标记抗人肝癌单克隆抗体SPIO对荷瘤裸鼠的定位诊断作用
作者：许乙凯 刘杏元 张嘉宁
单位：许乙凯 刘杏元 广州第一军医大学 南方医院影像中心；张嘉宁 第一军医大学 实验动物教研室 ,广东 广州 510515
关键词：肝癌；超顺磁性氧化铁粒子；磁共振成像
中国医学物理学杂志990422 摘要： 目的：探讨标记抗人肝癌单克隆抗体超顺磁性氧化铁粒子(McAb-SPIO)对荷瘤裸鼠模型的诊断作用。材料和方法：用过碘酸盐法将Hab-18抗人肝癌单抗标记到SPIO粒子；建立裸鼠载瘤模型(n=12只)。结果：实验组(n=8)从尾静脉注入0.3 mg Fe/20g的McAb-SPIO，给药后24小时成像观察到裸鼠瘤结均有选择性信号下降，对照组(n=4)在注射LgG-SPIO后未见明显信号改变。结论：McAb-SPIO磁共振免疫成像对肝癌的早期定性诊断有较高价值。
中图分类号：Q6-33 文献标识码：B
, 百拇医药
文章编号：1005-202X(1999)04-0260-03
Magnetic particles coated by monoclonal antibodies against human hepatocellular carcinoma for the diagnosis of nude mouse with liver tumor
XU Yi-kai, LIU Xing-yuan, ZHANG Jia-ning
( Medical Imaging Center, NanFang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
Abstract: Purpose:To explore The efficacy of MR antibody imaging with superparamagnetic iron oxide particles (SPIO) coated by Monoclonal Antibodies (McAb) in the diagnosis of nude mice carrying liver tumors. Materials and Methods: McAb against human hepatocellular carcinoma coating SPIO was achieved with periodate method. 12 nude mice with the tumor were established by subcutaneously injection of QGY-7723 hepatocellular carcinoma cell line. The tumor grew up about 0.5-1.0cm in diameter was harvested for further MR study.Results: After i.v. injection of 0.3 mg/20 g body weight of McAb-SPIO, heterogeneous specific signal reduction was noticed in experimental group (n=8), while no obvious signal intensity changes in the control group (n=4) were founded after injection of nonspecific lgG-SPIO . Conclusion: McAb-SPIO enhanced MR imaging is a promising way for early diagnosis of tiny hepaticellular carcinoma nodules.
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Key words: hepatocellular carcinoma; superparamagnetic iron oxide particle; magnetic resonance imaging.
超顺磁性氧化铁粒子(SPIO)的化学成分是Fe3O4纳米级晶体，具有极强磁性，在若干nmol/L的低浓度下就可引起磁共振信号的显著改变[1]。本文将尝试用抗人肝癌单克隆抗体(McAb)标记到SPIO上，用于裸鼠模型的肿瘤定向增强，现报道如下：
1 材料和方法
1.1 McAb来源及SPIO粒子的标记
McAb采用第四军医大学病理教研室制备的鼠源性抗人肝癌单抗(Hab18)，为lgG1亚型，经纯化后浓缩至10 mg/ml，无菌分装后置于-80℃冰箱存放。SPIO的制备及与McAb标记反应(高碘酸盐法)详见前文报道[2]，制备成的McAb-SPIO复合物通过DEAE离子交换拄(柱长45 cm)，进一步分离McAb-SPIO与McAb单体，再浓缩至含铁量为5 mgFe/ml于4℃保存备用(含铁量采用常规原子吸收光谱法测定)，其电镜下形态见(图1)。
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图1 McAb-SPIO电镜下所见(放大3万倍)。电子致密部分即为SPIO粒子，大小约5～30 nm，成簇分布
用同样方法制备出标记正常鼠lgG(非特异性)lgG-SPIO，同样浓缩至5 mgFe/ml，作为阴性对照。
