堰市，442000)
关键词：CEA-重组痘苗病毒；CEA阳性肿瘤；KM鼠
癌症990407
【摘要】目的：探讨CEA-重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤的预防作用。方法：构建CEA阳性小鼠Hepa肝癌细胞模型(Hepa-CEA+)。将实验鼠分为4组，先分别皮下接种痘苗病毒(野生型W-VV或重组型CEA-rV)3次，再分别颈背部皮下注射CEA阳性或CEA阴性同源鼠Hepa肝癌细胞。观察动物反应并在接种癌细胞后每周测量一次肿瘤大小。结果：3个对照组各鼠颈背部皮下均可见有瘤块形成，并且以相近速率快速增长，3组之间无统计学上的显著差异，而接种CEA-rV/Hepa-CEA+组各鼠在观察期限内均无肿瘤形成。整个实验过程中实验鼠未表现有毒副反应。结论：CEA-rV通过诱导机体的免疫系统产生CEA特异性的细胞和体液免疫应答反应，能有效预防小鼠移植性CEA阳性肿瘤的形成。
, 百拇医药
中图分类号：R730.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0382-03
The study of the preventive effect of CEA recombinant vaccinia virus on CEA positive tumor
LU Fang-an, HUANG Bing, YANG Jie, et al.
Department of Biochemistry,Sun Yat-sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510089,P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the preventive effect of CEA recombinant vaccina virus (CEA-rV)on CEA positive tumor.Methods：The CEA positive cell model of liver cancer were constructed.Forty mice, which were divided into four groups,were vaccinated by subcutaneous injection with wild-type vaccinia virus (WVV) or CEA-rV for three times respectively at 14-day intervals and followed by subcutaneous injection of CEA positive or CEA negative liver tumor cells.The animal responses were observed and the subcutaneous tumors were measured weekly after tumor cells injected.Results：Subcutaneous tumors grew in all mice in three control groups,and grew rapidly at approximately the same rate (P>0.05),in contrast,in 6 weeks period, no tumor grew in the group Ⅳ mice which CEA-rV and CEA positive tumor cells were injected.During the whole testing period,no toxic or side effect was observed in all animals.Conclusions：Through inducing the body's immune response, CEA-rV could effectively prevent the formation of murine CEA positive tumor transplanted.
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Key words：CEA-rV;CEA positive tumor;KM mice
恶性肿瘤是严重危害人类生命的疾病，在我国也是造成死亡的主要原因之一。虽然手术、化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统方法，但由于这些方法还不能达到完全根治或具有严重的毒副作用，只能提高病人的短期生存率。如果能够找到一些积极有效预防恶性肿瘤发生的方法，将具有重要的实用意义。近年来，肿瘤的免疫防治已成为肿瘤防治的新模式，重组痘苗病毒技术的发展[1]为达到此目的提供了有效的方法。本实验旨在利用CEA重组痘苗病毒这一安全有效的真核表达重组体，通过其激活机体的免疫系统产生CEA特异性的细胞和体液免疫能力，达到特异性预防CEA阳性肿瘤的目的。
