糖尿病患者血中NO、LPO、SOD的变化及临床意义
作者：郑 辉 王中心 吴长珠 刘友尧 黄伟民
单位：郑辉，吴长珠，刘友尧，黄伟民：福建医科大学生物化学教研室(福州 350004)；王中心：福建医科大学附属第一医院内分泌科
关键词：糖尿病；一氧化氮；脂质过氧化物；过氧化物歧化酶
福建医科大学学报990412
目的 探讨患有Ⅱ型单纯糖尿病/或伴并发症的糖尿病患者血中一氧化氮(NO)的代谢产物NO3-/NO2-的水平与脂质过氧化物(LPO)、过氧化物歧化酶(SOD)的变化以及相互关系。 方法 采用Griess 法、TBA比色法、NBT比色法测定103例Ⅱ型糖尿病患者血中NO的代谢产物NO3-/NO2-的水平与LPO、SOD水平，数据用统计学软件EPI 6.0分析处理。 结果 单纯糖尿病(SDM)组、糖尿病伴并发症(CDM)组的NO、LPO水平较对照(NC)组有显著升高，而2个病例组的SOD水平较对照组明显降低(P<0.01)。 结论 Ⅱ型糖尿病患者体内NO水平升高，患者体内抗氧化能力减弱，机体存在氧化-抗氧化系统失调，可能与NO的灭活加快、内皮依赖性舒张障碍有关。
, 百拇医药
Circulating Nitric Oxide,Lipid Peroxide and Superoxide
Dismutase in Patients with Diabetes Mellitus Type Ⅱ and
its Clinical Significance
Zheng Hui1, Wang Zhongxin2, Wu Changzhu1, et al
(1. Department of Biochemistry, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004
2. Department of Endocrine, The Affiliated 1st Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou, 350005)
, 百拇医药
Objective To evaluate circulating nitric oxide(NO),lipid peroxide(LPO) and superoxide dismutase(SOD) in healthy subjects and patients suffering from diabetes mellitus(DM) type Ⅱ with or without compications,explore their implications of these changes on the course of DM. Methods Circulating NO,LPO and SOD were measured in the ways of Griess,TBA,NBT. Data collected were analyzed with software EPI version 6.0. Results The mean plasma levels of NO and LPO in DM patients with or without complications were significant higher than healthy control group,and their SOD level was significant lower(P<0.01). Conclusion The evidences mentioned above indicate that there exists an imbalance of oxidant-antioxidant system,which may contribute to the quenching of plasma NO,and may be associated with development of its complications,especially microvascular complications.
, 百拇医药
Key words diabetes； nitric oxide; lipid peroxide; superoxide dismutase
在慢性、持续高血糖的刺激下，糖尿病患者大小血管易于发生血管性病变，如高血压、肾病、视网膜病变，它们也是引起糖尿病患者发病死亡的最常见的原因，但是究竟血管性病变是如何发生的，其中的发生发展机制目前尚不明确。研究表明，非胰岛素依赖型糖尿病病人由血管内皮调控的血管舒张机能受到破坏，推测与血管内皮细胞产生的一氧化氮(NO)水平失调有关[1]。国外通过测定加入NO合成剂或抑制剂后，血流动力学方面的反应证实了NO在其中的作用[1]。国内也有报道糖尿病患者血中NO水平的变化[2，3]。由于体内NO极不稳定，以NO代谢产物硝酸盐NO3-和NO2-的总量(NO3-/NO2-)来间接反映NO的水平，是目前国内外普遍采用的方法。笔者通过同时测定糖尿病患者血中NO的代谢产物硝酸盐NO3-/NO2-与脂质过氧化物(LPO)、过氧化物歧化酶SOD水平，分析它们之间的关系，探讨其对糖尿病的发生发展的影响以及临床意义。
