分泌抗丙型肝炎病毒NS5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定
作者：陈淑芬 徐东刚 于秋丽 逯好英 牛建章 孟宗达
单位：河北省卫生防疫站病毒科(保定071000)
关键词：抗体，单克隆/分离和提纯；肝炎病毒/分离和提纯；HCV；NS5区重组蛋白/方法；小鼠
河北医科大学学报990410 摘 要 目的 建立能稳定分泌抗丙型肝炎病毒(HCV)NS5重组蛋白单克隆抗体(McAb), 并对其生物学活性进行实验室鉴定。方法 用重组HCV NS5区蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP 2/0进行融合,经有限稀释克隆3次后制备分泌McAb的杂交瘤细胞株,并用酶免疫(EIA)法对其分泌抗体进行初步鉴定。结果 融合后的阳性克隆中筛选出6株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,命名为2C8,2D2,1D6,2G2,1F5和1F10。这6株McAb与NS5重组抗原均有良好的反应性, 杂交瘤培养上清的EIA抗体滴度为1∶400～1∶1 600, 其中1株诱生的同系小鼠腹水滴度为1∶80 000。这6株McAb均为IgG1亚型。结论 该McAb的制备,可为HCV感染者血清和肝组织中抗原检测方法的建立和生物工程药物的研制创造条件。
, http://www.100md.com
中图号 R512.6
ESTABLISHMENT AND PRELIMINARY IDENTIFICATION OF ANTI-HCV NS5
McAb HYBRIDOMA CELL LINES
Chen Shufen Xu Donggang Yu Qiuli Lu Haoying Niu Jianzhang Meng Zhongda
Department of Virology,Anti-epidemic Station of Hebei Province (Baoding 071000)
ABSTRACT Objective The goal is to establish hybridoma cell line which can secrete monoclonal antibodies against HCV recombinant NS5 protein and to determine biological activity of the monoclonal antibodies. Methods The BALB/c mice were immunized through intraperitoneal injection of the NS5 region protein of hepatitis C virus. After three times injection, the splenocytide positive for the NS5 region antigen was fused with SP 2/0 mouse myeloma cells. To prepare secretable McAb byhridoma cell lines, three times subcloning method, limited dilution method, were used. The antibody strains were analyzed by EIA. Results Six hybridoma cell lines of positive for HCV NS5 protein were selected designed 2C8,2D2, 1D6, 2G2,1F5 and 1F10 from cloning strains. The titer of EIA of the culture supernatant were 1∶400～1∶1 600. The titer of EIA in one animal of ascites was 1∶80 000. All the monoclonal 1 antibody strain was IgG1 subtype. Conclusion The McAb can be used in detection of HCV antigen in sera and hepatocyte and used in study of new bioengineering medicine.
, http://www.100md.com
MeSH antibodies,monoclonal/isol;hepatitis virus/isol; HCV NS5 recombinant protein/methods;mice
