8-Br-cAMP对人肺癌H69细胞N-myc，c-fos表达的影响
作者：欧阳松云 陈奎生 张焕峰
单位：河南医科大学第一附属医院呼吸内科 (郑州 450052) 欧阳松云；河南医科大学分子细胞生物学研究中心 陈奎生；河南医科大学校医院 张焕峰
关键词：8-Br-cAMP；斑点印迹；基因表达；H69细胞系
中国现代医学杂志990417 为探索肺癌治疗的新途径，用10-5mol/L的8-Br-cAMP体外培育人肺癌H69细胞，应用RNA斑点印迹进行研究。结果显示：用8-Br-cAMP处理的实验组N-myc，c-fos的表达较未加8-Br-cAMP的对照组表达水平下降。提示8-Br-cAMP可下调H69细胞N-myc、c-fos基因表达。
分类号 R734.2
, http://www.100md.com 8-Br-cAMP为cAMP受体(cRP)的RⅡ2型的选择性位点类似物，它对多种癌细胞具有抑制生长和促进分化作用[1，2]，同时可下调一些肿瘤细胞的c-myc，H-ras，c-Jun，c-fos等癌基因的表达[3，4]。但8-Br-cAMP对人肺癌癌细胞N-myc，c-fos基因表达的影响尚未见文献报道。本研究应用8-Br-cAMP(10-5mol/L)体外培养H69细胞株，采用RNA斑点印迹技术研究观察8-Br-cAMP对人肺癌H69细胞株N-myc、c-fos基因的影响，以探索治疗肺癌的新途径。
1 材料与方法
1.1 材料制备
体外将H69细胞培养于RPMI-1640(Gibco公司提供)加10%胎牛血清的培养液中，分为实验组及对照组两组。实验组培养液中加终浓度为10-5mol/L的8-Br-cAMP(sigma 公司提供)，而对照组不加8-Br-cAMP。两组同时培养24h后，将细胞悬液浓度调至3×106个/ml，滴加于预处理过的硝酸纤维素膜(NCM)上。
, 百拇医药
1.2 RNA斑点印迹
应用完整细胞原位RNA印迹技术，以生物素标记的N-myc，c-fos cDNA探针(灵敏度均达1pg/μl)检测H69细胞N-myc，c-fos基因表达的mRNA，采用碱性磷酸酶体系显色，同时以100μg/ml RNase预消化标本60min或不加探针的杂交试验作为阴性对照。
1.3 结果分析
斑点印迹信号以岛津薄层扫描仪(日本)扫描数值表示信号强弱，进行统计学处理。
2 结果
N-myc、c-fos表达的信号呈兰紫色。两组扫描数值见附表。实验组较对照组N-myc、c-fos的mRNA信号减弱(P<0.05)。
附表 斑点印迹信号扫描数值比较(
±s) 分组
, 百拇医药
mRNA
N-myc
c-fos
实验组
41.22±2.62
45.00±8.20
对照组
44.17±4.53
67.00±6.10
P值
<0.05
<0.05
, 百拇医药 3 讨论
8-Br-cAMP为具有位点选择性的cAMP类似物，可选择性结合于蛋白激酶A(PKA)的调节亚基RⅡ2，从而抑制细胞生长及促进细胞分化[2]。8-Br-cAMP不但可抑制正常细胞的增殖，而且能抑制一些肿瘤细胞的增殖，并促进某些肿瘤细胞的分化[3～5]。同时，8-Br-cAMP尚有抑制一些肿瘤细胞中c-myc，H-ras，c-Jun，c-fos等癌基因表达的效应[3，4，6]。
分子遗传学研究显示，肺癌的形成是一个多步骤过程。从支气管粘膜上皮增生到真正肿瘤形成，发生了一系列遗传学改变，包括细胞染色体片段缺失，分子水平基因表达的改变等，这些遗传学改变常与一些癌基因激活有关[1]。在小细胞肺癌(Sclc)中，有N-myc，c-fos等癌基因表达增强，且N-myc表达增强的Sclc患者肿瘤浸润性强、存活时间短、对化疗更不敏感。如何通过抑制一些癌基因过度表达来抑制癌细胞生长，诱导其分化并减缓恶性进展为当今研究热点之一。本实验采用斑点印迹技术从基因表达水平上研究8-Br-cAMP体外对肺小细胞癌H69细胞相关N-myc、c-fos癌基因表达的影响。结果显示8-Br-cAMP可抑制H69细胞N-myc，c-fos癌基因的表达。
, 百拇医药
关于8-Br-cAMP调控H69细胞N-myc，c-fos基因的机制尚不清楚。可能N-myc，c-fos癌基因上游区有CRE (cAMP-responsive element)位点，8-Br-cAMP等cAMP的类似物通过作用于CRE调节癌基因的表达，这有待进一步探讨。国外已应用8-Cl-cAMP或8-Cl-腺苷(A)L(为8-Cl-cAMP代谢产物)于Ⅰ期癌症临床治疗并取得一定疗效。因其有一定毒性，故开展对分子作用相同而毒性较低、较经济的8-Br-cAMP的基础研究，可为癌症治疗的临床研究提供理论依据。
参考文献
1 Cho-chung YS,Clair T,Tortora G,et al.Suppression of malignancy targeting the intracellular singal transducing proteins of cAMP.The use of site-selective cAMP analogs,antisense strategy,and gene transfer.Life Sci,1991；48(12):1123～1132