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1 对象和方法
1.1 对象
1.1.1 病例组 Ⅱ型糖尿病患者103例，按1985年WHO诊断和分类标准确诊，男性52例，女性51例，年龄53.6±15.5岁(11～77岁)。根据其有无并发症分二组，单纯糖尿病组(SDM组)、糖尿病伴合并症组(CDM组)。
1.1.2 对照组(NC组) 选择性别、年龄相仿，门诊体格检查健康的人员30例，其中男性15例,女性15例，年龄53.7±12.0岁(34～68岁)。
1.2 标本采集及测定
1.2.1 标本采集 所有的血样为清晨空腹静脉采血，采血时均无泌尿系感染或其他肾病，无服用利尿剂或血管活性药物，及时分离血浆后，-20℃冻存待测。
, http://www.100md.com 1.2.2 NO3-/NO2-的测定 参照文献[4]，取血浆0.3 ml,加5%NaOH 0.2 ml和5%ZnSO4 1 ml,混匀静置，30 min后离心去蛋白。取上清液1 ml，加入甘氨酸-NaOH缓冲液1.4 ml和新镀铜镉颗粒3 g,室温下震荡还原2.5 h。取还原液2 ml,加入Griess试剂2 ml,在30℃恒温水浴箱中反应10 min,在546 nm波长下比色。以系列浓度的亚硝酸钠作出标准曲线，根据待测标本的吸光度可以从曲线中求出待测标本NO3-/NO2-的浓度。
1.2.3 LPO的测定 取血浆(血清)0.5 ml，加蒸馏水1.5 ml，混匀，后加10%三氯醋酸2.0 ml,1%TBA显色液1.0 ml，混匀。在100℃水浴中加热30 min，冷却，加正丁醇2.0 ml。在SK-I快速混匀器(江苏医疗仪器厂)中混匀2 min后，3500 r/min离心10 min。上清液在530 nm波长下比色,结果以nmol/ml血浆表示。
, 百拇医药
1.2.4 SOD(Cu-Zn)的测定 取一定量的肝素抗凝血，离心去除血浆及白细胞。在压积红细胞中加冷蒸馏水使之溶血,然后加入氯仿酒精混合液，充分混匀，3500 r/min离心10 min。吸取上清液按Pyrogallol-NBT法测定SOD酶活力。酶活力单位是指在1.0 ml反应液中每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为1个活力单位，结果以U/g Hb表示。
1.3 数据的统计分析 收集的数据采用统计软件EPI 6.0进行分析处理，所有结果以均数±标准差表示。各组均数间行t检验，患者血NO与LPO、SOD各参数间行单因素相关分析。
2 结 果
2.1 临床资料和血清生化指标 二个病例组与对照组之间在年龄、性别分布上无显著差别(表1)。临床常规血清生化指标，除了病例组空腹血糖浓度明显高于对照组4.5 mmol/L外，其他无显著性差别(P>0.05)(资料未显示)。
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表1 各组性别、年龄分布 组别
n
男
女
年龄(岁)
NC
30
15
15
53.70±12.00
SDM
60
33
, 百拇医药
27
50.52±15.32
CDM
43
17
26
58.13±14.64
NC:对照组; SDM:单纯糖尿病组; CDM:糖尿病伴并发症组(下表同).
2.2 病例组和对照组的NO、LPO、SOD水平(表2) 二个病例组较对照组的NO明显增高(P<0.01)，虽然CDM组NO较SDM组稍高，但差异无显著性(P>0.05)，二个病例组的LPO均显著高于对照组(P<0.01)。SDM组及CDM组的SOD水平显著低于对照组(P<0.01)。
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表2 糖尿病患者NO、LPO和SOD的水平 组别
NO(μmol/L)
LPO(nmol/mL)
SOD(U/g Hb)
NC
37.41±15.4
3.85±0.82
1184.70±120.3
SDM
55.89±19.53**
4.64±0.94**
, http://www.100md.com
970.03±175.59**
CDM
56.52±18.71**
4.73±1.09*
962.21±173.63**
*:P<0.05, **:P<0.01.
