三种镍化合物诱发转化细胞恶性度的鉴别与分析
作者：王敏 刘云岗 吴中亮 陈家堃
单位：王敏，吴中亮，陈家堃(广州医学院化学致癌研究所,广州 510182)；刘云岗(广州医学院实验医学中心)
关键词：镍化合物；转化细胞；体内成瘤
广州医学院学报990403 提要 目的：利用已建立的三种镍化合物体外转化细胞进行裸鼠体内成瘤实验研究，比较它们恶性度的差异。方法：三种镍化合物转化细胞接种BALB/C裸鼠，进行肿瘤细胞和转化细胞的透射电镜及扫描电镜观察。结果：硫化镍，氯化镍，硫酸镍分别诱发的转化细胞都能在BALB/C裸鼠皮下形成肿瘤，病理组织学检查确定为纤维肉瘤。经扫描电镜与透射电镜观察瘤细胞形态与转化细胞有一定差别。结论：本文进一步说明了三种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化，且都具有体内致瘤性。
中图分类号 R994.3
, http://www.100md.com
The Identification and Analysis of the Malignant Degrees in a Series of Morphologically Transformed Cells Induced by three Nickel Compounds
Wang Min,Liu Yungang,Wu Zhongliang,et al
(Institute for Chemical Carcinogenesis,Guangzhou Medical
College,Guangzhou 510182)
Objective:A series of morphologically transformed cells,which had been induced respectively by three nickel compounds in our laboratory,were applied to a tumor-formation test in nude mice in vivo,and the malignant degrees in different transformed cells were analysed and compared. Methods:BALB/c nude mice were inoculated with the transformed cells,and the cultured tumor cells from the resulting tumors as well as the transformed cells themselves were subject to transmission electron microscopic and scanning electron microscopic observation. Results:All of the five kinds of nickel compound-transformed cells formed tumors subcutaneously in the nude mice,and the tumors were pathologically identified as fibrosarcoma. Some differentiation between the tumor cells and the original transformed cells was observed electron microscopically.Conclusion:The present study suggests that the transformed cells induced by three nickel compounds were malignant with tumorigenic ability.
, 百拇医药
Key words Nickel compound;Transformed cells;In vivo tumorigenesis
