VEGF及其受体flt对荷瘤鼠喉癌细胞增殖的影响
作者：邓志宏 黄维国 邱建华 林顺涨 金岩
单位：第四军医大学西京医院耳鼻喉科(西安，710032)
关键词：喉肿瘤；血管内皮生长因子；增殖
癌症990417
【摘要】目的：观察血管内皮生长因子(VEGF)对喉癌细胞增殖动力学的影响。方法：首先建立荷瘤(HEP-2喉癌细胞)裸鼠动物模型，将抗VEGF抗体及抗VEGF受体flt抗体分别注射荷瘤鼠体内，通过活体标记BrdU的方法，观察抗VEGF抗体及抗flt抗体对喉癌HEP-2细胞增殖的影响。结果：与对照组相比较，抗VEGF抗体治疗组HEP-2细胞BrdU标记阳性率显著降低(P<0.05)；抗flt抗体治疗组BrdU标记阳性率亦显著小于对照组(P<0.05)；而抗VEGF抗体治疗组与抗flt抗体治疗组BrdU标记率无显著性差异(P>0.05)。结论：中和VEGF抗体的作用及封闭VEGF结合位点均可抑制喉癌细胞的增殖，提示VEGF与喉癌细胞生长有着密切的关系。
, 百拇医药
中图分类号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0412-03
Effect of anti-VEGF and its receptor antibody on the growth of laryngeal cancer Hep-2 cells in nude mice
DENG Zhi-hong, HUANG Wei-guo,OIU Jian-hua, et al.
Department of Otolaryngology and Department of Oral Pathology，Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,P.R.China
【Abstract】 Objective：To observe the effect of anti-VEGF and its receptor antibody on the growth of laryngeal carcer Hep-2 cell line.Methods：Establishing laryngeal cancer xenografts in nude mice, then treating the tumor-bearing mice with anti-VEGF and its receptor antibody, observing the effect of anti-VEGF and its receptor antibody on the growth of laryngeal carcer Hep-2 cells through labeling BrdU in vivo. Results：The number of BrdU labeled cells in the groups treated with MoAb was significantly lower than that of the control group, there were no diffecrences between the groups treated with anti-VEGF antibody and anti-VEGF receptor antibody.Conclusions：Both neutralizing VEGF antibody and blocking VEGF-biting site could inhibit the growth of laryngeal cancer cells, VEGF was highly associated with the growth of laryngeal cancer cells.
, 百拇医药
Key words：VEGF;Laryngeal cancer; Proliferation
血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)又称血管渗透性因子，通过作用于细胞上两个特异性的受体flt和flk-1/KDR而发挥其生物学作用的。目前大量的研究发现，VEGF无论在组织器官的发生、正常状态的维持以及多种肿瘤的发生、发展中都发挥着重要的作用。然而，VEGF及其受体是否可直接影响喉癌细胞的生长以及与喉癌生长的关系，目前尚不清楚。本文通过对荷瘤鼠皮下注射抗VEGF抗体及抗flt抗体，用BrdU活体标记动物的方法，观察抗VEGF抗体及抗flt抗体对喉癌细胞增殖动力学影响。
1 材料和方法
1.1 材料
BALB/C-nu/nu裸鼠(中科院上海实验动物中心提供)16只，6周龄，体重20～30g；人喉癌HEP-2细胞系(由第四军医大学口腔医院中心实验室提供)；RPMI1640培养液(GIBCOBRL公司)抗VEGF及抗Flt单抗(Oncogene Research Products)；抗IgG单抗(Dako公司)；鼠抗BrdU及BrdU标记、检测试剂盒(即用型Zymed Laboratrvies,INS)
, 百拇医药
1.2 裸鼠动物模型的建立
将人喉癌HEP-2细胞以1×106/只于裸鼠右腿皮下接种，一周后，所有裸鼠皮下均出现米粒大小肿块。将16只裸鼠随机进行分组，每组4只，共4组，其中Ⅰ组为抗VEGF抗体治疗组，Ⅱ组为抗Flt抗体治疗组，Ⅲ组为非相关性抗体IgG对照组，Ⅳ组为生理盐水对照组。每组于出现肿块的皮下进行相应抗体的注射，每次每点注射液体量为0.1ml。抗体浓度依次为：抗VEGF抗体40μg/ml,抗Flk抗体40μg/ml，IgG40μg/ml。从接种HEP-2细胞第7天开始，每隔4天局部皮下注射一次，共注射4次，最后一次注射完3天后活杀动物。
