噬菌体抗体库的构建及抗肝癌抗体的筛选*
作者：谢捷明 许建华 赵 蓉 林国平 林 敏
单位：福建医科大学(福州 350004) 谢捷明，赵蓉，林国平，林敏：肿瘤研究室；许建华：临床药理研究所
关键词：噬菌体抗体库；抗体，单克隆；肝肿瘤
福建医科大学学报990401
目的 构建噬菌体抗体库及筛选抗人肝癌特异性噬菌体抗体。 方法 以RT-PCR法从经Bel7404细胞免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白的Fd段及к链基因，克隆到表达载体pCOMB3H -SS中并将抗体Fab段表达于单链噬菌体表面，构建噬菌体抗体库；以Bel7404细胞为抗原对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选，挑取部分克隆检测与抗原的结合活性。 结果 建成容量为2×106CFU的噬菌体抗体库，在亲和筛选过程中，噬菌体收获率逐轮得到提高，第4轮为第一轮的245倍，含Fab基因的克隆比率也由26%增到83%，挑取的10个克隆中有8个与Bel7404细胞有结合活性。 结论 噬菌体抗体库技术系高效筛选体系，为肿瘤单克隆抗体的制备提供了有效的途径。
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Cloning of Anti-liver Cancer Monoclonal Antibodies
from Phage Antibody Library
Xie Jieming1， Xu Jianhua2， Zhao Rong1，et al
(1.Department of Cancer Research, 2.Institue of Clinical Pharmacology，Fujian Medical University， Fuzhou， 350004)
Objective To construct a phage antibody library and select specific phage antibodies against human liver cancer from the library. Methods RT-PCR was used to amplified immunnoglobulin heavy chain Fd genes and κ chain genes from spleen lymphocytes of BALB/C mice immunized with human liver cancer cell line Bel7404. These genes were recombined with vector pCOMB3H-SS and Fab fragment were displayed on filamentous phage to construct a phage antibody library. After four rounds of selection against Bel7404 cell,some clone were isolated for detect the binding capacity. Results A phage antibody library with a repertoire of 2×106 CFU was constructed. From the 1st round to the 4th round of the panning，the number of the eluted phages had increased 245 times and the rate of the clones containing Fab genes was raised from 25% to 83%. Eight of the ten clones exhibited Bel7404 cell binding capacity. All these indicated that the specific phage antibodies had been enriched during the panning. Conclusion The technology of phage antibody library was a high selective system，which could serve as a new useful method in the production of McAbs toward human cancer.
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Key words phage antibody library； antibodies，monoclonal； liver cancer
