癌基因检测的FISH技术在胃癌研究中的应用*
作者：彭文明 周敏能 麦卫阳 郑秀玲 方云光 钟慕贞 黄锐明
单位：广州医学院附属市第二人民医院病理科，广州 510150
关键词：癌基因；原位杂交技术；胃癌
广州医学院学报990418 中图分类号 R735.2
荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization.FISH)，是一种敏感的方法。最早用于细胞遗传学染色体的分析[1、2]，近年来用于肿瘤基因分析研究[3、4]。我们在胃癌研究中，通过FISH技术达到准确检测石蜡包埋组织切片中p53和c-erbB-2基因表达的目的，并取得了较理想的效果，其方法和体会介绍如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 我院1996～1998年胃癌根治术切除的标本55例，每例标本按肿瘤区、移行区(距肿瘤0.5～1cm)和正常区取材，10%甲醛固定，常规脱水包埋，切片。
1.2 试剂 P53、C-erbB-2cDNA生物素探针系中山生物技术有限公司提供。FISH试剂盒系Oncor公司产品。部分试剂配制：(1)20×SSC：88.2g枸橼酸钠，173.3g NaCl加水至1000ml，高压灭菌。(2)变性液：28ml去离子甲酰胺，4ml 20×SSC，8ml蒸馏水。(3)PBD液：用下列液代替，1000ml 20×SSC，加1.25g Tween 20，相当于5×PBD。
1.3 FISH 切片<4μm，置于硅烷玻片上60℃过夜。脱蜡于80%乙醇，晾干；2×SSC洗，5min×3次；0.2mol/L盐酸10min;2×SSC,5min×3次；250mg/L蛋白酶K室温30min；2×SSC洗，5min×3次；梯度乙醇脱水，晾干。切片入85℃变性液，8min后快速入-20℃70%～10%乙醇脱水，各2min，晾干；同时将配好的含有C-erbB-2探针的杂交液85℃变性5min，然后放在0℃冰浴10min;滴加探针杂交液，每片15-20μl，用盖玻片封盖，置于湿盒中，37℃温箱过夜。取下盖玻片，入50%甲酰胺45℃、10min；入2×SSC，40℃、5min；入2×SSC，37℃、5min;入PBD室温2min，每片滴加15～20μl FITC标记的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃、30min；PBD2min×3次；滴加15～20μl生物素结合的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃、30min；PBD 2min×3次；再加15-20μl FITC标记的Avidin，盖塑料膜，湿盒37℃、30min；PBD 2min×3次；滴加PI/Antifade,每片29μl(避光)，直接封片，5min后，荧光镜检。
, 百拇医药
1.4 对照 (1)正常胃粘膜组织;(2)用2×SSC代替探针杂交液作对照。
1.5 观察 用Olympus BX60荧光显微镜观察(滤镜WB，激发波长490～600nm)观察到细胞核呈橘红色，阳性者于细胞中有多个黄绿荧光点，大小不一致。阳性者用400定彩色胶卷显微照相记录(见图1、2)。
图1 弥漫型胃癌的癌细胞中可见成簇的P53cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FITC)杂交信号 FISHx1320
图2 肠型胃癌的癌细胞中可见多个c-erbB-2 cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FITC)杂交信号 FISHx3300
, 百拇医药
2 结果
本组55例胃癌肿瘤区中P53基因表达25例，阳性者45.5%，C-erbB-2基因表达20例,阳性率36.4%。在癌旁区P53和C-erbB-2阳性分别为2例(3.6%)和6例(10.9%)，在胃正常区内P53基因表达阴性，C-erbB-2阳性2例(3.6%)。阴性对照组均为阴性。
3 讨论
FISH技术最早由Pinkel(1986)和Heiles(1988)[1]应用检测染色体以来受到了广泛的重视。FISH是以荧光标记取代同位素标记而形成一种新的原位杂交方法。探针首先与某种介导分子(reportermolecule)结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。此项技术具有敏感性和特异性高，同其他分子生物学技术相比较，FISH技术避免了肿瘤内非实质性细胞对实验结果的干扰，不仅能对阳性信号做出直接较准确的定位，还能对阳性信号做出定量分析[5]。目前，FISH技术在肿瘤分子病理学的研究中已越来越多使用，并成为一个重要的工具。