1.3 BrdU活体标记方法
裸鼠腹部消毒于腹腔内注射BrdU，剂量为0.25μ1/只，2小时后活杀动物。肿瘤标本用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，切片厚5μm。
, 百拇医药
1.4 BrdU免疫组化染色步骤
石蜡切片经脱蜡入水并经3%甲醇双氧水处理后，用0.125%胰蛋白酶消化10min(室温湿盒内)，滴加交性液100μl/张30min，PBS漂洗后加封闭液100μl/张10min，滴加生物素标记的鼠抗BrdU100μl/张，于4℃过夜，此后加链霉素卵白素过氧化物酶复合物，于37℃下30min，DAB显色液显色后用苏木精轻微复染胞核以显示阴性细胞。切片常规脱水、透明、封片。阳性对照为BrdU标记的小鼠睾丸精原细胞，阴性对照用PBS代替一抗。
1.5 BrdU的定量方法
用10×10的测试网格，在高倍视野下对网格中BrdU标记的阳性肿瘤细胞及未标记BrdU的阴性肿瘤细胞分别进行计数。每张切片随机计数6个不相重复的视野，计算BrdU阳性百分比二(BrdU标记的阳性肿瘤的细胞/视野中整个肿瘤细胞×100%)用Statgraphics统计分析软件，对所获得的各组数据进行显著性方差分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 BrdU标记的免疫组化染色结果
所有观察标本均标记上了BrdU。BrdU的阳性反应定位于胞核，呈棕黄色。非相关性抗体及生理盐水对照组中BrdU阳性反应多集中分布于癌巢的周边部以及肿瘤血管周围，呈弥散的分布方式(图1，2，)抗VEGF抗体治疗组及抗Flt抗体治疗组BrdU阳性反应的细胞数量明显减少，呈点状、散在的分布方式(图3，4)。
图1 非相关性抗体(IgC)对照组，示BrdU标记的阳性细胞集中分布于肿瘤血管周围。×250;
图2 生理盐水对照组，示BrdU阳性反应细胞呈弥散分布。
, 百拇医药
图3 抗VEGF抗体治疗组，示BrdU阳性反应细胞数量明显减少。×400
图4 抗Flt抗体治疗组，示BrdU阳性反应细胞数量明显减少。×400
阳性对照可见BrdU标记的精原细胞，阴性对照未见Brdu标记的细胞。
2.2 各组BrdU标记的肿瘤细胞定量结果
附表显示了各组BrdU标记的肿瘤细胞计数结果。从表中可以看出，非相关性抗体组及生理盐水对照组BrdU标记的阳性细胞数值显著大于抗VEGF抗体及抗Flt抗体治疗组(P<0.05)，而抗VEGF抗体和抗Flt抗体两组间BrdU标记的肿瘤细胞数量无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
VEGF作为主要的血管生成因子，目前已在胃癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中证实其不仅与肿瘤血管的发生、增殖有关，并直接与肿瘤的浸润、转移相关[1-3]。我们也曾用免疫组化染色方法证实了VEGF及其受体在喉粘膜恶性病变中的作用[4，5]，然而对于VEGF对喉癌细胞生长的作用尚没有直接的证据。本实验利用活体标记BrdU的方法，利用Brdu在细胞DNA合成期能有效地掺入到DNA链中，可以反应细胞S期增殖情况的特点，通过增殖动力学的方法观察VEGF对喉癌细胞生长的影响[6，7]。
, 百拇医药
实验结果显示，抗VEGF抗体治疗组BrdU标记的喉癌细胞数量低于对照组。同样，抗VEGF受体Flt抗体治疗组的肿瘤S期标记指数亦明显低于对照组。由此可知，中和VEGF抗体以及封闭VEGF的结合位点均可抑制喉癌细胞的增殖，从而抑制喉癌的生长。
此外，从BrdU免疫组化染色结果看，BrdU标记的细胞，大多集中分布于血管周围，而远离血管的喉癌细胞BrdU标记率较低，这可能与血管周围的肿瘤细胞由于得到充分的氧和营养物质而生长迅速，增殖处于了活跃状态有关，故BrdU标记率较高。已有研究发现肿瘤细胞可以合成与分泌VEGF，而VEGF的受体不仅可出现于血管内皮细胞，肿瘤细胞上也有VEGF受体的存在[8，9]。这说明VEGF不仅可以通过促进肿瘤血管的生成间接促进肿瘤细胞的生长，而且可以直接促进肿瘤细胞的生长。作者认为抗VEGF抗体及抗VEGF受体Flt抗体均可显著抑制HEP-2细胞的增殖，这更证实了VEGF不仅可以作用于肿瘤血管，而且很可能对HEP-2细胞的生长有直接的作用。由于抗VEGF抗体及抗Flt抗体对HEP-2细胞生长的直接抑制作用，亦可导致喉癌细胞增殖指数较对照组明显下降。
, http://www.100md.com
由以上结果可知，通过抑制VEGF的作用以及阻断VEGF的结合位点的方法均可显著抑制HEP-2细胞的生长，证实了VEGF与喉癌细胞的生长关系密切。
参考文献
1 Takahashi Y, Kitadai Y, Bucana CD, et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor,KDR, correlates with vascularity, metastasis and proliferation of human colon cancer [J] . Cancer Res, 1995,55(9)：3964～3968.