噬菌体抗体库技术是90年代初发展起来的基因工程抗体技术[1，2]。用基因克隆技术将B淋巴细胞全套可变区基因克隆出来，组装到表达载体内，并表达到噬菌体表面，成为噬菌体抗体的群体，即噬菌体抗体库。本文以人肝癌细胞为免疫原，通过该技术构建抗人肝癌的噬菌体抗体库，并对该库进行初步筛选。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株、细胞及主要试剂 表达载体噬菌粒pCOMB3H-SS、大肠杆菌XL1-Blue、辅助病毒VCSM13均为北京市肿瘤防治研究所赠送。肝癌细胞株Bel7404为本室保存。限制性核酸内切酶Sac I、Xba I、Spe I、Xho I，T4DNA连接酶，禽源逆转录酶，寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸Oligo(dT)12～18，Taq酶，质粒提取试剂盒Wizard Plus SV Minipreps均为Promega公司产品。一步法RNA提取试剂 TriZOL购自GIBCO公司。
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1.2 引物 重链Fd段和к链引物设计按文献[3]。
1.3 电穿孔感受态细菌 按文献[4]制备。取40 μl感受态细菌，融化后加入pUC19(0.01 μg/ml)1 μl ,使用美国BRL的cell-porator E.coli electroporation system按产品说明书进行电穿孔。转化率>1013CFU/μg者可用于建库。
1. 4 动物免疫和脾细胞总RNA的提取 1×107个Bel7404细胞腹腔注射免疫6周龄的BALB/C雌性小鼠，3周后再次免疫，间隔1个月后加强免疫，末次免疫后3天处死小鼠取脾。用TriZOL试剂提取脾细胞总RNA(按说明书进行)。
1.5 RT-PCR扩增Fd段和κ链基因 参考文献[5]。Fd段和κ链PCR产物分别用琼脂糖电泳分离，并经电洗脱纯化回收。
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1.6 噬菌体抗体库的构建 将κ链PCR产物和pCOMB3H-SS分别用Sac I+Xba I消化，经琼脂糖电泳分离和电洗脱纯化，取载体片段1.4 μg与κ链片段0.45 μg在T4DNA连接酶反应体系200 μl中进行连接反应。经沉淀回收后电击转化感受态细菌，取少量铺盘测定，其余扩大培养，提取质粒，得到轻链库。再分别将轻链库与Fd段用Spe I+Xho I酶解后回收，按一定比例连接后电击转化感受态细菌，加入SOC 5 ml，37℃培养1 h后加入含50 μg/ml氨苄青霉素和10 μg/ml四环素的SB培养液100 ml中，37℃培养2 h，加入约1012噬菌斑形成单位(PFU)的辅助病毒VCSM13，继续培养过夜，离心收集上清，加PEG8000至4%，NaCl至3%，冰浴10 min，9000 r/min，4℃离心20 min，弃上清，用1%BSA-PBS溶液2 ml溶解沉淀，12000 r/min，离心5 min，弃去不溶性沉淀，所得上清即为噬菌体抗体库。
, 百拇医药
1.7 细菌集落直接PCR法鉴定 挑取单个细菌集落，悬浮于去离子水20 μl中，取5 μl为模板进行轻链或Fd段PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测相应的DNA扩增带。
1.8 噬菌体抗体库滴度测定 取经适当稀释的噬菌体抗体库1～10 μl加到新鲜培养的OD600=1的XL1-Blue菌液100 μl中，室温放置15 min后，铺氨苄青霉素培养盘，37℃培养过夜，计算菌落。
1.9 噬菌体抗体库的初步筛选 以1×107个肝癌细胞Bel7404为抗原,按文献[5]对所建噬菌体抗体库进行筛选，共4次。
1.10 噬菌体抗体的制备 挑取部分含有Fab基因表达载体的XLl-Blue菌落分别接种于含50 μg/ml氨苄青霉素和10 μg/ml四环素的SB培养液2 ml中，37℃培养2 h，加入VCSM13 30 μl ，37℃培养过夜，离心收上清，即为噬茵体抗体。
, 百拇医药
1.11 噬菌体抗体特异性的初步测试 接种适量Bel7404细胞于96孔培养板中，待细胞长满孔底后，用0.125%戊二醛固定，以3%BSA封闭非特异结合部位，每孔加上述噬菌体抗体50 μl，经0.05%吐温20-PBS洗涤后加辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体进行结合反应，并以OPD为底物显色。以VCSM13为阴性对照，测定孔ELISA OD值为阴性孔2.1倍以上者为阳性。
2 结 果
2.1 免疫脾细胞总RNA的提取和RT-PCR扩增Fd段和κ链基因 免疫血清与Bel7404细胞行ELISA测定，结果呈强阳性反应，说明有特异性抗体表达。用一步法试剂提取免疫脾细胞总RNA约800 μg。RT-PCR扩增Fd段和κ链基因，PCR产物经1%琼脂糖电泳检测，可在700 bp处见到明显的扩增带(图1)。分别经电洗脱纯化Fd段和κ链PCR产物，各约800μg。
, 百拇医药
图1 Fd段和κ基因的PCR扩增
M:λDNA EcoR I/HindⅢ Marker.
κ1、κ2：κ链PCR扩增产物.
Fd1、Fd2：Fd段PCR扩增产物.