1 材料与方法
1.1 逆转录病毒重组质粒pLXSN-CEA的构建
用限制酶EocRI酶切质粒pLXSN和p91023B-CEA-17,回收纯化获得线状载体pLXSN和CEA-cDNA片段，经连接形成pLXSN-CEA，采用BamHI酶切鉴定筛选出CEA-cDNA正向插入型重组质粒。
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1.2 pLXSN-CEA向小鼠Hepa肝癌细胞内的转染及表达
采用脂质体介导转染法将pLXSN-CEA转染小鼠Hepa肝癌细胞，经G418连续筛选和放射免疫法测定转染癌细胞的CEA表达量，获得稳定表达CEA的小鼠Hepa肝癌细胞。
1.3 动物实验
清洁级KM小鼠40只，体重18～22克，由中山医科大学实验动物中心提供(广东省实验动物监测所合格证字98A003)。W-VV为痘苗病毒天坛761株，由北京军事医学科学院病毒学研究所惠赠，由本课题组制备。CEA重组痘苗病毒(CEA-rV)由本课题组构建[2]并制备。
实验鼠分为4组，每组10鼠，雌雄各半。1，2组每鼠皮下接种10μl2.2×107PFU(plaqueformingunit,蚀斑形成单位)的W-VV，3，4组每鼠皮下接种10μl2.2×107PFU的CEA-rV，共接种3次，每次间隔14天。第3次接种后的第7天，1，3组每鼠颈背部皮下接种2.6×105CEA阴性小鼠肝癌细胞(Hepa-CEA-)，2，4组每鼠颈背部皮下接种2.6×105CEA阳性小鼠肝癌细胞(Hepa-CEA+)。接种癌细胞后每周测量一次肿瘤的长径和宽径，计算肿瘤体积，公式为：肿瘤体积V=(宽径W2×长径L)/2[3]。
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2 结果
2.1 CEA-cDNA正向插入型pLXSN-CEA的构建
将p91023B-CEA-17用EcoRI酶切后得到的CEA-cDNA片段插入到pLXSN的EcoRI位点，可获得CEA-cDNA正向插入型和反向插入型2种重组质粒。CEA-cDNA反向插入型重组质粒用BamHI酶切后可得到约1kb和7.8kb两条电泳带，而CEA-cDNA正向插入型重组质粒用BamHI酶切后可得到约2kb和6.8kb两条电泳带(图1)，依此筛选获得实验所需的有意义的CEA-cDNA正向插入型重组质粒pLXSN-CEA。
图1 重组质料pLXSN-CEA酶切鉴定结果
1 pLXSN-CEA(正)BamHI酶切
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2 pLXSN-CEA(反)BamHI酶切
3 pLXSNBamHI酶切
4 pLXSN-CEA(正)EcoRI酶切
5 pLXSNEcoRI酶切
2.2 转染pLXSN-CEA的小鼠Hepa肝癌细胞的CEA表达
用放射免疫法测定CEA的结果如附表，转染pLXSN-CEA的Hepa肝癌细胞样品测得的CEA值随细胞数的增加而增加，而未转染的Hepa肝癌细胞样品未能测得CEA的表达，说明在导入CEA基因以后，细胞有CEA的表达。由于表达产物能与抗CEA特异性抗体结合，说明其有天然CEA的特性。
附表 放射免疫法测定细胞CEA含量(ng) 细胞类型
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上清(ml)
细胞数
7.7×105
7.7×106
未转染CEA的Hepa细胞
0
0
0
转染CEA的Hepa细胞
0.848
10.542
97.949
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2.3 CEA-rV对实验性CEA阳性肿瘤的预防
为了观察CEA-rV对CEA阳性肿瘤有否特异性预防作用，本实验设立了两种类型的对照，分别用CEA阳性和CEA阴性的小鼠癌细胞接种实验鼠，目的是观察抗肿瘤效应是否直接针对CEA；用野生型痘苗病毒作为免疫原接种实验鼠，则是观察免疫杀伤效应是否是痘苗病毒中插入了人CEA的结果。
从图2可见，不管是W-VV还是CEA-rV，都不能有效预防CEA阴性肿瘤的形成和生长，1组和3组的每只小鼠接种部位皮下均可见有肿瘤形成，并且以几乎相同的速率迅速增长，而W-VV对CEA阳性肿瘤细胞同样无抑制作用，即2组各鼠皮下肿瘤显示出和1组、3组相同的生长态势。经统计学重复测量方差分析处理，1组、2组、3组之间无统计学上的显著差异(P=0.886>0.05)，而4组的10只小鼠在观察的6周时间内均未见有皮下肿瘤形成。整个实验过程中未见小鼠有毒副反应出现。说明CEA-rV能有效地预防小鼠移植性CEA阳性肿瘤的形成。
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图2 各组小鼠皮下肿瘤生长-时间曲线
3 讨论