2 Maeda K, Chung YS, Takatsuka S, et al. Tumor angiogenesis and tumor cell proliferation as prognostic indicators in gastric carcinoma [J] .Br J Cancer,1995,72(2)：319～323.
, 百拇医药
3 Warren RS, Yuan H, Matli MR, et al.Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis [J] .J Clin Invest,1995,95(4)：1789～1797.
4 邓志宏，黄维国，金岩，等.血管内皮生长因子(VEGF)在喉粘膜上皮良性及恶性病变中的表达及其定量研究[J].第四军医大学学报，1997，18(6)：385.
5 邓志宏，黄维国，金岩，等.VEGF受体flk-1的表达与喉粘膜上皮癌变和转移的关系[J].肿瘤防治研究，1998，25(3)：257.
6 Fukui Y. Epidermal growth factor inhibits morphogenesis of the embryonic quail uropygial gland cultured in vitro [J] . Dev Growth Differ, 1997,39(2)：157～166.
, http://www.100md.com
7 Ghanayem BI, Elwell MR, Eldridge SR. Effects of the carcinogen, acrylonitrile,on forestomach cell proliferation and apoptosis in the rat：conmparison with methacrylonitrile[J] .Carcinogenesis,1997,18(4)：675～680.
8 Kao CY, Oakley CS, Welsch CW, et al. Growth requirements and neoplastic transformation of two types of normal human breast epithelial cell derived from reduction mammoplasty[J] .In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1997,33(4)：282～288.
9 Chow NH, Hsu PI, Lin XZ, et al. Expression of vascular endothelial growth factor in normal liver and hepatocellular carcinoma：an immunohistochemical study [J] .Hum Pathol, 1997,28(6)：698～703.
收稿日期：1998-08-10；修回日期：1999-02-04, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院耳鼻喉科(西安，710032)
关键词：喉肿瘤；血管内皮生长因子；增殖
癌症990417
【摘要】目的：观察血管内皮生长因子(VEGF)对喉癌细胞增殖动力学的影响。方法：首先建立荷瘤(HEP-2喉癌细胞)裸鼠动物模型，将抗VEGF抗体及抗VEGF受体flt抗体分别注射荷瘤鼠体内，通过活体标记BrdU的方法，观察抗VEGF抗体及抗flt抗体对喉癌HEP-2细胞增殖的影响。结果：与对照组相比较，抗VEGF抗体治疗组HEP-2细胞BrdU标记阳性率显著降低(P<0.05)；抗flt抗体治疗组BrdU标记阳性率亦显著小于对照组(P<0.05)；而抗VEGF抗体治疗组与抗flt抗体治疗组BrdU标记率无显著性差异(P>0.05)。结论：中和VEGF抗体的作用及封闭VEGF结合位点均可抑制喉癌细胞的增殖，提示VEGF与喉癌细胞生长有着密切的关系。
, 百拇医药
中图分类号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0412-03
Effect of anti-VEGF and its receptor antibody on the growth of laryngeal cancer Hep-2 cells in nude mice
DENG Zhi-hong, HUANG Wei-guo,OIU Jian-hua, et al.
Department of Otolaryngology and Department of Oral Pathology，Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,P.R.China
【Abstract】 Objective：To observe the effect of anti-VEGF and its receptor antibody on the growth of laryngeal carcer Hep-2 cell line.Methods：Establishing laryngeal cancer xenografts in nude mice, then treating the tumor-bearing mice with anti-VEGF and its receptor antibody, observing the effect of anti-VEGF and its receptor antibody on the growth of laryngeal carcer Hep-2 cells through labeling BrdU in vivo. Results：The number of BrdU labeled cells in the groups treated with MoAb was significantly lower than that of the control group, there were no diffecrences between the groups treated with anti-VEGF antibody and anti-VEGF receptor antibody.Conclusions：Both neutralizing VEGF antibody and blocking VEGF-biting site could inhibit the growth of laryngeal cancer cells, VEGF was highly associated with the growth of laryngeal cancer cells.