镍及其化合物已被国际癌症研究机构(IRAC)确认为第一类致癌物[1]。有研究表明：不溶性镍盐(硫化镍、二硫化三镍等)可诱发动物肿瘤，可溶性镍盐(氯化镍、硫酸镍等)则不能[2]。本所已往研究证明氯化镍、硫酸镍和硫化镍均可诱发BALB/C-3T3细胞恶性转化，且以硫化镍的转化活性最强[3～5]，但三种镍化合物所诱发的转化细胞的体内成瘤性尚未鉴定，本研究的目的是通过裸鼠接种，观察三种不同镍化合物诱发的转化细胞在体内成瘤性上有无差异，以及在转化和成瘤阶段细胞超微结构上的异同。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
BALB/C-3T3细胞由美国国家职业安全与卫生研究所提供。硫化镍、氯化镍以及硫酸镍诱发的小鼠BALB/C-3T3转化细胞均为本所建立。细胞培养用含10%小牛血清的MEM培养液(MEM为GIBCO产品)，在37°C，5%CO2，饱和湿度的环境中培养。
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1.2 裸鼠成瘤试验
6周龄的BALB/C裸鼠30只，雌雄各半，由中山医科大学实验动物中心提供(合格证号医动字第26-98b003 SPF级)。取0.3ml含1.5×106转化细胞的无血清MEM混悬液注入裸鼠右侧颈部皮下，阴性对照组注射含等量正常BALB/C-3T3细胞的无血清MEM。阳性对照组注射含等量A549细胞的无血清MEM。除阴性对照组为6只鼠外，其余每组4只。每周观察记录注射局部及肿块发生情况。3周后，将动物处死，分离肿块。所有动物均作常规病理解剖，称量瘤体重，肿瘤标本常规病理切片检查。
1.3 裸鼠成瘤细胞的纯化、培养和传代
将诱发的裸鼠皮下肿瘤组织，在无菌条件下剪成1mm3左右，分散贴于培养皿上，滴入少量培养液(以组织块保持湿润为度)，置入CO2孵箱内培养。24h后加入2ml培养液 ，以后每三天换一次，每次5ml，各组织块周围长出细胞且生长较密集时，移去组织块，继续培养。当培养皿内细胞融合度达50%时，用0.25%胰蛋白酶消化后转移至培养瓶中进行培养，培养液血清浓度降至5%，传代4～5次。
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1.4 电镜观察
扫描电镜观察：培养皿内置盖玻片，分别接种正常细胞、转化细胞和裸鼠纤维肉瘤细胞，待细胞长满单层后，取出盖玻片，2.5%戊二醛和1%锇酸固定，50%～100%乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯处理，临界点干燥，离子溅射喷金，镜检。
透射电镜观察：细胞长至1.0×107/ml左右，0.25%胰蛋白酶消化，1000转/分离心5min沉淀收集细胞，弃上清后加入2.5%戊二醛固定12h，再用1%锇酸固定3h，按常规方法脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和铅盐双重染色，镜检。
2 结果
2.1 体内致瘤性
裸鼠接种转化细胞后7～12天，在注射局部先后 出现绿豆大小肿块并迅速增大(图1)。3周后剖杀裸鼠，肿瘤大小不等，呈鱼肉状，有分叶，部分肿瘤与深部肌肉组织粘连，或与皮肤粘连，可见部分包膜，表面有不同程度的出血和坏死，瘤体重量见表1。病理组织切片观察见肿瘤细胞呈编织状排列，有一定方向性，细胞呈梭形，核大深染，嗜碱性增强，可见丰富的的病理性核分裂相，胞浆比例明显减少(图2)。病理诊断为：纤维肉瘤，阴性对照组未见肿块出现。
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图1 诱发的裸鼠皮下肿瘤
图2 裸鼠皮下肿瘤的光镜像×200
表1 镍化合物诱发的转化细胞在BALB/C裸鼠体内成瘤的时间和瘤重 转化细胞
动物数
出现时间
瘤重(g, x±s)
出血坏死
硫化镍组
细胞系1*
4
, 百拇医药
第7天
1.9g±1.19
+
细胞系2*
4
第7天
0.55±0.31**
+
细胞系3*
4
第7天
0.68±0.39**
, 百拇医药
+
氯化镍组
4
第7天
0.53±0.05
+
硫酸镍组
4
第7天
1.13±0.74
+
*：为硫化镍在不同浓度下诱发的转化灶细胞经过软琼脂筛选的转化细胞系
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**：与硫化镍细胞系1比较P<0.05
2.2 肿瘤细胞的纯化