2.3 病例组NO的变化与各参数、LPO、SOD的相关分析 NO、LPO、SOD水平的变化与年龄、性别无关，NO与LPO、SOD的相关系数分别为0.988和0.054。
3 讨 论
3.1 NO与糖尿病的关系 NO是1980年Furchgott等[5]发现由血管内皮细胞释放的一种细胞因子，近20年的研究证实，它兼有第二信使和神经递质功能，广泛参与多种生物功能调节，与许多疾病的发生发展有密切的关系。由于NO在体内极不稳定，目前常采用测定其代谢产物(NO3-/NO2-)，以间接反映体内NO的含量。从糖尿病病人及实验动物糖尿病模型观察到，糖尿病患者/动物内皮依赖性血管舒张功能随病程的进展呈进行性的减低，推测与NO水平的变化有关[1，6]。本研究结果表明，无论糖尿病患者是否伴有并发症，他们体内的NO水平都显著升高，与文献报道一致[3，7]。本实验提示NO的水平变化可能不是由于生成的增多，而是NO的稳定性下降，灭活增快。由于灭活的加快，身体代偿性的促进NO分泌，因而测得的NO代谢产物增加。NO代谢失调的结果，可能一方面改变NO的相对水平，引起内皮依赖性血管舒张障碍，另一方面，体内NO与过氧化物反应生产对血管内壁有毒性作用的ONOO-堆积，引起血管内皮损伤，加快糖尿病患者血管的硬化，促使糖尿病并发症的产生，推测NO的变化与糖尿病病程的进展、并发症的出现有一定的关系。
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3.2 糖尿病患者体内的氧化-抗氧化状态 文献报道红细胞抗氧化酶活性可反映机体清除自由基的能力。本实验资料显示，糖尿病患者在并发症出现之前，体内的抗氧化酶类SOD的含量就已经明显降低。由于抗氧化系统含量的降低导致氧化与抗氧化之间的动态平衡失调。由于抗氧化能力的降低，未能及时有效地清除O2-，引发自由基生产的一级反应，减少羟自由基的生产，以及生产的脂氢过氧化物(LOOH)未能进一步还原，以减少由LOOH引发的二级反应，最终导致LPO生产的增加，后者对细胞膜有损伤作用。有报道抗氧化剂能够部分或全部的恢复糖尿病患者血管受损的舒张功能[8]。
3.3 潜在的临床意义 本研究资料表明，在糖尿病患者体内存在NO、LPO、SOD含量的变化，可能与糖尿病内皮依赖性血管舒张障碍、病程进展、并发症的产生有关。笔者注意到，许多病人是为并发症到医院就诊时发现患有糖尿病的，追溯病史时了解到患病已有一段时间。所以加强糖尿病的宣传，提高公众对糖尿病防治意识，早期发现、及时治疗，减少并发症发生。在糖尿病的治疗上，除了控制血糖、控制或治疗其他心血管疾病的危险因素外，抗氧化治疗值得进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 McVeigh GE,Brennan GM,Johnston GD,et al. Impaired endothelium-dependent and independent vasodilation in patients with type 2(non-insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetologia, 1992;35:771
2 缪 珩,鲁一兵，刘 云,等. NIDDM患者血清中一氧化氮水平的变化. 中华内分泌代谢杂志， 1997；13：58
3 张胜兰，邢万佳，晏 辉,等. 糖尿病肾病病人血中一氧化氮的变化与内皮素水平的观察. 中国糖尿病杂志， 1997；5：211
4 郑 辉，颜苹苹，蔡文秀,等. 血清一氧化氮测定方法. 福建医科大学学报, 1997；31：452
, 百拇医药
5 Furchgott RF,Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, 1980;288:373
6 Williams SB,Cusco JA,Roddy MA,et al. Impaired nitric oxide mediated vasodilation in non-insulin dependent diabetes. J Am Coll Cariol, 1996;27:567
7 Bank N,Aynejian HS. The role of EDRF(nitric oxide) in diabetic renal hyperfiltration. Kidney Int, 1993;43:1190
8 Ting HH,Timimi FK,Boles KS. Vitamin C improves endothelium-dependent diabetes mellitus. J Clin Inves, 1996;97:22
(收稿：1999—07—07 修回：1999—11—08), 百拇医药