, 百拇医药
Key words：VEGF;Laryngeal cancer; Proliferation
血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)又称血管渗透性因子，通过作用于细胞上两个特异性的受体flt和flk-1/KDR而发挥其生物学作用的。目前大量的研究发现，VEGF无论在组织器官的发生、正常状态的维持以及多种肿瘤的发生、发展中都发挥着重要的作用。然而，VEGF及其受体是否可直接影响喉癌细胞的生长以及与喉癌生长的关系，目前尚不清楚。本文通过对荷瘤鼠皮下注射抗VEGF抗体及抗flt抗体，用BrdU活体标记动物的方法，观察抗VEGF抗体及抗flt抗体对喉癌细胞增殖动力学影响。
1 材料和方法
1.1 材料
BALB/C-nu/nu裸鼠(中科院上海实验动物中心提供)16只，6周龄，体重20～30g；人喉癌HEP-2细胞系(由第四军医大学口腔医院中心实验室提供)；RPMI1640培养液(GIBCOBRL公司)抗VEGF及抗Flt单抗(Oncogene Research Products)；抗IgG单抗(Dako公司)；鼠抗BrdU及BrdU标记、检测试剂盒(即用型Zymed Laboratrvies,INS)
, 百拇医药
1.2 裸鼠动物模型的建立
将人喉癌HEP-2细胞以1×106/只于裸鼠右腿皮下接种，一周后，所有裸鼠皮下均出现米粒大小肿块。将16只裸鼠随机进行分组，每组4只，共4组，其中Ⅰ组为抗VEGF抗体治疗组，Ⅱ组为抗Flt抗体治疗组，Ⅲ组为非相关性抗体IgG对照组，Ⅳ组为生理盐水对照组。每组于出现肿块的皮下进行相应抗体的注射，每次每点注射液体量为0.1ml。抗体浓度依次为：抗VEGF抗体40μg/ml,抗Flk抗体40μg/ml，IgG40μg/ml。从接种HEP-2细胞第7天开始，每隔4天局部皮下注射一次，共注射4次，最后一次注射完3天后活杀动物。
1.3 BrdU活体标记方法
裸鼠腹部消毒于腹腔内注射BrdU，剂量为0.25μ1/只，2小时后活杀动物。肿瘤标本用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，切片厚5μm。
, 百拇医药
1.4 BrdU免疫组化染色步骤
石蜡切片经脱蜡入水并经3%甲醇双氧水处理后，用0.125%胰蛋白酶消化10min(室温湿盒内)，滴加交性液100μl/张30min，PBS漂洗后加封闭液100μl/张10min，滴加生物素标记的鼠抗BrdU100μl/张，于4℃过夜，此后加链霉素卵白素过氧化物酶复合物，于37℃下30min，DAB显色液显色后用苏木精轻微复染胞核以显示阴性细胞。切片常规脱水、透明、封片。阳性对照为BrdU标记的小鼠睾丸精原细胞，阴性对照用PBS代替一抗。
1.5 BrdU的定量方法
用10×10的测试网格，在高倍视野下对网格中BrdU标记的阳性肿瘤细胞及未标记BrdU的阴性肿瘤细胞分别进行计数。每张切片随机计数6个不相重复的视野，计算BrdU阳性百分比二(BrdU标记的阳性肿瘤的细胞/视野中整个肿瘤细胞×100%)用Statgraphics统计分析软件，对所获得的各组数据进行显著性方差分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 BrdU标记的免疫组化染色结果
所有观察标本均标记上了BrdU。BrdU的阳性反应定位于胞核，呈棕黄色。非相关性抗体及生理盐水对照组中BrdU阳性反应多集中分布于癌巢的周边部以及肿瘤血管周围，呈弥散的分布方式(图1，2，)抗VEGF抗体治疗组及抗Flt抗体治疗组BrdU阳性反应的细胞数量明显减少，呈点状、散在的分布方式(图3，4)。
图1 非相关性抗体(IgC)对照组，示BrdU标记的阳性细胞集中分布于肿瘤血管周围。×250;
图2 生理盐水对照组，示BrdU阳性反应细胞呈弥散分布。
, 百拇医药
图3 抗VEGF抗体治疗组，示BrdU阳性反应细胞数量明显减少。×400
图4 抗Flt抗体治疗组，示BrdU阳性反应细胞数量明显减少。×400
阳性对照可见BrdU标记的精原细胞，阴性对照未见Brdu标记的细胞。
2.2 各组BrdU标记的肿瘤细胞定量结果
附表显示了各组BrdU标记的肿瘤细胞计数结果。从表中可以看出，非相关性抗体组及生理盐水对照组BrdU标记的阳性细胞数值显著大于抗VEGF抗体及抗Flt抗体治疗组(P<0.05)，而抗VEGF抗体和抗Flt抗体两组间BrdU标记的肿瘤细胞数量无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
VEGF作为主要的血管生成因子，目前已在胃癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中证实其不仅与肿瘤血管的发生、增殖有关，并直接与肿瘤的浸润、转移相关[1-3]。我们也曾用免疫组化染色方法证实了VEGF及其受体在喉粘膜恶性病变中的作用[4，5]，然而对于VEGF对喉癌细胞生长的作用尚没有直接的证据。本实验利用活体标记BrdU的方法，利用Brdu在细胞DNA合成期能有效地掺入到DNA链中，可以反应细胞S期增殖情况的特点，通过增殖动力学的方法观察VEGF对喉癌细胞生长的影响[6，7]。