目前, 丙型肝炎病毒(HCV)全基因组序列已经阐明[1,2], 主要不同区段的基因已被克隆、表达[3],并已逐步应用于诊断试剂的研制[4,5],为提高试剂盒的灵敏性和特异性创造了条件。为了分析HCV NS5蛋白的抗原性,研究抗-NS5蛋白抗体性质、动态变化规律及临床意义。对HCV NS5区部分基因进行了克隆表达[6],并对该基因片段抗原在不同人群中进行了抗体动态研究[5]。HCV在感染者血清中含量极低, HCV的分离和培养至今仍未获得成功, 阻碍了直接检测HCV方法的建立。单克隆抗体(McAb)技术是分子生物学中的重要内容之一,本研究利用重组HCV NS5区蛋白作为免疫原, 建立了6个分泌抗—HCV NS5区单抗的杂交瘤细胞株。在本病的诊断、防治及病原学的研究方面将起到重要作用。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 HCV NS5区基因工程抗原: 由本课题组制备[5，6 ]。首先用计算机Goldkey程序对已获得的HCV NS5区基因进行分析，对其抗原优势表位进行预测分析, 在优势抗原表位设计合成引物。从河北省固安县丙型肝炎患者血清中纯化HCV RNA, 用RT-PCR方法进行扩增获得特异cDNA。目的基因经亚克隆构建PGEX-NS5-1重组质粒,转化至宿主菌BL21中诱导表达。用Western印迹和EIA法测定抗原活性,用制备电泳技术获得高纯度的重组抗原。
1.1.2 SP 2/0骨髓瘤细胞株: 购自中国预防医学科学院流行病学研究所,使用RPMI-1640培养基培养。
, http://www.100md.com 1.1.3 BALB/c小鼠: 为8周龄雄性, 购自北京军事医学科学院动物室。
1.1.4 羊抗鼠IgG: 辣根酶标记羊抗鼠IgG购自北京军事医学科学院,羊抗鼠IgG亚型单抗购自上海生物制品研究所, 以上试剂均按说明书操作。
1.2 实验方法
1.2.1 杂交瘤细胞株的建立
小鼠免疫: 用HCV NS5重组抗原按常规方案免疫BALB/c小鼠3次, 融合前3 d再对小鼠进行加强免疫。选抗-NS5抗体强阳性者, 用于细胞融合。
融合与克隆: 小鼠脾细胞与SP 2/0按常规方法进行融合[7]。克隆及亚克隆采用有限稀释法连续3次克隆, 阳性孔细胞体外连续传代3个月以上。
, 百拇医药
1.2.2 杂交瘤细胞筛选: 用ELISA方法对阳性杂交瘤进行筛选。用10 μg/ml HCV NS5蛋白抗原包被酶标板, 包被孔用2%BSA溶液封闭, 加入杂交瘤细胞培养上清和HRP-羊抗鼠IgG, 以OPD为底物显色, 492 nm测OD值,以小鼠阳性血清为阳性对照。标本OD值大于阴性对照值2.1倍判为阳性。
1.2.3 诱生BALB/c小鼠腹水: 取10～12周龄BALB/c小鼠, 腹腔注射降植烷 0.5 ml, 2周后腹腔注射抗-NS5阳性杂交瘤细胞悬液 0.5 ml, 浓度为 2×106个/ml, 10 d左右抽取腹水。
1.2.4 抗体特异性结合试验: 采用抑制试验方法。取不同稀释度的腹水100 μl, 加入NS5基因工程抗原100 μl, 混匀后37 ℃作用1 h,5 000 r/min离心15 min。同时用PBS液代替NS5基因工程抗原, 作抑制时的阴性对照。用上述ELISA方法测定抗体水平。与对照孔相比, 试验孔有50 %以上抑制判为阳性。
, http://www.100md.com
1.2.5 IgG亚型测定:用常规双向琼脂扩散法测定IgG亚型。
2 结果
2.1 阳性杂交瘤细胞株: 细胞共融合120孔,有明显杂交瘤生长的120孔,融合率为100%, 经固相ELISA法检测后阳性率为11.7%,经3 次克隆后阳性率达100%。 获得了6株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为2C8、2D2、1D6、2G2、1F5和1F10。杂交瘤细胞体外传代3个月后,仍稳定分泌抗体。扩大培养后液氮保存, 复苏后细胞仍保持分泌抗体能力。
2.2 McAb的测定: EIA结果显示, 6株McAb均与NS5区蛋白抗原有较强的反应性,培养上清液抗体滴度为1∶400～1∶1 600,见表1。选其中1株杂交瘤细胞(1F10)制备小鼠腹水, 其McAb滴度高达1∶80 000。
, http://www.100md.com
表1 6株McAb与HCV NS5酶免疫测定OD值与滴度
Table 1 OD value and titer of enzyme immunological
deterinination of 6 strains of McAb and HCV NS5 McAb
OD value
Titer
1∶10
1∶100
1∶200
1∶400
, 百拇医药
1∶800
1∶1 600
2 C8
2.68
1.44
0.88
0.57
0.44
0.21
1∶400
2 D2
2.68
, 百拇医药
1.32
0.84