, 百拇医药
我们在操作过程中的体会是：(1)切片在杂交前的预处理相当重要，尤其是蛋白酶K的浓度、消化的时间若掌握不好，杂交往往失败。若消化过度，细胞出现“鬼影”或整个组织消失成为废片；若消化不足，则显示持续的自发荧光或者差的PI染色；(2)一些步骤的温度应控制严格，而且要把液体预温到所要求的温度；(3)各步骤时间应准确，每次换液要迅速；(4)荧光观察时先用滤镜WG，观察到PI染色显示的橘红核后，再转用WB滤镜，即可观察到黄绿色荧光；(5)此种片在-20℃保存1周。
* 广州市科委科研基金资助项目(1999-z-102-10)
参考文献：
[1]Pinkel D,Landegent J,Collins C,et al.Fluoresence in situ hybridization with human chromosome specific libraries:Detection of trisomy 21 and translocation of Chromosome 4.Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:9138～9142
, http://www.100md.com
[2]Hou Jw,Liu Ch,Wang TR,et al.Mosaic ring chromosome 13 analyzed by fluorescence in situ hybridization.J Formosan Med Assoc,1992;91:11～14
[3]Michelle M，Le Beau.Fluorescence in situ hybridization in cancer diagnose.Important Adv Oncol，1993;29～45
[4]彭文明，周敏能，麦卫阳.胃癌c-erbB-2 基因扩增的荧光原位杂较检测.临床与实验病理学杂志，1999；15：(5)411～413
[5]张杰，陈乐真，吕亚莉等.Her-2/neu基因扩增及其蛋白表达与乳腺癌分化和转移的关系.中华病理学杂志，1997；26(1)46～47
(收稿：1999-11-04), 百拇医药
单位：广州医学院附属市第二人民医院病理科，广州 510150
关键词：癌基因；原位杂交技术；胃癌
广州医学院学报990418 中图分类号 R735.2
荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization.FISH)，是一种敏感的方法。最早用于细胞遗传学染色体的分析[1、2]，近年来用于肿瘤基因分析研究[3、4]。我们在胃癌研究中，通过FISH技术达到准确检测石蜡包埋组织切片中p53和c-erbB-2基因表达的目的，并取得了较理想的效果，其方法和体会介绍如下。
1 材料和方法
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1.1 材料 我院1996～1998年胃癌根治术切除的标本55例，每例标本按肿瘤区、移行区(距肿瘤0.5～1cm)和正常区取材，10%甲醛固定，常规脱水包埋，切片。
1.2 试剂 P53、C-erbB-2cDNA生物素探针系中山生物技术有限公司提供。FISH试剂盒系Oncor公司产品。部分试剂配制：(1)20×SSC：88.2g枸橼酸钠，173.3g NaCl加水至1000ml，高压灭菌。(2)变性液：28ml去离子甲酰胺，4ml 20×SSC，8ml蒸馏水。(3)PBD液：用下列液代替，1000ml 20×SSC，加1.25g Tween 20，相当于5×PBD。
1.3 FISH 切片<4μm，置于硅烷玻片上60℃过夜。脱蜡于80%乙醇，晾干；2×SSC洗，5min×3次；0.2mol/L盐酸10min;2×SSC,5min×3次；250mg/L蛋白酶K室温30min；2×SSC洗，5min×3次；梯度乙醇脱水，晾干。切片入85℃变性液，8min后快速入-20℃70%～10%乙醇脱水，各2min，晾干；同时将配好的含有C-erbB-2探针的杂交液85℃变性5min，然后放在0℃冰浴10min;滴加探针杂交液，每片15-20μl，用盖玻片封盖，置于湿盒中，37℃温箱过夜。取下盖玻片，入50%甲酰胺45℃、10min；入2×SSC，40℃、5min；入2×SSC，37℃、5min;入PBD室温2min，每片滴加15～20μl FITC标记的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃、30min；PBD2min×3次；滴加15～20μl生物素结合的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃、30min；PBD 2min×3次；再加15-20μl FITC标记的Avidin，盖塑料膜，湿盒37℃、30min；PBD 2min×3次；滴加PI/Antifade,每片29μl(避光)，直接封片，5min后，荧光镜检。