纤维肉瘤组织块培养1周左右，相差显微镜下观察，组织块周围出现大量肿瘤细胞及少量正常成纤维细胞，转移至培养瓶，降低培养液血清浓度后，肿瘤细胞继续旺盛增殖，正常细胞逐渐减少，一周传代2次，传4～5代后正常细胞已全部消失，纯化出肿瘤细胞。
2.3 电镜观察
扫描电镜观察结果：硫化镍转化细胞系1(0.2C1)诱发的肿瘤细胞表面凹凸不平，微绒毛较粗，密集，向四周伸展(图3)。细胞系2(0.5C1)诱发的肿瘤细胞表面较光滑，微绒毛短而稀少。细胞系3(0.5D2)诱发的肿瘤细胞表面微绒毛数量、长短介于前二者之间。相应于这三系硫化镍转化细胞表面微绒毛较细长，密度中等，细胞大小较为一致(图4)。氯化镍和硫酸镍二系转化细胞表面微绒毛有的明显，有的不明显，细胞大小不太一致。相应的肿瘤细胞表面微绒毛增粗，细胞体积增大。正常细胞表面较光滑，仅有少量突起(图5)。
, 百拇医药
图3 硫化镍转化细胞系1诱发的裸鼠皮下肿瘤的电镜像×3500
图4 硫化镍诱导的BALB/c3T3转化细胞表面电镜像×2000
图5 正常BALB/c3T3细胞表面电镜像×3500
透射电镜结果：肿瘤细胞形态呈梭长形，细胞核大，椭圆形或不规则形核浆比例增大，核膜内陷曲折，粗面内质网增多，线粒体增多，异染色质呈小块散在分布，核仁小而少见，细胞间有少量胶原原纤维。细胞间未见桥粒连接(图6)。转化细胞的细胞核增大，线粒体增多，染色质改变不明显。
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图6 裸鼠皮下肿瘤的透射电镜像×8000
3 讨论
本研究进一步确证了硫化镍、氯化镍及硫酸镍所诱发的BALB/C-3T3细胞转化为恶性转化。三种转化细胞接种裸鼠后均出现包块。大体形态观察，光镜及透射电镜观察结果确定诱发肿瘤为纤维肉瘤。说明了三种镍化合物转化细胞确实是恶性转化细胞，三种镍化物转化细胞接种于裸鼠形成的实体肿瘤在病理组织形态上无明显差别，而不管是细胞表面形态还是细胞内部超微结构，转化细胞系与相应的肿瘤细胞系有差别，提示在体内成瘤过程中有关的基因有可能发生了新的突变，遗传改变可能继续进行。硫化镍诱发的三系转化细胞其相应的肿瘤细胞表面形态也有相当的差别，提示同一化合物的不同转化灶细胞在体内成瘤过程中产生突变的机制或者位点可能不同。硫化镍三系转化细胞经过软琼脂筛选，细胞的均一性较好而氯化镍、硫酸镍二系未经过软琼脂筛选的转化细胞的均一性较差。提示镍化合物致癌过程中可能涉及多步骤和多种遗传改变。这些在转化与成瘤过程中不同阶段的形态学差异与遗传学改变的相关性，仍需进一步探讨。虽然从动物模型获得的实验结果与人类机体并不完全吻合，但用它来模拟人类肿瘤，在肿瘤的基础研究上进行探索，仍具有相当重要的意义[6]。
, 百拇医药
硫化镍三株转化细胞体内成瘤后的瘤体重量与其在软琼脂上的克隆形成率[5]相吻合,克隆形成率越高,生长速度越快,瘤体平均重量越大(P<0.05).可见克隆形成率对体内成瘤性及肿瘤生长速度具有相关性.
纯化出的肿瘤细胞可以做不同镍化合物诱发细胞转化的机理的进一步探讨,尤其可以探讨在转化和成瘤不同阶段中细胞生物学和分子生物学水平的系列变化。
参考文献：
[1]仲来福.IRAC专家工作组最近确认的对人致癌的物质. 国外医学卫生学分册, 1989;16(2):125～128
[2]Coogan TP, Latta DM, Imbra RJ, et al. Effect of nickel(Ⅱ) on DNA-protein interactions.Bio Trace Elem Rea. 1989;21:13～21
, 百拇医药
[3]刘云岗,陈家堃,吴中亮.硫酸镍诱发BALB/C-3T3细胞转化. 劳动医学, 1997;14(3):135～137
[4]刘云岗,陈家堃.氯化镍诱发BALB/C-3T3细胞转化.劳动医学, 1997;14(1):9～12
[5]刘云岗,陈家堃，吴中亮.硫酸镍诱发BALB/C-3T3细胞恶性转化.癌变.畸变.突变, 1999; 11(3):122～124
[6]葛淑芬,孙长伏,盐田觉.可移植性小鼠颌下腺纤维肉瘤生物学特性的研究. 中国医科大学学报, 1997;26(1):12
(收稿：1999-07-22), 百拇医药
单位：王敏，吴中亮，陈家堃(广州医学院化学致癌研究所,广州 510182)；刘云岗(广州医学院实验医学中心)
关键词：镍化合物；转化细胞；体内成瘤