0.54
0.40
0.25
1∶400
1 D6
2.68
2.68
2.37
0.97
0.74
0.59
, 百拇医药
1∶1 600
2 G2
2.68
1.84
1.65
0.80
0.63
0.35
1∶800
1 F5
2.68
2.35
, http://www.100md.com
1.65
1.17
0.81
0.60
1∶1 600
1 F10
2.68
1.02
0.80
0.56
0.41
0.26
1∶400
, http://www.100md.com
2.3 特异性抑制试验: 1F10 McAb不同稀释度的腹水经NS5处理后, 用ELISA法测定抑制后抗体水平。结果显示, 1F10 McAb能被NS5抑制, 抑制率均在50%以上。
2.4 McAb 亚型: 经琼脂双扩散试验证实, 6株McAb溶液上清与鼠标准IgG和IgG1抗血清均出现沉淀线,表明均为IgG1亚型。 表2 1F10 McAb腹水抑制试验结果
Table 2 Test of ascitic fluid inhibition of 1F10 McAb McAb
OD value
Titer
, 百拇医药
1∶1 000
1∶10 000
1∶20 000
1∶40 000
1∶80 000
1∶160 000
1F10
2.53
1.03
0.92
0.88
0.55
, 百拇医药
0.35
1∶80 000
IT
0.36
0.39
0.13
0.24
0.24
0.20
-
IT:Inhibitory test3 讨论
HCV基因组为单股正链RNA,长度约9.5 kb,由9 个基因区组成,从5'端开始依次为5'-NCR、C区、E1区、E2/NS1、NS2、NS3 、NS4、NS5和3'-NCR。其中C区和E1区为病毒结构蛋白编码区, E2/NS1区及NS2～5区为非结构蛋白编码区。NS5区最长, 约有3 150个核苷酸,含有GDD序列, 编码依赖RNA的病毒RNA多聚酶，参与病毒的复制[3]。所以,检测NS5抗体在一定程度上可反映丙型肝炎病情的活动状态,为临床治疗和预后评价提供新的依据。最近, 我国学者已对HCV NS5基因片段进行了克隆和蛋白的表达并成功地用于人群中抗-NS5抗体的检测[6]。本文利用重组表达的HCV NS5蛋白作为免疫原, 成功地制备了6株杂交瘤细胞株。鉴定结果显示, 这6株McAb的培养上清液EIA抗体效价为1∶400-1∶1 600。选其中强阳性的1株细胞(1F10)制备小鼠腹水,抗体效价高达1∶80 000。特异性抑制试验显示,1F10 McAb能被NS5抗原抑制, 抑制率均在50%以上。 经长时间培养并传代, 仍保持稳定的抗体分泌能力。上述结果表明, 这些细胞株不仅与NS5重组抗原有良好的结合能力, 而且有很好的稳定性和特异性。
, http://www.100md.com
HCV感染者血清学诊断主要采用EIA抗-HCV的测定, 并以此作为感染指标。高效价的NS5区蛋白McAb的制备成功, 可为HCV感染者血清和肝组织中HCV抗原的检测方法建立创造条件。此外, 该单抗的研制对于本病导向药物的研制和HCV感染的发病机理的研究具有十分重要的意义。
河北省科委和河北省卫生厅联合资助课题(NO. 96023)
徐东刚 逯好英 北京军事医学科学院基础医学研究所
参 考 文 献
1.Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acid Sci USA, 1991, 88:2451
, 百拇医药
2.Takamizawa A. Structure and organization of the hepatitis C virus genime isolated from human carriers.J Virol,1991,65:1105
3.Houghton m, Weiner AJ, Han J, et al. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implication for diagnosis,development and control of viral disease.Hepatol,1991, 14:382
4.Whyte G, Beal R. Screening - sensitivity, specificity and hepatitis C. The Medical Journal of Australia, 1995, 163:63
5.牛建章, 徐东刚, 孟宗达,等. 重组HCV NS5蛋白抗原在丙型肝炎检测中的应用, 中国病毒学,1997,12(3): 248
6.徐东刚, 逯好英, 牛建章, 等. HCV NS5区部分基因的克隆表达和抗-NS5抗体的动态研究. 中华医学杂志, 1998,78(3): 183