, 百拇医药
2 Katsaros D,Tortora G,Tagliaferri P,et al.Site-selective cyclic AMP analogs provide a new approach in the control of cancer cell growth.FEBS Lett,1987；233:97～103
3 Bennet MR,Littlewood TD,Hancock DC,et al.Down-regulation of the c-myc proto-oncogene in inhibition of wascular smooth muscle cell proliferation:a signal for growth arresty.J Biochem,1994；302(pt3):701～708
4 Iwamoto Y,Reich R.Nemeth G,et al.Cyclic AMP decreases chemotaxis,invasiveness and lung colonization of H-ras transformed mouse fibroblasts.Clin Exp Metastasis,1993；11(6):492～501
, http://www.100md.com
5 Schwartz B,Lamprecht SA,Polak-Charcon S,et al.Induction of the differentiated phenotye in human colon cancer cell is associated with the attenuation of subcellular tyrosine phosphorylation.Oncol Res,1995；7(6):277～287
6 Li H,Chen HC,Huang FL,et al.Identification of a rapidly dephosphorylating 95 KDa protein as elongation factor 2 during 8-Br-cAMP treatment of N1E115 meuroblastoma cells.Biochem Biophys Res Commun,1995；217(1):131～137
1998-10-22收稿, http://www.100md.com
单位：河南医科大学第一附属医院呼吸内科 (郑州 450052) 欧阳松云；河南医科大学分子细胞生物学研究中心 陈奎生；河南医科大学校医院 张焕峰
关键词：8-Br-cAMP；斑点印迹；基因表达；H69细胞系
中国现代医学杂志990417 为探索肺癌治疗的新途径，用10-5mol/L的8-Br-cAMP体外培育人肺癌H69细胞，应用RNA斑点印迹进行研究。结果显示：用8-Br-cAMP处理的实验组N-myc，c-fos的表达较未加8-Br-cAMP的对照组表达水平下降。提示8-Br-cAMP可下调H69细胞N-myc、c-fos基因表达。
分类号 R734.2
, http://www.100md.com 8-Br-cAMP为cAMP受体(cRP)的RⅡ2型的选择性位点类似物，它对多种癌细胞具有抑制生长和促进分化作用[1，2]，同时可下调一些肿瘤细胞的c-myc，H-ras，c-Jun，c-fos等癌基因的表达[3，4]。但8-Br-cAMP对人肺癌癌细胞N-myc，c-fos基因表达的影响尚未见文献报道。本研究应用8-Br-cAMP(10-5mol/L)体外培养H69细胞株，采用RNA斑点印迹技术研究观察8-Br-cAMP对人肺癌H69细胞株N-myc、c-fos基因的影响，以探索治疗肺癌的新途径。
1 材料与方法
1.1 材料制备
体外将H69细胞培养于RPMI-1640(Gibco公司提供)加10%胎牛血清的培养液中，分为实验组及对照组两组。实验组培养液中加终浓度为10-5mol/L的8-Br-cAMP(sigma 公司提供)，而对照组不加8-Br-cAMP。两组同时培养24h后，将细胞悬液浓度调至3×106个/ml，滴加于预处理过的硝酸纤维素膜(NCM)上。
, 百拇医药
1.2 RNA斑点印迹
应用完整细胞原位RNA印迹技术，以生物素标记的N-myc，c-fos cDNA探针(灵敏度均达1pg/μl)检测H69细胞N-myc，c-fos基因表达的mRNA，采用碱性磷酸酶体系显色，同时以100μg/ml RNase预消化标本60min或不加探针的杂交试验作为阴性对照。
1.3 结果分析
斑点印迹信号以岛津薄层扫描仪(日本)扫描数值表示信号强弱，进行统计学处理。
2 结果
N-myc、c-fos表达的信号呈兰紫色。两组扫描数值见附表。实验组较对照组N-myc、c-fos的mRNA信号减弱(P<0.05)。
附表 斑点印迹信号扫描数值比较(
±s) 分组, 百拇医药