广州医学院学报990403 提要 目的：利用已建立的三种镍化合物体外转化细胞进行裸鼠体内成瘤实验研究，比较它们恶性度的差异。方法：三种镍化合物转化细胞接种BALB/C裸鼠，进行肿瘤细胞和转化细胞的透射电镜及扫描电镜观察。结果：硫化镍，氯化镍，硫酸镍分别诱发的转化细胞都能在BALB/C裸鼠皮下形成肿瘤，病理组织学检查确定为纤维肉瘤。经扫描电镜与透射电镜观察瘤细胞形态与转化细胞有一定差别。结论：本文进一步说明了三种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化，且都具有体内致瘤性。
中图分类号 R994.3
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The Identification and Analysis of the Malignant Degrees in a Series of Morphologically Transformed Cells Induced by three Nickel Compounds
Wang Min,Liu Yungang,Wu Zhongliang,et al
(Institute for Chemical Carcinogenesis,Guangzhou Medical
College,Guangzhou 510182)
Objective:A series of morphologically transformed cells,which had been induced respectively by three nickel compounds in our laboratory,were applied to a tumor-formation test in nude mice in vivo,and the malignant degrees in different transformed cells were analysed and compared. Methods:BALB/c nude mice were inoculated with the transformed cells,and the cultured tumor cells from the resulting tumors as well as the transformed cells themselves were subject to transmission electron microscopic and scanning electron microscopic observation. Results:All of the five kinds of nickel compound-transformed cells formed tumors subcutaneously in the nude mice,and the tumors were pathologically identified as fibrosarcoma. Some differentiation between the tumor cells and the original transformed cells was observed electron microscopically.Conclusion:The present study suggests that the transformed cells induced by three nickel compounds were malignant with tumorigenic ability.
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Key words Nickel compound;Transformed cells;In vivo tumorigenesis
镍及其化合物已被国际癌症研究机构(IRAC)确认为第一类致癌物[1]。有研究表明：不溶性镍盐(硫化镍、二硫化三镍等)可诱发动物肿瘤，可溶性镍盐(氯化镍、硫酸镍等)则不能[2]。本所已往研究证明氯化镍、硫酸镍和硫化镍均可诱发BALB/C-3T3细胞恶性转化，且以硫化镍的转化活性最强[3～5]，但三种镍化合物所诱发的转化细胞的体内成瘤性尚未鉴定，本研究的目的是通过裸鼠接种，观察三种不同镍化合物诱发的转化细胞在体内成瘤性上有无差异，以及在转化和成瘤阶段细胞超微结构上的异同。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