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1.4 对照 (1)正常胃粘膜组织;(2)用2×SSC代替探针杂交液作对照。
1.5 观察 用Olympus BX60荧光显微镜观察(滤镜WB，激发波长490～600nm)观察到细胞核呈橘红色，阳性者于细胞中有多个黄绿荧光点，大小不一致。阳性者用400定彩色胶卷显微照相记录(见图1、2)。
图1 弥漫型胃癌的癌细胞中可见成簇的P53cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FITC)杂交信号 FISHx1320
图2 肠型胃癌的癌细胞中可见多个c-erbB-2 cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FITC)杂交信号 FISHx3300
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2 结果
本组55例胃癌肿瘤区中P53基因表达25例，阳性者45.5%，C-erbB-2基因表达20例,阳性率36.4%。在癌旁区P53和C-erbB-2阳性分别为2例(3.6%)和6例(10.9%)，在胃正常区内P53基因表达阴性，C-erbB-2阳性2例(3.6%)。阴性对照组均为阴性。
3 讨论
FISH技术最早由Pinkel(1986)和Heiles(1988)[1]应用检测染色体以来受到了广泛的重视。FISH是以荧光标记取代同位素标记而形成一种新的原位杂交方法。探针首先与某种介导分子(reportermolecule)结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。此项技术具有敏感性和特异性高，同其他分子生物学技术相比较，FISH技术避免了肿瘤内非实质性细胞对实验结果的干扰，不仅能对阳性信号做出直接较准确的定位，还能对阳性信号做出定量分析[5]。目前，FISH技术在肿瘤分子病理学的研究中已越来越多使用，并成为一个重要的工具。
, 百拇医药
我们在操作过程中的体会是：(1)切片在杂交前的预处理相当重要，尤其是蛋白酶K的浓度、消化的时间若掌握不好，杂交往往失败。若消化过度，细胞出现“鬼影”或整个组织消失成为废片；若消化不足，则显示持续的自发荧光或者差的PI染色；(2)一些步骤的温度应控制严格，而且要把液体预温到所要求的温度；(3)各步骤时间应准确，每次换液要迅速；(4)荧光观察时先用滤镜WG，观察到PI染色显示的橘红核后，再转用WB滤镜，即可观察到黄绿色荧光；(5)此种片在-20℃保存1周。
* 广州市科委科研基金资助项目(1999-z-102-10)
参考文献：
[1]Pinkel D,Landegent J,Collins C,et al.Fluoresence in situ hybridization with human chromosome specific libraries:Detection of trisomy 21 and translocation of Chromosome 4.Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:9138～9142
, http://www.100md.com
[2]Hou Jw,Liu Ch,Wang TR,et al.Mosaic ring chromosome 13 analyzed by fluorescence in situ hybridization.J Formosan Med Assoc,1992;91:11～14
[3]Michelle M，Le Beau.Fluorescence in situ hybridization in cancer diagnose.Important Adv Oncol，1993;29～45
[4]彭文明，周敏能，麦卫阳.胃癌c-erbB-2 基因扩增的荧光原位杂较检测.临床与实验病理学杂志，1999；15：(5)411～413
[5]张杰，陈乐真，吕亚莉等.Her-2/neu基因扩增及其蛋白表达与乳腺癌分化和转移的关系.中华病理学杂志，1997；26(1)46～47
(收稿：1999-11-04), 百拇医药