2.2 轻键库的构建 κ链PCR产物和pCOMB3H-SS分别经Sac I+Xba I双酶切(图2)后连接成轻链库，电穿孔转化XL1-Blue细菌后取少量铺盘，测定库容量为1×106CFU。挑取16个菌落，使用直接PCR扩增法测定其基因重组率(图3)，有7个克隆可见到κ链扩增带，说明轻链重组率为7/16(44%)。
图2 噬菌粒pCOMB3H-SS酶切结果
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1.λDNA/HindⅢ Marker
2.pCOMB3H-SS Sac I+Xba I双酶切产物
图3 轻链库的细菌集落PCR鉴定
M:λDNA EcoR I/HindⅢ Marker1,2,3,10,11,14,16泳道在700 bp处有一扩增带.
2.3 噬菌体抗体库的构建 轻链库扩大培养后提取质粒行Spe l+Xhol双酶切(图4)后与Fd段双酶切片段连接，制备成噬菌体抗体库，测其库容量为2×106CFU。从培养盘中随机挑取16个集落，用PCR法快速筛选测定Fd重组率为8/16(50%)，同时含Fab基因的克隆比率为4/16(25%)。
, 百拇医药
图4 轻链库酶切结果
M:λDNA EcoR I/HindⅢ Marker
1.含κ链基因的pCOMB3H-SS Spe I+Xho I双酶切产物
2.含κ链基因的pCOMB3H-SS载体
2.4 噬菌体抗体库的筛选 以人肝癌细胞株Bel7404活细胞为固相抗原对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，将每一轮洗脱下来的噬菌体再感染XL1-Blue细菌，并取少量细菌铺盘，测定噬菌体滴度，计算每一轮筛选后噬菌体的收获率，结果见表1。噬菌体收获率由第1轮的(6.5×10-9)%增到第4轮的(1.6×10-6)%，共增加了245倍。最后一轮筛选后，取30个菌落分别进行PCR法扩增Fab基因，结果有25个克隆含有Fab基因，比率为25/30(83%)。挑取含Fab基因的4个菌落进行扩大培养，提取质粒后分别用Xba I+Sac I和Spe I+Xho I进行双酶解，琼脂糖电泳示它们均可放出约700 bp的条带(图5)，说明这些克隆均含有κ链基因和Fd段基因。
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图5 噬菌体抗体库的酶切鉴定
M：λDNA EcoR I/HindⅢ Marker
1～4泳道为4种含Fab基因pCOMB3H-SS Sac I+Xba I双酶切结果
5～8泳道为4种含Fab基因pCOMB3H-SS Spe I+Xho I双酶切结果
表1 Bel7404细胞对噬菌体抗体库的亲和富集效应 富集
次数
噬菌体滴度
噬菌体
收获率(%)
, 百拇医药 含Fab基因
克隆比率(%)
富集前
富集后
0
-
-
-
25
1
4.6×1012
3.0×104
6.5×10-9
, 百拇医药
-
2
1.5×1012
8.5×104
5.7×10-8
-
3
2.0×1012
1.5×106
7.5×10-7
-
, http://www.100md.com
4
2.5×1012
4.0×106
1.6×10-6
83
2.5 噬菌体抗体特异性的初步测试 取上述含Fab基因载体的克隆10个制备噬菌体抗体，以ELISA对Bel7404细胞进行测定，8个克隆(1～8)有结合活性(表2)。表2 噬菌体抗体与Bel7404细胞结合反应的ELISA测定 样 品
ELISA OD 值
阴性对照
, http://www.100md.com 0.09±0.02
1
2
3
4
5
0.54±0.03
0.44±0.03
0.35±0.03
0.34±0.05
0.32±0.02
6
7
, 百拇医药
8
9
10
0.29±0.04
0.26±0.03
0.24±0.04
0.18±0.01
0.15±0.03
3 讨 论
噬菌体抗体库技术是将全套可变区基因通过抗体片段(单链抗体或Fab段)表达在单链噬菌体的表面，使表型和基因型联系在一起，把识别抗原的能力和进行再扩增的能力结合在一起，成为高效的筛选体系。该技术省去了传统单抗制备中的细胞融合，甚至可以不经免疫，使单抗的制备变得简单易行，稳定有效。该技术尚可用来制备人单抗，是基因工程抗体技术的重大突破。 采用经免疫的脾细胞构建噬菌体抗体库，可增加特异性抗体的表达，有利于筛选。文献报道的多用可溶性抗原进行筛选，有人[3]用乳腺癌细胞为抗原进行筛选获得较为满意的结果。本文用Bel7404细胞为抗原构建了抗人肝癌的噬菌体抗体库，库容量为2×106CFU，以Bel7404细胞对该抗体库进行4轮筛选。在“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程中，虽然洗涤次数由第1轮的1次增到第4轮的10次，但回收的噬菌体比率却逐渐增加，4轮共增加了245倍。在洗脱下来的噬菌体中，含Fab基因的克隆比率也得到明显提高(由筛选前的25%增到筛选后的83%)。最后一轮筛选后挑取10个克隆制备成噬菌体抗体，其中8个与Bel7404细胞有结合活性。这些都证实了特异性噬菌体抗体在筛选过程中得到富集。用噬菌体抗体库技术制备肿瘤单抗不失为一种有效的方法。笔者将对所制备的抗体库进行进一步筛选和鉴定，以期获得理想的抗人肝癌细胞的噬菌体抗体及其可变区基因。
, 百拇医药
*:福建省自然科学基金资助课题(C97039)
参考文献