BALB/C-3T3细胞由美国国家职业安全与卫生研究所提供。硫化镍、氯化镍以及硫酸镍诱发的小鼠BALB/C-3T3转化细胞均为本所建立。细胞培养用含10%小牛血清的MEM培养液(MEM为GIBCO产品)，在37°C，5%CO2，饱和湿度的环境中培养。
, http://www.100md.com
1.2 裸鼠成瘤试验
6周龄的BALB/C裸鼠30只，雌雄各半，由中山医科大学实验动物中心提供(合格证号医动字第26-98b003 SPF级)。取0.3ml含1.5×106转化细胞的无血清MEM混悬液注入裸鼠右侧颈部皮下，阴性对照组注射含等量正常BALB/C-3T3细胞的无血清MEM。阳性对照组注射含等量A549细胞的无血清MEM。除阴性对照组为6只鼠外，其余每组4只。每周观察记录注射局部及肿块发生情况。3周后，将动物处死，分离肿块。所有动物均作常规病理解剖，称量瘤体重，肿瘤标本常规病理切片检查。
1.3 裸鼠成瘤细胞的纯化、培养和传代
将诱发的裸鼠皮下肿瘤组织，在无菌条件下剪成1mm3左右，分散贴于培养皿上，滴入少量培养液(以组织块保持湿润为度)，置入CO2孵箱内培养。24h后加入2ml培养液 ，以后每三天换一次，每次5ml，各组织块周围长出细胞且生长较密集时，移去组织块，继续培养。当培养皿内细胞融合度达50%时，用0.25%胰蛋白酶消化后转移至培养瓶中进行培养，培养液血清浓度降至5%，传代4～5次。
, 百拇医药
1.4 电镜观察
扫描电镜观察：培养皿内置盖玻片，分别接种正常细胞、转化细胞和裸鼠纤维肉瘤细胞，待细胞长满单层后，取出盖玻片，2.5%戊二醛和1%锇酸固定，50%～100%乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯处理，临界点干燥，离子溅射喷金，镜检。
透射电镜观察：细胞长至1.0×107/ml左右，0.25%胰蛋白酶消化，1000转/分离心5min沉淀收集细胞，弃上清后加入2.5%戊二醛固定12h，再用1%锇酸固定3h，按常规方法脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和铅盐双重染色，镜检。
2 结果
2.1 体内致瘤性
裸鼠接种转化细胞后7～12天，在注射局部先后 出现绿豆大小肿块并迅速增大(图1)。3周后剖杀裸鼠，肿瘤大小不等，呈鱼肉状，有分叶，部分肿瘤与深部肌肉组织粘连，或与皮肤粘连，可见部分包膜，表面有不同程度的出血和坏死，瘤体重量见表1。病理组织切片观察见肿瘤细胞呈编织状排列，有一定方向性，细胞呈梭形，核大深染，嗜碱性增强，可见丰富的的病理性核分裂相，胞浆比例明显减少(图2)。病理诊断为：纤维肉瘤，阴性对照组未见肿块出现。
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图1 诱发的裸鼠皮下肿瘤
图2 裸鼠皮下肿瘤的光镜像×200
表1 镍化合物诱发的转化细胞在BALB/C裸鼠体内成瘤的时间和瘤重 转化细胞
动物数
出现时间
瘤重(g, x±s)
出血坏死
硫化镍组
细胞系1*
4
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第7天
1.9g±1.19
+
细胞系2*
4
第7天
0.55±0.31**
+
细胞系3*
4
第7天
0.68±0.39**
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+
氯化镍组
4
第7天
0.53±0.05
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硫酸镍组
4
第7天
1.13±0.74
+
*：为硫化镍在不同浓度下诱发的转化灶细胞经过软琼脂筛选的转化细胞系
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**：与硫化镍细胞系1比较P<0.05
2.2 肿瘤细胞的纯化