1.2 McAb-SPIO免疫活性测定
向含有1 ml QGY-7723肝癌细胞的混悬液的2支试管内(细胞数为2×105个/ml)，分别加入0.5 ml McAb-SPIO和lgG-SPIO，于37℃孵育2小时，然后用生理盐水离心洗二次，再离心收集细胞沉淀，分别向各管加入65% HNO3(0.5 ml)和0.1 ml H2O2在100℃消化，用原子吸收光谱法测各管的含铁总量
1.3 标记前后SPIO的弛豫时间变化
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取内径0.5 cm试管，将McAb-SPIO按0，0.5，1.0，1.5 mg Fe/ml的浓度梯度配制；按同样浓度梯度配制一般SPIO液，同时置于我院Siemens Vision Plus MR 仪用头部线圈扫描(Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列，8个回波，TR=2000 ms，TE分别为14，28，......，112 ms)测定并比较标记前后SPIO各管的T2值(SPIO主要缩短T2值，对T1值影响小，故只测定T2值变化)。
1.4 肝癌裸鼠模型的建立及McAb-SPIO的定向增强作用
将QGY-7721肝癌细胞按7×106个/ml接种于6周龄鼠(n=12，由第一军医大学动物中心提供)颈部皮下，3周后肿瘤生长至0.5～0.8 cm。
实验前24小时裸鼠均从尾静脉注入墨汁0.5 ml，目的是预先封闭网状内皮系统，然后将动物分为二组，实验组8只分别从尾静脉注入0.3 mg Fe/20 g体重的McAb-SPIO，对照组4只则从尾静脉注入同样含铁量的lgG-SPIO，二组动物均分别在增强前及增强后第24小时行MR扫描，获T*2加权像(Turbo FLASH序列，是检测SPIO强化效应最敏感成像序列)，翻转角20°，TR 600 ms，TE 15 ms，层厚3 mm，矩阵256×256)，比较瘤灶信号强度变化。
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2 结果
2.1 McAb-SPIO的免疫活性估测
加入McAb-SPIO管内的含铁总量为1.9 mg，而对照管(加入LgG-SPIO)的含铁总量仅为0.3 mg，表明McAb-SPIO仍保持较高的免疫活性，与靶细胞(QGY-7723)有特异结合
2.2 标记前后SPIO对T2弛豫值影响(表1)
表1 标记前后SPIO对T2值(ms)影响 含铁量(mg/ml)
0
0.5
1
1.5
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SPIO
1000
678
447
280
McAb-SPIO
1018
692
433
286
配对t检验，二管T2值无显著差异(P>0.05)
从表上可见，标记McAb后对SPIO的造影效果无明显影响
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2.3 McAb-SPIO对裸鼠瘤灶的定向强化作用
裸鼠皮下瘤结在T2*加权像上均呈中等偏高或高信号，实验组注射McAb-SPIO后，瘤结信号强度多有轻、中度降低，表现出等或低信号(图2，3)。而对照组注射lgG-SPIO后，瘤结信号未见明显降低。
图2 T*2加权冠状像显示裸鼠皮下有类圆形高信号瘤结
图3 注射McAb-SPIO后24小时T*2加权像上，瘤结信号有所降低
3 讨论
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本文实验表明，在SPIO(一种顺磁性示踪剂)的外周包被单克隆抗体Hab18，经静脉输注后，SPIO粒子可以借抗原(肝癌组织细胞)和抗体的特异性结合逐渐浓聚在裸鼠肿瘤内部，由于SPIO粒子引起局部微观磁场的均匀性改变，导致氢质子横向弛豫的加快，T2值缩短，因此，在对磁化率效应(Susceptibility effect)敏感的磁共振梯度回波序列所获T2*加权像上，可以观察到肿瘤的信号强度出现特异性的变化，有助于肝脏肿瘤的定性诊断，同时这种方法也有可能应用到其它肿瘤的磁共振免疫成像实践[3]。
理论上，SPIO粒子虽具有比Gd元素更强的磁性，但SPIO粒子的体积较大，进入血循环后，容易受网状内皮系统的吞噬而被清除[4]，为了克服这一问题，我们静注适量的墨汁使裸鼠体内的网状内皮系统预先封闭，从而减少McAb-SPIO在循环到达瘤靶前的损失。尽管采取了上述措施，但增强前后瘤靶的信号变化仍不理想，原因可能与标记后抗体的免疫活性仍有一定损失有关，此外，寻找更加理想的顺磁性标志物也是今后改进的方向。
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本实验由于受到时间和条件的限制，未能就注射McAb-SPIO后瘤灶的动态增强时间曲线及最佳成像参数进行研究，这些均有待于今后进一步的探索。
参考文献：
1 Weissleder R. Papisov MI. Pharmaceutical iron oxides for MR imaging. Rev. Magn. Reson. Med. 1992; 4:1.
2 许乙凯，颜江华，张嘉宁,等.标记抗人肺癌单抗超顺磁性氧化铁粒子的磁共振免疫显像实验[J]，临床放射学杂志，1998；17(5)：310.