1 Winter G，Griffiths AD，Hawkins RE，et a1. Making antibodies by phage display technology. Annu Reu Immunol，1994；12:433
2 谢捷明，许建华. 噬菌体抗体库技术. 福建医科大学学报，1999；33:106
3 张广发，王 琰，王雅明，等. 噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选. 中华肿瘤杂志， 1995；17:258
4 J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇(著).金冬雁(译). 分子克隆实验指南(第2版). 北京:科学出版杜， 1996:50
5 王 琰，徐建军，励 跃，等. 抗胃癌鼠单抗3G9 Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达. 中华微生物学和兔疫学杂志， 1993；13：295
(收稿：1999-08-06 修回：1999-10-08), http://www.100md.com
单位：福建医科大学(福州 350004) 谢捷明，赵蓉，林国平，林敏：肿瘤研究室；许建华：临床药理研究所
关键词：噬菌体抗体库；抗体，单克隆；肝肿瘤
福建医科大学学报990401
目的 构建噬菌体抗体库及筛选抗人肝癌特异性噬菌体抗体。 方法 以RT-PCR法从经Bel7404细胞免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白的Fd段及к链基因，克隆到表达载体pCOMB3H -SS中并将抗体Fab段表达于单链噬菌体表面，构建噬菌体抗体库；以Bel7404细胞为抗原对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选，挑取部分克隆检测与抗原的结合活性。 结果 建成容量为2×106CFU的噬菌体抗体库，在亲和筛选过程中，噬菌体收获率逐轮得到提高，第4轮为第一轮的245倍，含Fab基因的克隆比率也由26%增到83%，挑取的10个克隆中有8个与Bel7404细胞有结合活性。 结论 噬菌体抗体库技术系高效筛选体系，为肿瘤单克隆抗体的制备提供了有效的途径。
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Cloning of Anti-liver Cancer Monoclonal Antibodies
from Phage Antibody Library
Xie Jieming1， Xu Jianhua2， Zhao Rong1，et al
(1.Department of Cancer Research, 2.Institue of Clinical Pharmacology，Fujian Medical University， Fuzhou， 350004)
Objective To construct a phage antibody library and select specific phage antibodies against human liver cancer from the library. Methods RT-PCR was used to amplified immunnoglobulin heavy chain Fd genes and κ chain genes from spleen lymphocytes of BALB/C mice immunized with human liver cancer cell line Bel7404. These genes were recombined with vector pCOMB3H-SS and Fab fragment were displayed on filamentous phage to construct a phage antibody library. After four rounds of selection against Bel7404 cell,some clone were isolated for detect the binding capacity. Results A phage antibody library with a repertoire of 2×106 CFU was constructed. From the 1st round to the 4th round of the panning，the number of the eluted phages had increased 245 times and the rate of the clones containing Fab genes was raised from 25% to 83%. Eight of the ten clones exhibited Bel7404 cell binding capacity. All these indicated that the specific phage antibodies had been enriched during the panning. Conclusion The technology of phage antibody library was a high selective system，which could serve as a new useful method in the production of McAbs toward human cancer.