单位：郑辉，吴长珠，刘友尧，黄伟民：福建医科大学生物化学教研室(福州 350004)；王中心：福建医科大学附属第一医院内分泌科
关键词：糖尿病；一氧化氮；脂质过氧化物；过氧化物歧化酶
福建医科大学学报990412
目的 探讨患有Ⅱ型单纯糖尿病/或伴并发症的糖尿病患者血中一氧化氮(NO)的代谢产物NO3-/NO2-的水平与脂质过氧化物(LPO)、过氧化物歧化酶(SOD)的变化以及相互关系。 方法 采用Griess 法、TBA比色法、NBT比色法测定103例Ⅱ型糖尿病患者血中NO的代谢产物NO3-/NO2-的水平与LPO、SOD水平，数据用统计学软件EPI 6.0分析处理。 结果 单纯糖尿病(SDM)组、糖尿病伴并发症(CDM)组的NO、LPO水平较对照(NC)组有显著升高，而2个病例组的SOD水平较对照组明显降低(P<0.01)。 结论 Ⅱ型糖尿病患者体内NO水平升高，患者体内抗氧化能力减弱，机体存在氧化-抗氧化系统失调，可能与NO的灭活加快、内皮依赖性舒张障碍有关。
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Circulating Nitric Oxide,Lipid Peroxide and Superoxide
Dismutase in Patients with Diabetes Mellitus Type Ⅱ and
its Clinical Significance
Zheng Hui1, Wang Zhongxin2, Wu Changzhu1, et al
(1. Department of Biochemistry, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004
2. Department of Endocrine, The Affiliated 1st Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou, 350005)
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Objective To evaluate circulating nitric oxide(NO),lipid peroxide(LPO) and superoxide dismutase(SOD) in healthy subjects and patients suffering from diabetes mellitus(DM) type Ⅱ with or without compications,explore their implications of these changes on the course of DM. Methods Circulating NO,LPO and SOD were measured in the ways of Griess,TBA,NBT. Data collected were analyzed with software EPI version 6.0. Results The mean plasma levels of NO and LPO in DM patients with or without complications were significant higher than healthy control group,and their SOD level was significant lower(P<0.01). Conclusion The evidences mentioned above indicate that there exists an imbalance of oxidant-antioxidant system,which may contribute to the quenching of plasma NO,and may be associated with development of its complications,especially microvascular complications.
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Key words diabetes； nitric oxide; lipid peroxide; superoxide dismutase