本实验旨在用小鼠肿瘤模型观察CEA-重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤的免疫杀伤效应。由于动物细胞基因组不含人类CEA基因，不表达人的癌胚抗原[4]，因此本实验构建了一含人CEA的真核表达型质粒，并将其导入小鼠肿瘤细胞使其有效表达人CEA。
肿瘤的免疫防治是肿瘤防治的新模式，主要是通过一定的技术方法增强肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的免疫原性，诱导机体产生肿瘤特异性的细胞和体液免疫应答反应，杀伤肿瘤细胞[5]。癌胚抗原(CEA)是一种重要的肿瘤相关抗原[6]，在90%的胃肠道肿瘤，50%的乳腺癌及70%的非小细胞性肺癌中有高水平的表达，人们称其为CEA阳性肿瘤[7]。
对恶性肿瘤的手术治疗虽能有效去除肉眼可见的肿瘤，但无法解决术后复发和转移问题。放疗和化疗除具有严重的毒副反应外，由于许多肿瘤细胞对其不敏感，其疗效亦有限。考虑到机体自身免疫能力的高低是有效防治多种疾病的根本所在，利用我国过去预防天花的痘苗病毒天坛761株为真核表达载体构建成CEA-rV，通过其诱导机体免疫系统产生CEA特异性的细胞和体液免疫应答反应[3，8]，达到防治CEA阳性肿瘤的目的。
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通过先接种CEA-rV使机体产生有效持久的特异性免疫能力，再接种CEA阳性肿瘤细胞这一动物模式实验，显示出CEA-rV是有效的真核表达载体，对实验性CEA阳性肿瘤有良好的预防作用。由于CEA-rV接种方式简单，腹腔注射[9]、皮肤划痕[3]或皮下接种均可达到相同的效果，因此可以根据实际情况采用简便的接种方式，有利于推广应用。本实验的成功，为进一步研究在人体应用CEA-rV对CEA阳性肿瘤进行有效预防和CEA阳性肿瘤手术后预防复发和转移奠定了基础，由于CEA阳性肿瘤的瘤谱广，发病率和恶性程度高，CEA-rV可能具有广阔的应用前景。
基金项目：广东省自然科学基金，广东省卫生厅“九五”五个一工程，广州市科委联合资助项目
参考文献
1 Mackett M,Smith GL,Moss B.General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes [J] .J Virol,1984,49：857～ 864.
, 百拇医药
2 杨洁，罗超权，卢方安，等.人癌胚抗原重组痘苗病毒的构建和制备[J].中国生物化学与分子生物学，1999，15(1)：54.
3 Kantor J, Irvine K, Abrams S,et al.antitumor activity and immune response induced by a recombinant carcinoembryonic antigen-vaccinia virus vaccine [J] .J Natl Cancer Inst,1992,84：1084～ 1091.
4 Robbins PF, Kantor JA,Salgaller M,et al. Transduction and expression of the human carcinoembryonic antigen gene in a murine colon carcinoma cell line [J] .Cancer Res,1991,51：3657～ 3662.
, http://www.100md.com
5 李春海.肿瘤分子生物学研究进展[M].第一版.北京军事医学科学出版社，1996：13.
6 Norton JA.Carcinoembryonic antigen.New applications for an old marker [J] .Ann Surg,1991,213：95～ 97.
7 Hodge JW, McLaughlin JP, Abrams SI,et at.Admixture of a recombinant vaccinia virus containing the gene for the costimulatory molecule B7 and a recombinant vaccinia virus containing a tumor-associated antigen gene results in enhanced specific T-cell responses and antitumor immunity [J] .Cancer Res,1995,55：3598～ 3603.
8 杨洁，赖晃文，罗超权，等.人癌胚抗原cDNA-重组痘苗病毒接种动物的研究[J].中山医科大学学报，1997，18(增刊)：41～43.
9 Kaufman H, Schlom J,Kantor J.A recombinant vaccinia virus expressing human carcinoembryonic antigen (CEA)[J] .Int J Cancer,1991, 48：900.