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Key words phage antibody library； antibodies，monoclonal； liver cancer
噬菌体抗体库技术是90年代初发展起来的基因工程抗体技术[1，2]。用基因克隆技术将B淋巴细胞全套可变区基因克隆出来，组装到表达载体内，并表达到噬菌体表面，成为噬菌体抗体的群体，即噬菌体抗体库。本文以人肝癌细胞为免疫原，通过该技术构建抗人肝癌的噬菌体抗体库，并对该库进行初步筛选。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株、细胞及主要试剂 表达载体噬菌粒pCOMB3H-SS、大肠杆菌XL1-Blue、辅助病毒VCSM13均为北京市肿瘤防治研究所赠送。肝癌细胞株Bel7404为本室保存。限制性核酸内切酶Sac I、Xba I、Spe I、Xho I，T4DNA连接酶，禽源逆转录酶，寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸Oligo(dT)12～18，Taq酶，质粒提取试剂盒Wizard Plus SV Minipreps均为Promega公司产品。一步法RNA提取试剂 TriZOL购自GIBCO公司。
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1.2 引物 重链Fd段和к链引物设计按文献[3]。
1.3 电穿孔感受态细菌 按文献[4]制备。取40 μl感受态细菌，融化后加入pUC19(0.01 μg/ml)1 μl ,使用美国BRL的cell-porator E.coli electroporation system按产品说明书进行电穿孔。转化率>1013CFU/μg者可用于建库。
1. 4 动物免疫和脾细胞总RNA的提取 1×107个Bel7404细胞腹腔注射免疫6周龄的BALB/C雌性小鼠，3周后再次免疫，间隔1个月后加强免疫，末次免疫后3天处死小鼠取脾。用TriZOL试剂提取脾细胞总RNA(按说明书进行)。
1.5 RT-PCR扩增Fd段和κ链基因 参考文献[5]。Fd段和κ链PCR产物分别用琼脂糖电泳分离，并经电洗脱纯化回收。
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1.6 噬菌体抗体库的构建 将κ链PCR产物和pCOMB3H-SS分别用Sac I+Xba I消化，经琼脂糖电泳分离和电洗脱纯化，取载体片段1.4 μg与κ链片段0.45 μg在T4DNA连接酶反应体系200 μl中进行连接反应。经沉淀回收后电击转化感受态细菌，取少量铺盘测定，其余扩大培养，提取质粒，得到轻链库。再分别将轻链库与Fd段用Spe I+Xho I酶解后回收，按一定比例连接后电击转化感受态细菌，加入SOC 5 ml，37℃培养1 h后加入含50 μg/ml氨苄青霉素和10 μg/ml四环素的SB培养液100 ml中，37℃培养2 h，加入约1012噬菌斑形成单位(PFU)的辅助病毒VCSM13，继续培养过夜，离心收集上清，加PEG8000至4%，NaCl至3%，冰浴10 min，9000 r/min，4℃离心20 min，弃上清，用1%BSA-PBS溶液2 ml溶解沉淀，12000 r/min，离心5 min，弃去不溶性沉淀，所得上清即为噬菌体抗体库。