, 百拇医药
实验结果显示，抗VEGF抗体治疗组BrdU标记的喉癌细胞数量低于对照组。同样，抗VEGF受体Flt抗体治疗组的肿瘤S期标记指数亦明显低于对照组。由此可知，中和VEGF抗体以及封闭VEGF的结合位点均可抑制喉癌细胞的增殖，从而抑制喉癌的生长。
此外，从BrdU免疫组化染色结果看，BrdU标记的细胞，大多集中分布于血管周围，而远离血管的喉癌细胞BrdU标记率较低，这可能与血管周围的肿瘤细胞由于得到充分的氧和营养物质而生长迅速，增殖处于了活跃状态有关，故BrdU标记率较高。已有研究发现肿瘤细胞可以合成与分泌VEGF，而VEGF的受体不仅可出现于血管内皮细胞，肿瘤细胞上也有VEGF受体的存在[8，9]。这说明VEGF不仅可以通过促进肿瘤血管的生成间接促进肿瘤细胞的生长，而且可以直接促进肿瘤细胞的生长。作者认为抗VEGF抗体及抗VEGF受体Flt抗体均可显著抑制HEP-2细胞的增殖，这更证实了VEGF不仅可以作用于肿瘤血管，而且很可能对HEP-2细胞的生长有直接的作用。由于抗VEGF抗体及抗Flt抗体对HEP-2细胞生长的直接抑制作用，亦可导致喉癌细胞增殖指数较对照组明显下降。
, http://www.100md.com
由以上结果可知，通过抑制VEGF的作用以及阻断VEGF的结合位点的方法均可显著抑制HEP-2细胞的生长，证实了VEGF与喉癌细胞的生长关系密切。
参考文献
1 Takahashi Y, Kitadai Y, Bucana CD, et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor,KDR, correlates with vascularity, metastasis and proliferation of human colon cancer [J] . Cancer Res, 1995,55(9)：3964～3968.
2 Maeda K, Chung YS, Takatsuka S, et al. Tumor angiogenesis and tumor cell proliferation as prognostic indicators in gastric carcinoma [J] .Br J Cancer,1995,72(2)：319～323.
, 百拇医药
3 Warren RS, Yuan H, Matli MR, et al.Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis [J] .J Clin Invest,1995,95(4)：1789～1797.
4 邓志宏，黄维国，金岩，等.血管内皮生长因子(VEGF)在喉粘膜上皮良性及恶性病变中的表达及其定量研究[J].第四军医大学学报，1997，18(6)：385.
5 邓志宏，黄维国，金岩，等.VEGF受体flk-1的表达与喉粘膜上皮癌变和转移的关系[J].肿瘤防治研究，1998，25(3)：257.
6 Fukui Y. Epidermal growth factor inhibits morphogenesis of the embryonic quail uropygial gland cultured in vitro [J] . Dev Growth Differ, 1997,39(2)：157～166.
, http://www.100md.com
7 Ghanayem BI, Elwell MR, Eldridge SR. Effects of the carcinogen, acrylonitrile,on forestomach cell proliferation and apoptosis in the rat：conmparison with methacrylonitrile[J] .Carcinogenesis,1997,18(4)：675～680.
8 Kao CY, Oakley CS, Welsch CW, et al. Growth requirements and neoplastic transformation of two types of normal human breast epithelial cell derived from reduction mammoplasty[J] .In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1997,33(4)：282～288.
9 Chow NH, Hsu PI, Lin XZ, et al. Expression of vascular endothelial growth factor in normal liver and hepatocellular carcinoma：an immunohistochemical study [J] .Hum Pathol, 1997,28(6)：698～703.
收稿日期：1998-08-10；修回日期：1999-02-04, 百拇医药