7.杜平,主编.医用实验病毒学.北京:人民军医出版社,1985.181
(1998-04-30 收稿), 百拇医药
单位：河北省卫生防疫站病毒科(保定071000)
关键词：抗体，单克隆/分离和提纯；肝炎病毒/分离和提纯；HCV；NS5区重组蛋白/方法；小鼠
河北医科大学学报990410 摘 要 目的 建立能稳定分泌抗丙型肝炎病毒(HCV)NS5重组蛋白单克隆抗体(McAb), 并对其生物学活性进行实验室鉴定。方法 用重组HCV NS5区蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP 2/0进行融合,经有限稀释克隆3次后制备分泌McAb的杂交瘤细胞株,并用酶免疫(EIA)法对其分泌抗体进行初步鉴定。结果 融合后的阳性克隆中筛选出6株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,命名为2C8,2D2,1D6,2G2,1F5和1F10。这6株McAb与NS5重组抗原均有良好的反应性, 杂交瘤培养上清的EIA抗体滴度为1∶400～1∶1 600, 其中1株诱生的同系小鼠腹水滴度为1∶80 000。这6株McAb均为IgG1亚型。结论 该McAb的制备,可为HCV感染者血清和肝组织中抗原检测方法的建立和生物工程药物的研制创造条件。
, http://www.100md.com
中图号 R512.6
ESTABLISHMENT AND PRELIMINARY IDENTIFICATION OF ANTI-HCV NS5
McAb HYBRIDOMA CELL LINES
Chen Shufen Xu Donggang Yu Qiuli Lu Haoying Niu Jianzhang Meng Zhongda
Department of Virology,Anti-epidemic Station of Hebei Province (Baoding 071000)
ABSTRACT Objective The goal is to establish hybridoma cell line which can secrete monoclonal antibodies against HCV recombinant NS5 protein and to determine biological activity of the monoclonal antibodies. Methods The BALB/c mice were immunized through intraperitoneal injection of the NS5 region protein of hepatitis C virus. After three times injection, the splenocytide positive for the NS5 region antigen was fused with SP 2/0 mouse myeloma cells. To prepare secretable McAb byhridoma cell lines, three times subcloning method, limited dilution method, were used. The antibody strains were analyzed by EIA. Results Six hybridoma cell lines of positive for HCV NS5 protein were selected designed 2C8,2D2, 1D6, 2G2,1F5 and 1F10 from cloning strains. The titer of EIA of the culture supernatant were 1∶400～1∶1 600. The titer of EIA in one animal of ascites was 1∶80 000. All the monoclonal 1 antibody strain was IgG1 subtype. Conclusion The McAb can be used in detection of HCV antigen in sera and hepatocyte and used in study of new bioengineering medicine.
, http://www.100md.com
MeSH antibodies,monoclonal/isol;hepatitis virus/isol; HCV NS5 recombinant protein/methods;mice