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1.7 细菌集落直接PCR法鉴定 挑取单个细菌集落，悬浮于去离子水20 μl中，取5 μl为模板进行轻链或Fd段PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测相应的DNA扩增带。
1.8 噬菌体抗体库滴度测定 取经适当稀释的噬菌体抗体库1～10 μl加到新鲜培养的OD600=1的XL1-Blue菌液100 μl中，室温放置15 min后，铺氨苄青霉素培养盘，37℃培养过夜，计算菌落。
1.9 噬菌体抗体库的初步筛选 以1×107个肝癌细胞Bel7404为抗原,按文献[5]对所建噬菌体抗体库进行筛选，共4次。
1.10 噬菌体抗体的制备 挑取部分含有Fab基因表达载体的XLl-Blue菌落分别接种于含50 μg/ml氨苄青霉素和10 μg/ml四环素的SB培养液2 ml中，37℃培养2 h，加入VCSM13 30 μl ，37℃培养过夜，离心收上清，即为噬茵体抗体。
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1.11 噬菌体抗体特异性的初步测试 接种适量Bel7404细胞于96孔培养板中，待细胞长满孔底后，用0.125%戊二醛固定，以3%BSA封闭非特异结合部位，每孔加上述噬菌体抗体50 μl，经0.05%吐温20-PBS洗涤后加辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体进行结合反应，并以OPD为底物显色。以VCSM13为阴性对照，测定孔ELISA OD值为阴性孔2.1倍以上者为阳性。
2 结 果
2.1 免疫脾细胞总RNA的提取和RT-PCR扩增Fd段和κ链基因 免疫血清与Bel7404细胞行ELISA测定，结果呈强阳性反应，说明有特异性抗体表达。用一步法试剂提取免疫脾细胞总RNA约800 μg。RT-PCR扩增Fd段和κ链基因，PCR产物经1%琼脂糖电泳检测，可在700 bp处见到明显的扩增带(图1)。分别经电洗脱纯化Fd段和κ链PCR产物，各约800μg。
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图1 Fd段和κ基因的PCR扩增
M:λDNA EcoR I/HindⅢ Marker.
κ1、κ2：κ链PCR扩增产物.
Fd1、Fd2：Fd段PCR扩增产物.
2.2 轻键库的构建 κ链PCR产物和pCOMB3H-SS分别经Sac I+Xba I双酶切(图2)后连接成轻链库，电穿孔转化XL1-Blue细菌后取少量铺盘，测定库容量为1×106CFU。挑取16个菌落，使用直接PCR扩增法测定其基因重组率(图3)，有7个克隆可见到κ链扩增带，说明轻链重组率为7/16(44%)。
图2 噬菌粒pCOMB3H-SS酶切结果
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1.λDNA/HindⅢ Marker
2.pCOMB3H-SS Sac I+Xba I双酶切产物
图3 轻链库的细菌集落PCR鉴定
M:λDNA EcoR I/HindⅢ Marker1,2,3,10,11,14,16泳道在700 bp处有一扩增带.