收稿日期：1998-07-10；修回日期：1998-09-21, 百拇医药
单位：
卢方安 杨洁 罗超权 杨英浩 伍新尧中山医科大学 生物化学教研室；黄冰 实验动物中心(广州，51008)现在通讯处：郧阳医学院生物化学教研室(湖北,十堰市，442000)
关键词：CEA-重组痘苗病毒；CEA阳性肿瘤；KM鼠
癌症990407
【摘要】目的：探讨CEA-重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤的预防作用。方法：构建CEA阳性小鼠Hepa肝癌细胞模型(Hepa-CEA+)。将实验鼠分为4组，先分别皮下接种痘苗病毒(野生型W-VV或重组型CEA-rV)3次，再分别颈背部皮下注射CEA阳性或CEA阴性同源鼠Hepa肝癌细胞。观察动物反应并在接种癌细胞后每周测量一次肿瘤大小。结果：3个对照组各鼠颈背部皮下均可见有瘤块形成，并且以相近速率快速增长，3组之间无统计学上的显著差异，而接种CEA-rV/Hepa-CEA+组各鼠在观察期限内均无肿瘤形成。整个实验过程中实验鼠未表现有毒副反应。结论：CEA-rV通过诱导机体的免疫系统产生CEA特异性的细胞和体液免疫应答反应，能有效预防小鼠移植性CEA阳性肿瘤的形成。
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中图分类号：R730.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0382-03
The study of the preventive effect of CEA recombinant vaccinia virus on CEA positive tumor
LU Fang-an, HUANG Bing, YANG Jie, et al.
Department of Biochemistry,Sun Yat-sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510089,P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the preventive effect of CEA recombinant vaccina virus (CEA-rV)on CEA positive tumor.Methods：The CEA positive cell model of liver cancer were constructed.Forty mice, which were divided into four groups,were vaccinated by subcutaneous injection with wild-type vaccinia virus (WVV) or CEA-rV for three times respectively at 14-day intervals and followed by subcutaneous injection of CEA positive or CEA negative liver tumor cells.The animal responses were observed and the subcutaneous tumors were measured weekly after tumor cells injected.Results：Subcutaneous tumors grew in all mice in three control groups,and grew rapidly at approximately the same rate (P>0.05),in contrast,in 6 weeks period, no tumor grew in the group Ⅳ mice which CEA-rV and CEA positive tumor cells were injected.During the whole testing period,no toxic or side effect was observed in all animals.Conclusions：Through inducing the body's immune response, CEA-rV could effectively prevent the formation of murine CEA positive tumor transplanted.
, 百拇医药
Key words：CEA-rV;CEA positive tumor;KM mice
恶性肿瘤是严重危害人类生命的疾病，在我国也是造成死亡的主要原因之一。虽然手术、化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统方法，但由于这些方法还不能达到完全根治或具有严重的毒副作用，只能提高病人的短期生存率。如果能够找到一些积极有效预防恶性肿瘤发生的方法，将具有重要的实用意义。近年来，肿瘤的免疫防治已成为肿瘤防治的新模式，重组痘苗病毒技术的发展[1]为达到此目的提供了有效的方法。本实验旨在利用CEA重组痘苗病毒这一安全有效的真核表达重组体，通过其激活机体的免疫系统产生CEA特异性的细胞和体液免疫能力，达到特异性预防CEA阳性肿瘤的目的。