在慢性、持续高血糖的刺激下，糖尿病患者大小血管易于发生血管性病变，如高血压、肾病、视网膜病变，它们也是引起糖尿病患者发病死亡的最常见的原因，但是究竟血管性病变是如何发生的，其中的发生发展机制目前尚不明确。研究表明，非胰岛素依赖型糖尿病病人由血管内皮调控的血管舒张机能受到破坏，推测与血管内皮细胞产生的一氧化氮(NO)水平失调有关[1]。国外通过测定加入NO合成剂或抑制剂后，血流动力学方面的反应证实了NO在其中的作用[1]。国内也有报道糖尿病患者血中NO水平的变化[2，3]。由于体内NO极不稳定，以NO代谢产物硝酸盐NO3-和NO2-的总量(NO3-/NO2-)来间接反映NO的水平，是目前国内外普遍采用的方法。笔者通过同时测定糖尿病患者血中NO的代谢产物硝酸盐NO3-/NO2-与脂质过氧化物(LPO)、过氧化物歧化酶SOD水平，分析它们之间的关系，探讨其对糖尿病的发生发展的影响以及临床意义。
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1 对象和方法
1.1 对象
1.1.1 病例组 Ⅱ型糖尿病患者103例，按1985年WHO诊断和分类标准确诊，男性52例，女性51例，年龄53.6±15.5岁(11～77岁)。根据其有无并发症分二组，单纯糖尿病组(SDM组)、糖尿病伴合并症组(CDM组)。
1.1.2 对照组(NC组) 选择性别、年龄相仿，门诊体格检查健康的人员30例，其中男性15例,女性15例，年龄53.7±12.0岁(34～68岁)。
1.2 标本采集及测定
1.2.1 标本采集 所有的血样为清晨空腹静脉采血，采血时均无泌尿系感染或其他肾病，无服用利尿剂或血管活性药物，及时分离血浆后，-20℃冻存待测。
, http://www.100md.com 1.2.2 NO3-/NO2-的测定 参照文献[4]，取血浆0.3 ml,加5%NaOH 0.2 ml和5%ZnSO4 1 ml,混匀静置，30 min后离心去蛋白。取上清液1 ml，加入甘氨酸-NaOH缓冲液1.4 ml和新镀铜镉颗粒3 g,室温下震荡还原2.5 h。取还原液2 ml,加入Griess试剂2 ml,在30℃恒温水浴箱中反应10 min,在546 nm波长下比色。以系列浓度的亚硝酸钠作出标准曲线，根据待测标本的吸光度可以从曲线中求出待测标本NO3-/NO2-的浓度。
1.2.3 LPO的测定 取血浆(血清)0.5 ml，加蒸馏水1.5 ml，混匀，后加10%三氯醋酸2.0 ml,1%TBA显色液1.0 ml，混匀。在100℃水浴中加热30 min，冷却，加正丁醇2.0 ml。在SK-I快速混匀器(江苏医疗仪器厂)中混匀2 min后，3500 r/min离心10 min。上清液在530 nm波长下比色,结果以nmol/ml血浆表示。
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1.2.4 SOD(Cu-Zn)的测定 取一定量的肝素抗凝血，离心去除血浆及白细胞。在压积红细胞中加冷蒸馏水使之溶血,然后加入氯仿酒精混合液，充分混匀，3500 r/min离心10 min。吸取上清液按Pyrogallol-NBT法测定SOD酶活力。酶活力单位是指在1.0 ml反应液中每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为1个活力单位，结果以U/g Hb表示。
1.3 数据的统计分析 收集的数据采用统计软件EPI 6.0进行分析处理，所有结果以均数±标准差表示。各组均数间行t检验，患者血NO与LPO、SOD各参数间行单因素相关分析。
2 结 果
2.1 临床资料和血清生化指标 二个病例组与对照组之间在年龄、性别分布上无显著差别(表1)。临床常规血清生化指标，除了病例组空腹血糖浓度明显高于对照组4.5 mmol/L外，其他无显著性差别(P>0.05)(资料未显示)。
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表1 各组性别、年龄分布 组别
n
男
女
年龄(岁)
NC
30
15
15
53.70±12.00
SDM
60
33
, 百拇医药
27
50.52±15.32
CDM
43
17
26
58.13±14.64
NC:对照组; SDM:单纯糖尿病组; CDM:糖尿病伴并发症组(下表同).
2.2 病例组和对照组的NO、LPO、SOD水平(表2) 二个病例组较对照组的NO明显增高(P<0.01)，虽然CDM组NO较SDM组稍高，但差异无显著性(P>0.05)，二个病例组的LPO均显著高于对照组(P<0.01)。SDM组及CDM组的SOD水平显著低于对照组(P<0.01)。
, http://www.100md.com
表2 糖尿病患者NO、LPO和SOD的水平 组别
NO(μmol/L)
LPO(nmol/mL)
SOD(U/g Hb)
NC
37.41±15.4
3.85±0.82
1184.70±120.3
SDM
55.89±19.53**
4.64±0.94**
, http://www.100md.com
970.03±175.59**
CDM
56.52±18.71**
4.73±1.09*
962.21±173.63**
*:P<0.05, **:P<0.01.