2.3 噬菌体抗体库的构建 轻链库扩大培养后提取质粒行Spe l+Xhol双酶切(图4)后与Fd段双酶切片段连接，制备成噬菌体抗体库，测其库容量为2×106CFU。从培养盘中随机挑取16个集落，用PCR法快速筛选测定Fd重组率为8/16(50%)，同时含Fab基因的克隆比率为4/16(25%)。
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图4 轻链库酶切结果
M:λDNA EcoR I/HindⅢ Marker
1.含κ链基因的pCOMB3H-SS Spe I+Xho I双酶切产物
2.含κ链基因的pCOMB3H-SS载体
2.4 噬菌体抗体库的筛选 以人肝癌细胞株Bel7404活细胞为固相抗原对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，将每一轮洗脱下来的噬菌体再感染XL1-Blue细菌，并取少量细菌铺盘，测定噬菌体滴度，计算每一轮筛选后噬菌体的收获率，结果见表1。噬菌体收获率由第1轮的(6.5×10-9)%增到第4轮的(1.6×10-6)%，共增加了245倍。最后一轮筛选后，取30个菌落分别进行PCR法扩增Fab基因，结果有25个克隆含有Fab基因，比率为25/30(83%)。挑取含Fab基因的4个菌落进行扩大培养，提取质粒后分别用Xba I+Sac I和Spe I+Xho I进行双酶解，琼脂糖电泳示它们均可放出约700 bp的条带(图5)，说明这些克隆均含有κ链基因和Fd段基因。
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图5 噬菌体抗体库的酶切鉴定
M：λDNA EcoR I/HindⅢ Marker
1～4泳道为4种含Fab基因pCOMB3H-SS Sac I+Xba I双酶切结果
5～8泳道为4种含Fab基因pCOMB3H-SS Spe I+Xho I双酶切结果
表1 Bel7404细胞对噬菌体抗体库的亲和富集效应 富集
次数
噬菌体滴度
噬菌体
收获率(%)
, 百拇医药 含Fab基因
克隆比率(%)
富集前
富集后
0
-
-
-
25
1
4.6×1012
3.0×104
6.5×10-9
, 百拇医药
-
2
1.5×1012
8.5×104
5.7×10-8
-
3
2.0×1012
1.5×106
7.5×10-7
-
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4
2.5×1012
4.0×106
1.6×10-6
83
2.5 噬菌体抗体特异性的初步测试 取上述含Fab基因载体的克隆10个制备噬菌体抗体，以ELISA对Bel7404细胞进行测定，8个克隆(1～8)有结合活性(表2)。表2 噬菌体抗体与Bel7404细胞结合反应的ELISA测定 样 品
ELISA OD 值
阴性对照
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1
2
3
4
5
0.54±0.03
0.44±0.03
0.35±0.03
0.34±0.05
0.32±0.02
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0.29±0.04
0.26±0.03
0.24±0.04
0.18±0.01
0.15±0.03
3 讨 论
噬菌体抗体库技术是将全套可变区基因通过抗体片段(单链抗体或Fab段)表达在单链噬菌体的表面，使表型和基因型联系在一起，把识别抗原的能力和进行再扩增的能力结合在一起，成为高效的筛选体系。该技术省去了传统单抗制备中的细胞融合，甚至可以不经免疫，使单抗的制备变得简单易行，稳定有效。该技术尚可用来制备人单抗，是基因工程抗体技术的重大突破。 采用经免疫的脾细胞构建噬菌体抗体库，可增加特异性抗体的表达，有利于筛选。文献报道的多用可溶性抗原进行筛选，有人[3]用乳腺癌细胞为抗原进行筛选获得较为满意的结果。本文用Bel7404细胞为抗原构建了抗人肝癌的噬菌体抗体库，库容量为2×106CFU，以Bel7404细胞对该抗体库进行4轮筛选。在“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程中，虽然洗涤次数由第1轮的1次增到第4轮的10次，但回收的噬菌体比率却逐渐增加，4轮共增加了245倍。在洗脱下来的噬菌体中，含Fab基因的克隆比率也得到明显提高(由筛选前的25%增到筛选后的83%)。最后一轮筛选后挑取10个克隆制备成噬菌体抗体，其中8个与Bel7404细胞有结合活性。这些都证实了特异性噬菌体抗体在筛选过程中得到富集。用噬菌体抗体库技术制备肿瘤单抗不失为一种有效的方法。笔者将对所制备的抗体库进行进一步筛选和鉴定，以期获得理想的抗人肝癌细胞的噬菌体抗体及其可变区基因。
, 百拇医药
*:福建省自然科学基金资助课题(C97039)
参考文献
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3 张广发，王 琰，王雅明，等. 噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选. 中华肿瘤杂志， 1995；17:258
4 J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇(著).金冬雁(译). 分子克隆实验指南(第2版). 北京:科学出版杜， 1996:50
5 王 琰，徐建军，励 跃，等. 抗胃癌鼠单抗3G9 Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达. 中华微生物学和兔疫学杂志， 1993；13：295
(收稿：1999-08-06 修回：1999-10-08), http://www.100md.com