1 材料与方法
1.1 逆转录病毒重组质粒pLXSN-CEA的构建
用限制酶EocRI酶切质粒pLXSN和p91023B-CEA-17,回收纯化获得线状载体pLXSN和CEA-cDNA片段，经连接形成pLXSN-CEA，采用BamHI酶切鉴定筛选出CEA-cDNA正向插入型重组质粒。
, http://www.100md.com
1.2 pLXSN-CEA向小鼠Hepa肝癌细胞内的转染及表达
采用脂质体介导转染法将pLXSN-CEA转染小鼠Hepa肝癌细胞，经G418连续筛选和放射免疫法测定转染癌细胞的CEA表达量，获得稳定表达CEA的小鼠Hepa肝癌细胞。
1.3 动物实验
清洁级KM小鼠40只，体重18～22克，由中山医科大学实验动物中心提供(广东省实验动物监测所合格证字98A003)。W-VV为痘苗病毒天坛761株，由北京军事医学科学院病毒学研究所惠赠，由本课题组制备。CEA重组痘苗病毒(CEA-rV)由本课题组构建[2]并制备。
实验鼠分为4组，每组10鼠，雌雄各半。1，2组每鼠皮下接种10μl2.2×107PFU(plaqueformingunit,蚀斑形成单位)的W-VV，3，4组每鼠皮下接种10μl2.2×107PFU的CEA-rV，共接种3次，每次间隔14天。第3次接种后的第7天，1，3组每鼠颈背部皮下接种2.6×105CEA阴性小鼠肝癌细胞(Hepa-CEA-)，2，4组每鼠颈背部皮下接种2.6×105CEA阳性小鼠肝癌细胞(Hepa-CEA+)。接种癌细胞后每周测量一次肿瘤的长径和宽径，计算肿瘤体积，公式为：肿瘤体积V=(宽径W2×长径L)/2[3]。
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2 结果
2.1 CEA-cDNA正向插入型pLXSN-CEA的构建
将p91023B-CEA-17用EcoRI酶切后得到的CEA-cDNA片段插入到pLXSN的EcoRI位点，可获得CEA-cDNA正向插入型和反向插入型2种重组质粒。CEA-cDNA反向插入型重组质粒用BamHI酶切后可得到约1kb和7.8kb两条电泳带，而CEA-cDNA正向插入型重组质粒用BamHI酶切后可得到约2kb和6.8kb两条电泳带(图1)，依此筛选获得实验所需的有意义的CEA-cDNA正向插入型重组质粒pLXSN-CEA。
图1 重组质料pLXSN-CEA酶切鉴定结果
1 pLXSN-CEA(正)BamHI酶切
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2 pLXSN-CEA(反)BamHI酶切
3 pLXSNBamHI酶切
4 pLXSN-CEA(正)EcoRI酶切
5 pLXSNEcoRI酶切
2.2 转染pLXSN-CEA的小鼠Hepa肝癌细胞的CEA表达
用放射免疫法测定CEA的结果如附表，转染pLXSN-CEA的Hepa肝癌细胞样品测得的CEA值随细胞数的增加而增加，而未转染的Hepa肝癌细胞样品未能测得CEA的表达，说明在导入CEA基因以后，细胞有CEA的表达。由于表达产物能与抗CEA特异性抗体结合，说明其有天然CEA的特性。
附表 放射免疫法测定细胞CEA含量(ng) 细胞类型
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上清(ml)
细胞数
7.7×105
7.7×106
未转染CEA的Hepa细胞
0
0
0
转染CEA的Hepa细胞
0.848
10.542
97.949
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2.3 CEA-rV对实验性CEA阳性肿瘤的预防
为了观察CEA-rV对CEA阳性肿瘤有否特异性预防作用，本实验设立了两种类型的对照，分别用CEA阳性和CEA阴性的小鼠癌细胞接种实验鼠，目的是观察抗肿瘤效应是否直接针对CEA；用野生型痘苗病毒作为免疫原接种实验鼠，则是观察免疫杀伤效应是否是痘苗病毒中插入了人CEA的结果。
从图2可见，不管是W-VV还是CEA-rV，都不能有效预防CEA阴性肿瘤的形成和生长，1组和3组的每只小鼠接种部位皮下均可见有肿瘤形成，并且以几乎相同的速率迅速增长，而W-VV对CEA阳性肿瘤细胞同样无抑制作用，即2组各鼠皮下肿瘤显示出和1组、3组相同的生长态势。经统计学重复测量方差分析处理，1组、2组、3组之间无统计学上的显著差异(P=0.886>0.05)，而4组的10只小鼠在观察的6周时间内均未见有皮下肿瘤形成。整个实验过程中未见小鼠有毒副反应出现。说明CEA-rV能有效地预防小鼠移植性CEA阳性肿瘤的形成。
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图2 各组小鼠皮下肿瘤生长-时间曲线
3 讨论