目前, 丙型肝炎病毒(HCV)全基因组序列已经阐明[1,2], 主要不同区段的基因已被克隆、表达[3],并已逐步应用于诊断试剂的研制[4,5],为提高试剂盒的灵敏性和特异性创造了条件。为了分析HCV NS5蛋白的抗原性,研究抗-NS5蛋白抗体性质、动态变化规律及临床意义。对HCV NS5区部分基因进行了克隆表达[6],并对该基因片段抗原在不同人群中进行了抗体动态研究[5]。HCV在感染者血清中含量极低, HCV的分离和培养至今仍未获得成功, 阻碍了直接检测HCV方法的建立。单克隆抗体(McAb)技术是分子生物学中的重要内容之一,本研究利用重组HCV NS5区蛋白作为免疫原, 建立了6个分泌抗—HCV NS5区单抗的杂交瘤细胞株。在本病的诊断、防治及病原学的研究方面将起到重要作用。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 HCV NS5区基因工程抗原: 由本课题组制备[5，6 ]。首先用计算机Goldkey程序对已获得的HCV NS5区基因进行分析，对其抗原优势表位进行预测分析, 在优势抗原表位设计合成引物。从河北省固安县丙型肝炎患者血清中纯化HCV RNA, 用RT-PCR方法进行扩增获得特异cDNA。目的基因经亚克隆构建PGEX-NS5-1重组质粒,转化至宿主菌BL21中诱导表达。用Western印迹和EIA法测定抗原活性,用制备电泳技术获得高纯度的重组抗原。
1.1.2 SP 2/0骨髓瘤细胞株: 购自中国预防医学科学院流行病学研究所,使用RPMI-1640培养基培养。
, http://www.100md.com 1.1.3 BALB/c小鼠: 为8周龄雄性, 购自北京军事医学科学院动物室。
1.1.4 羊抗鼠IgG: 辣根酶标记羊抗鼠IgG购自北京军事医学科学院,羊抗鼠IgG亚型单抗购自上海生物制品研究所, 以上试剂均按说明书操作。
1.2 实验方法
1.2.1 杂交瘤细胞株的建立
小鼠免疫: 用HCV NS5重组抗原按常规方案免疫BALB/c小鼠3次, 融合前3 d再对小鼠进行加强免疫。选抗-NS5抗体强阳性者, 用于细胞融合。
融合与克隆: 小鼠脾细胞与SP 2/0按常规方法进行融合[7]。克隆及亚克隆采用有限稀释法连续3次克隆, 阳性孔细胞体外连续传代3个月以上。
, 百拇医药
1.2.2 杂交瘤细胞筛选: 用ELISA方法对阳性杂交瘤进行筛选。用10 μg/ml HCV NS5蛋白抗原包被酶标板, 包被孔用2%BSA溶液封闭, 加入杂交瘤细胞培养上清和HRP-羊抗鼠IgG, 以OPD为底物显色, 492 nm测OD值,以小鼠阳性血清为阳性对照。标本OD值大于阴性对照值2.1倍判为阳性。
1.2.3 诱生BALB/c小鼠腹水: 取10～12周龄BALB/c小鼠, 腹腔注射降植烷 0.5 ml, 2周后腹腔注射抗-NS5阳性杂交瘤细胞悬液 0.5 ml, 浓度为 2×106个/ml, 10 d左右抽取腹水。
1.2.4 抗体特异性结合试验: 采用抑制试验方法。取不同稀释度的腹水100 μl, 加入NS5基因工程抗原100 μl, 混匀后37 ℃作用1 h,5 000 r/min离心15 min。同时用PBS液代替NS5基因工程抗原, 作抑制时的阴性对照。用上述ELISA方法测定抗体水平。与对照孔相比, 试验孔有50 %以上抑制判为阳性。
, http://www.100md.com
1.2.5 IgG亚型测定:用常规双向琼脂扩散法测定IgG亚型。
2 结果
2.1 阳性杂交瘤细胞株: 细胞共融合120孔,有明显杂交瘤生长的120孔,融合率为100%, 经固相ELISA法检测后阳性率为11.7%,经3 次克隆后阳性率达100%。 获得了6株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为2C8、2D2、1D6、2G2、1F5和1F10。杂交瘤细胞体外传代3个月后,仍稳定分泌抗体。扩大培养后液氮保存, 复苏后细胞仍保持分泌抗体能力。
2.2 McAb的测定: EIA结果显示, 6株McAb均与NS5区蛋白抗原有较强的反应性,培养上清液抗体滴度为1∶400～1∶1 600,见表1。选其中1株杂交瘤细胞(1F10)制备小鼠腹水, 其McAb滴度高达1∶80 000。
, http://www.100md.com
表1 6株McAb与HCV NS5酶免疫测定OD值与滴度
Table 1 OD value and titer of enzyme immunological
deterinination of 6 strains of McAb and HCV NS5 McAb
OD value
Titer
1∶10
1∶100
1∶200
1∶400
, 百拇医药
1∶800
1∶1 600
2 C8
2.68
1.44
0.88
0.57
0.44
0.21
1∶400
2 D2
2.68
, 百拇医药
1.32
0.84
0.54
0.40
0.25
1∶400
1 D6
2.68
2.68
2.37
0.97