mRNA
N-myc
c-fos
实验组
41.22±2.62
45.00±8.20
对照组
44.17±4.53
67.00±6.10
P值
<0.05
<0.05
, 百拇医药 3 讨论
8-Br-cAMP为具有位点选择性的cAMP类似物，可选择性结合于蛋白激酶A(PKA)的调节亚基RⅡ2，从而抑制细胞生长及促进细胞分化[2]。8-Br-cAMP不但可抑制正常细胞的增殖，而且能抑制一些肿瘤细胞的增殖，并促进某些肿瘤细胞的分化[3～5]。同时，8-Br-cAMP尚有抑制一些肿瘤细胞中c-myc，H-ras，c-Jun，c-fos等癌基因表达的效应[3，4，6]。
分子遗传学研究显示，肺癌的形成是一个多步骤过程。从支气管粘膜上皮增生到真正肿瘤形成，发生了一系列遗传学改变，包括细胞染色体片段缺失，分子水平基因表达的改变等，这些遗传学改变常与一些癌基因激活有关[1]。在小细胞肺癌(Sclc)中，有N-myc，c-fos等癌基因表达增强，且N-myc表达增强的Sclc患者肿瘤浸润性强、存活时间短、对化疗更不敏感。如何通过抑制一些癌基因过度表达来抑制癌细胞生长，诱导其分化并减缓恶性进展为当今研究热点之一。本实验采用斑点印迹技术从基因表达水平上研究8-Br-cAMP体外对肺小细胞癌H69细胞相关N-myc、c-fos癌基因表达的影响。结果显示8-Br-cAMP可抑制H69细胞N-myc，c-fos癌基因的表达。
, 百拇医药
关于8-Br-cAMP调控H69细胞N-myc，c-fos基因的机制尚不清楚。可能N-myc，c-fos癌基因上游区有CRE (cAMP-responsive element)位点，8-Br-cAMP等cAMP的类似物通过作用于CRE调节癌基因的表达，这有待进一步探讨。国外已应用8-Cl-cAMP或8-Cl-腺苷(A)L(为8-Cl-cAMP代谢产物)于Ⅰ期癌症临床治疗并取得一定疗效。因其有一定毒性，故开展对分子作用相同而毒性较低、较经济的8-Br-cAMP的基础研究，可为癌症治疗的临床研究提供理论依据。
参考文献
1 Cho-chung YS,Clair T,Tortora G,et al.Suppression of malignancy targeting the intracellular singal transducing proteins of cAMP.The use of site-selective cAMP analogs,antisense strategy,and gene transfer.Life Sci,1991；48(12):1123～1132
, 百拇医药
2 Katsaros D,Tortora G,Tagliaferri P,et al.Site-selective cyclic AMP analogs provide a new approach in the control of cancer cell growth.FEBS Lett,1987；233:97～103
3 Bennet MR,Littlewood TD,Hancock DC,et al.Down-regulation of the c-myc proto-oncogene in inhibition of wascular smooth muscle cell proliferation:a signal for growth arresty.J Biochem,1994；302(pt3):701～708
4 Iwamoto Y,Reich R.Nemeth G,et al.Cyclic AMP decreases chemotaxis,invasiveness and lung colonization of H-ras transformed mouse fibroblasts.Clin Exp Metastasis,1993；11(6):492～501
, http://www.100md.com
5 Schwartz B,Lamprecht SA,Polak-Charcon S,et al.Induction of the differentiated phenotye in human colon cancer cell is associated with the attenuation of subcellular tyrosine phosphorylation.Oncol Res,1995；7(6):277～287
6 Li H,Chen HC,Huang FL,et al.Identification of a rapidly dephosphorylating 95 KDa protein as elongation factor 2 during 8-Br-cAMP treatment of N1E115 meuroblastoma cells.Biochem Biophys Res Commun,1995；217(1):131～137
1998-10-22收稿, http://www.100md.com