本实验旨在用小鼠肿瘤模型观察CEA-重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤的免疫杀伤效应。由于动物细胞基因组不含人类CEA基因，不表达人的癌胚抗原[4]，因此本实验构建了一含人CEA的真核表达型质粒，并将其导入小鼠肿瘤细胞使其有效表达人CEA。
肿瘤的免疫防治是肿瘤防治的新模式，主要是通过一定的技术方法增强肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的免疫原性，诱导机体产生肿瘤特异性的细胞和体液免疫应答反应，杀伤肿瘤细胞[5]。癌胚抗原(CEA)是一种重要的肿瘤相关抗原[6]，在90%的胃肠道肿瘤，50%的乳腺癌及70%的非小细胞性肺癌中有高水平的表达，人们称其为CEA阳性肿瘤[7]。
对恶性肿瘤的手术治疗虽能有效去除肉眼可见的肿瘤，但无法解决术后复发和转移问题。放疗和化疗除具有严重的毒副反应外，由于许多肿瘤细胞对其不敏感，其疗效亦有限。考虑到机体自身免疫能力的高低是有效防治多种疾病的根本所在，利用我国过去预防天花的痘苗病毒天坛761株为真核表达载体构建成CEA-rV，通过其诱导机体免疫系统产生CEA特异性的细胞和体液免疫应答反应[3，8]，达到防治CEA阳性肿瘤的目的。
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通过先接种CEA-rV使机体产生有效持久的特异性免疫能力，再接种CEA阳性肿瘤细胞这一动物模式实验，显示出CEA-rV是有效的真核表达载体，对实验性CEA阳性肿瘤有良好的预防作用。由于CEA-rV接种方式简单，腹腔注射[9]、皮肤划痕[3]或皮下接种均可达到相同的效果，因此可以根据实际情况采用简便的接种方式，有利于推广应用。本实验的成功，为进一步研究在人体应用CEA-rV对CEA阳性肿瘤进行有效预防和CEA阳性肿瘤手术后预防复发和转移奠定了基础，由于CEA阳性肿瘤的瘤谱广，发病率和恶性程度高，CEA-rV可能具有广阔的应用前景。
基金项目：广东省自然科学基金，广东省卫生厅“九五”五个一工程，广州市科委联合资助项目
参考文献
1 Mackett M,Smith GL,Moss B.General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes [J] .J Virol,1984,49：857～ 864.
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2 杨洁，罗超权，卢方安，等.人癌胚抗原重组痘苗病毒的构建和制备[J].中国生物化学与分子生物学，1999，15(1)：54.
3 Kantor J, Irvine K, Abrams S,et al.antitumor activity and immune response induced by a recombinant carcinoembryonic antigen-vaccinia virus vaccine [J] .J Natl Cancer Inst,1992,84：1084～ 1091.
4 Robbins PF, Kantor JA,Salgaller M,et al. Transduction and expression of the human carcinoembryonic antigen gene in a murine colon carcinoma cell line [J] .Cancer Res,1991,51：3657～ 3662.
, http://www.100md.com
5 李春海.肿瘤分子生物学研究进展[M].第一版.北京军事医学科学出版社，1996：13.
6 Norton JA.Carcinoembryonic antigen.New applications for an old marker [J] .Ann Surg,1991,213：95～ 97.
7 Hodge JW, McLaughlin JP, Abrams SI,et at.Admixture of a recombinant vaccinia virus containing the gene for the costimulatory molecule B7 and a recombinant vaccinia virus containing a tumor-associated antigen gene results in enhanced specific T-cell responses and antitumor immunity [J] .Cancer Res,1995,55：3598～ 3603.
8 杨洁，赖晃文，罗超权，等.人癌胚抗原cDNA-重组痘苗病毒接种动物的研究[J].中山医科大学学报，1997，18(增刊)：41～43.
9 Kaufman H, Schlom J,Kantor J.A recombinant vaccinia virus expressing human carcinoembryonic antigen (CEA)[J] .Int J Cancer,1991, 48：900.
收稿日期：1998-07-10；修回日期：1998-09-21, 百拇医药