0.74
0.59
, 百拇医药
1∶1 600
2 G2
2.68
1.84
1.65
0.80
0.63
0.35
1∶800
1 F5
2.68
2.35
, http://www.100md.com
1.65
1.17
0.81
0.60
1∶1 600
1 F10
2.68
1.02
0.80
0.56
0.41
0.26
1∶400
, http://www.100md.com
2.3 特异性抑制试验: 1F10 McAb不同稀释度的腹水经NS5处理后, 用ELISA法测定抑制后抗体水平。结果显示, 1F10 McAb能被NS5抑制, 抑制率均在50%以上。
2.4 McAb 亚型: 经琼脂双扩散试验证实, 6株McAb溶液上清与鼠标准IgG和IgG1抗血清均出现沉淀线,表明均为IgG1亚型。 表2 1F10 McAb腹水抑制试验结果
Table 2 Test of ascitic fluid inhibition of 1F10 McAb McAb
OD value
Titer
, 百拇医药
1∶1 000
1∶10 000
1∶20 000
1∶40 000
1∶80 000
1∶160 000
1F10
2.53
1.03
0.92
0.88
0.55
, 百拇医药
0.35
1∶80 000
IT
0.36
0.39
0.13
0.24
0.24
0.20
-
IT:Inhibitory test3 讨论
HCV基因组为单股正链RNA,长度约9.5 kb,由9 个基因区组成,从5'端开始依次为5'-NCR、C区、E1区、E2/NS1、NS2、NS3 、NS4、NS5和3'-NCR。其中C区和E1区为病毒结构蛋白编码区, E2/NS1区及NS2～5区为非结构蛋白编码区。NS5区最长, 约有3 150个核苷酸,含有GDD序列, 编码依赖RNA的病毒RNA多聚酶，参与病毒的复制[3]。所以,检测NS5抗体在一定程度上可反映丙型肝炎病情的活动状态,为临床治疗和预后评价提供新的依据。最近, 我国学者已对HCV NS5基因片段进行了克隆和蛋白的表达并成功地用于人群中抗-NS5抗体的检测[6]。本文利用重组表达的HCV NS5蛋白作为免疫原, 成功地制备了6株杂交瘤细胞株。鉴定结果显示, 这6株McAb的培养上清液EIA抗体效价为1∶400-1∶1 600。选其中强阳性的1株细胞(1F10)制备小鼠腹水,抗体效价高达1∶80 000。特异性抑制试验显示,1F10 McAb能被NS5抗原抑制, 抑制率均在50%以上。 经长时间培养并传代, 仍保持稳定的抗体分泌能力。上述结果表明, 这些细胞株不仅与NS5重组抗原有良好的结合能力, 而且有很好的稳定性和特异性。
, http://www.100md.com
HCV感染者血清学诊断主要采用EIA抗-HCV的测定, 并以此作为感染指标。高效价的NS5区蛋白McAb的制备成功, 可为HCV感染者血清和肝组织中HCV抗原的检测方法建立创造条件。此外, 该单抗的研制对于本病导向药物的研制和HCV感染的发病机理的研究具有十分重要的意义。
河北省科委和河北省卫生厅联合资助课题(NO. 96023)
徐东刚 逯好英 北京军事医学科学院基础医学研究所
参 考 文 献
1.Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acid Sci USA, 1991, 88:2451
, 百拇医药
2.Takamizawa A. Structure and organization of the hepatitis C virus genime isolated from human carriers.J Virol,1991,65:1105
3.Houghton m, Weiner AJ, Han J, et al. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implication for diagnosis,development and control of viral disease.Hepatol,1991, 14:382
4.Whyte G, Beal R. Screening - sensitivity, specificity and hepatitis C. The Medical Journal of Australia, 1995, 163:63
5.牛建章, 徐东刚, 孟宗达,等. 重组HCV NS5蛋白抗原在丙型肝炎检测中的应用, 中国病毒学,1997,12(3): 248
6.徐东刚, 逯好英, 牛建章, 等. HCV NS5区部分基因的克隆表达和抗-NS5抗体的动态研究. 中华医学杂志, 1998,78(3): 183
7.杜平,主编.医用实验病毒学.北京:人民军医出版社,1985.181
(1998-04-30 收稿), 百拇医药