纤维肉瘤组织块培养1周左右，相差显微镜下观察，组织块周围出现大量肿瘤细胞及少量正常成纤维细胞，转移至培养瓶，降低培养液血清浓度后，肿瘤细胞继续旺盛增殖，正常细胞逐渐减少，一周传代2次，传4～5代后正常细胞已全部消失，纯化出肿瘤细胞。
2.3 电镜观察
扫描电镜观察结果：硫化镍转化细胞系1(0.2C1)诱发的肿瘤细胞表面凹凸不平，微绒毛较粗，密集，向四周伸展(图3)。细胞系2(0.5C1)诱发的肿瘤细胞表面较光滑，微绒毛短而稀少。细胞系3(0.5D2)诱发的肿瘤细胞表面微绒毛数量、长短介于前二者之间。相应于这三系硫化镍转化细胞表面微绒毛较细长，密度中等，细胞大小较为一致(图4)。氯化镍和硫酸镍二系转化细胞表面微绒毛有的明显，有的不明显，细胞大小不太一致。相应的肿瘤细胞表面微绒毛增粗，细胞体积增大。正常细胞表面较光滑，仅有少量突起(图5)。
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图3 硫化镍转化细胞系1诱发的裸鼠皮下肿瘤的电镜像×3500
图4 硫化镍诱导的BALB/c3T3转化细胞表面电镜像×2000
图5 正常BALB/c3T3细胞表面电镜像×3500
透射电镜结果：肿瘤细胞形态呈梭长形，细胞核大，椭圆形或不规则形核浆比例增大，核膜内陷曲折，粗面内质网增多，线粒体增多，异染色质呈小块散在分布，核仁小而少见，细胞间有少量胶原原纤维。细胞间未见桥粒连接(图6)。转化细胞的细胞核增大，线粒体增多，染色质改变不明显。
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图6 裸鼠皮下肿瘤的透射电镜像×8000
3 讨论
本研究进一步确证了硫化镍、氯化镍及硫酸镍所诱发的BALB/C-3T3细胞转化为恶性转化。三种转化细胞接种裸鼠后均出现包块。大体形态观察，光镜及透射电镜观察结果确定诱发肿瘤为纤维肉瘤。说明了三种镍化合物转化细胞确实是恶性转化细胞，三种镍化物转化细胞接种于裸鼠形成的实体肿瘤在病理组织形态上无明显差别，而不管是细胞表面形态还是细胞内部超微结构，转化细胞系与相应的肿瘤细胞系有差别，提示在体内成瘤过程中有关的基因有可能发生了新的突变，遗传改变可能继续进行。硫化镍诱发的三系转化细胞其相应的肿瘤细胞表面形态也有相当的差别，提示同一化合物的不同转化灶细胞在体内成瘤过程中产生突变的机制或者位点可能不同。硫化镍三系转化细胞经过软琼脂筛选，细胞的均一性较好而氯化镍、硫酸镍二系未经过软琼脂筛选的转化细胞的均一性较差。提示镍化合物致癌过程中可能涉及多步骤和多种遗传改变。这些在转化与成瘤过程中不同阶段的形态学差异与遗传学改变的相关性，仍需进一步探讨。虽然从动物模型获得的实验结果与人类机体并不完全吻合，但用它来模拟人类肿瘤，在肿瘤的基础研究上进行探索，仍具有相当重要的意义[6]。
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硫化镍三株转化细胞体内成瘤后的瘤体重量与其在软琼脂上的克隆形成率[5]相吻合,克隆形成率越高,生长速度越快,瘤体平均重量越大(P<0.05).可见克隆形成率对体内成瘤性及肿瘤生长速度具有相关性.
纯化出的肿瘤细胞可以做不同镍化合物诱发细胞转化的机理的进一步探讨,尤其可以探讨在转化和成瘤不同阶段中细胞生物学和分子生物学水平的系列变化。
参考文献：
[1]仲来福.IRAC专家工作组最近确认的对人致癌的物质. 国外医学卫生学分册, 1989;16(2):125～128
[2]Coogan TP, Latta DM, Imbra RJ, et al. Effect of nickel(Ⅱ) on DNA-protein interactions.Bio Trace Elem Rea. 1989;21:13～21
, 百拇医药
[3]刘云岗,陈家堃,吴中亮.硫酸镍诱发BALB/C-3T3细胞转化. 劳动医学, 1997;14(3):135～137
[4]刘云岗,陈家堃.氯化镍诱发BALB/C-3T3细胞转化.劳动医学, 1997;14(1):9～12
[5]刘云岗,陈家堃，吴中亮.硫酸镍诱发BALB/C-3T3细胞恶性转化.癌变.畸变.突变, 1999; 11(3):122～124
[6]葛淑芬,孙长伏,盐田觉.可移植性小鼠颌下腺纤维肉瘤生物学特性的研究. 中国医科大学学报, 1997;26(1):12
(收稿：1999-07-22), 百拇医药