2.3 病例组NO的变化与各参数、LPO、SOD的相关分析 NO、LPO、SOD水平的变化与年龄、性别无关，NO与LPO、SOD的相关系数分别为0.988和0.054。
3 讨 论
3.1 NO与糖尿病的关系 NO是1980年Furchgott等[5]发现由血管内皮细胞释放的一种细胞因子，近20年的研究证实，它兼有第二信使和神经递质功能，广泛参与多种生物功能调节，与许多疾病的发生发展有密切的关系。由于NO在体内极不稳定，目前常采用测定其代谢产物(NO3-/NO2-)，以间接反映体内NO的含量。从糖尿病病人及实验动物糖尿病模型观察到，糖尿病患者/动物内皮依赖性血管舒张功能随病程的进展呈进行性的减低，推测与NO水平的变化有关[1，6]。本研究结果表明，无论糖尿病患者是否伴有并发症，他们体内的NO水平都显著升高，与文献报道一致[3，7]。本实验提示NO的水平变化可能不是由于生成的增多，而是NO的稳定性下降，灭活增快。由于灭活的加快，身体代偿性的促进NO分泌，因而测得的NO代谢产物增加。NO代谢失调的结果，可能一方面改变NO的相对水平，引起内皮依赖性血管舒张障碍，另一方面，体内NO与过氧化物反应生产对血管内壁有毒性作用的ONOO-堆积，引起血管内皮损伤，加快糖尿病患者血管的硬化，促使糖尿病并发症的产生，推测NO的变化与糖尿病病程的进展、并发症的出现有一定的关系。
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3.2 糖尿病患者体内的氧化-抗氧化状态 文献报道红细胞抗氧化酶活性可反映机体清除自由基的能力。本实验资料显示，糖尿病患者在并发症出现之前，体内的抗氧化酶类SOD的含量就已经明显降低。由于抗氧化系统含量的降低导致氧化与抗氧化之间的动态平衡失调。由于抗氧化能力的降低，未能及时有效地清除O2-，引发自由基生产的一级反应，减少羟自由基的生产，以及生产的脂氢过氧化物(LOOH)未能进一步还原，以减少由LOOH引发的二级反应，最终导致LPO生产的增加，后者对细胞膜有损伤作用。有报道抗氧化剂能够部分或全部的恢复糖尿病患者血管受损的舒张功能[8]。
3.3 潜在的临床意义 本研究资料表明，在糖尿病患者体内存在NO、LPO、SOD含量的变化，可能与糖尿病内皮依赖性血管舒张障碍、病程进展、并发症的产生有关。笔者注意到，许多病人是为并发症到医院就诊时发现患有糖尿病的，追溯病史时了解到患病已有一段时间。所以加强糖尿病的宣传，提高公众对糖尿病防治意识，早期发现、及时治疗，减少并发症发生。在糖尿病的治疗上，除了控制血糖、控制或治疗其他心血管疾病的危险因素外，抗氧化治疗值得进一步探讨。
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参考文献
1 McVeigh GE,Brennan GM,Johnston GD,et al. Impaired endothelium-dependent and independent vasodilation in patients with type 2(non-insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetologia, 1992;35:771
2 缪 珩,鲁一兵，刘 云,等. NIDDM患者血清中一氧化氮水平的变化. 中华内分泌代谢杂志， 1997；13：58
3 张胜兰，邢万佳，晏 辉,等. 糖尿病肾病病人血中一氧化氮的变化与内皮素水平的观察. 中国糖尿病杂志， 1997；5：211
4 郑 辉，颜苹苹，蔡文秀,等. 血清一氧化氮测定方法. 福建医科大学学报, 1997；31：452
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5 Furchgott RF,Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, 1980;288:373
6 Williams SB,Cusco JA,Roddy MA,et al. Impaired nitric oxide mediated vasodilation in non-insulin dependent diabetes. J Am Coll Cariol, 1996;27:567
7 Bank N,Aynejian HS. The role of EDRF(nitric oxide) in diabetic renal hyperfiltration. Kidney Int, 1993;43:1190
8 Ting HH,Timimi FK,Boles KS. Vitamin C improves endothelium-dependent diabetes mellitus. J Clin Inves, 1996;97:22
(收稿：1999—07—07 修回：1999—11—08), 百拇医药