3 Tiefenauer LX, Kuhne G, Andres RY. Et al. Antibody-Magnetite nanoparticles: in vitro characterization of a potential tumor-specific contrast agent for Magnetic Resonance Imaging. Bioconjug. Chem 1993;4:347-352.
4 Bulte JWM, Hoekstra Y, Kamman RL et al Specific MR imaging of human lymphocyte by monoclonal antibody guided dextran-magnetite particles, Magn Reson Med 1992;52:148.
收稿日期：1999-04-10, 百拇医药
单位：许乙凯 刘杏元 广州第一军医大学 南方医院影像中心；张嘉宁 第一军医大学 实验动物教研室 ,广东 广州 510515
关键词：肝癌；超顺磁性氧化铁粒子；磁共振成像
中国医学物理学杂志990422 摘要： 目的：探讨标记抗人肝癌单克隆抗体超顺磁性氧化铁粒子(McAb-SPIO)对荷瘤裸鼠模型的诊断作用。材料和方法：用过碘酸盐法将Hab-18抗人肝癌单抗标记到SPIO粒子；建立裸鼠载瘤模型(n=12只)。结果：实验组(n=8)从尾静脉注入0.3 mg Fe/20g的McAb-SPIO，给药后24小时成像观察到裸鼠瘤结均有选择性信号下降，对照组(n=4)在注射LgG-SPIO后未见明显信号改变。结论：McAb-SPIO磁共振免疫成像对肝癌的早期定性诊断有较高价值。
中图分类号：Q6-33 文献标识码：B
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文章编号：1005-202X(1999)04-0260-03
Magnetic particles coated by monoclonal antibodies against human hepatocellular carcinoma for the diagnosis of nude mouse with liver tumor
XU Yi-kai, LIU Xing-yuan, ZHANG Jia-ning
( Medical Imaging Center, NanFang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
Abstract: Purpose:To explore The efficacy of MR antibody imaging with superparamagnetic iron oxide particles (SPIO) coated by Monoclonal Antibodies (McAb) in the diagnosis of nude mice carrying liver tumors. Materials and Methods: McAb against human hepatocellular carcinoma coating SPIO was achieved with periodate method. 12 nude mice with the tumor were established by subcutaneously injection of QGY-7723 hepatocellular carcinoma cell line. The tumor grew up about 0.5-1.0cm in diameter was harvested for further MR study.Results: After i.v. injection of 0.3 mg/20 g body weight of McAb-SPIO, heterogeneous specific signal reduction was noticed in experimental group (n=8), while no obvious signal intensity changes in the control group (n=4) were founded after injection of nonspecific lgG-SPIO . Conclusion: McAb-SPIO enhanced MR imaging is a promising way for early diagnosis of tiny hepaticellular carcinoma nodules.
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Key words: hepatocellular carcinoma; superparamagnetic iron oxide particle; magnetic resonance imaging.
超顺磁性氧化铁粒子(SPIO)的化学成分是Fe3O4纳米级晶体，具有极强磁性，在若干nmol/L的低浓度下就可引起磁共振信号的显著改变[1]。本文将尝试用抗人肝癌单克隆抗体(McAb)标记到SPIO上，用于裸鼠模型的肿瘤定向增强，现报道如下：
1 材料和方法
1.1 McAb来源及SPIO粒子的标记
McAb采用第四军医大学病理教研室制备的鼠源性抗人肝癌单抗(Hab18)，为lgG1亚型，经纯化后浓缩至10 mg/ml，无菌分装后置于-80℃冰箱存放。SPIO的制备及与McAb标记反应(高碘酸盐法)详见前文报道[2]，制备成的McAb-SPIO复合物通过DEAE离子交换拄(柱长45 cm)，进一步分离McAb-SPIO与McAb单体，再浓缩至含铁量为5 mgFe/ml于4℃保存备用(含铁量采用常规原子吸收光谱法测定)，其电镜下形态见(图1)。
, http://www.100md.com
图1 McAb-SPIO电镜下所见(放大3万倍)。电子致密部分即为SPIO粒子，大小约5～30 nm，成簇分布
用同样方法制备出标记正常鼠lgG(非特异性)lgG-SPIO，同样浓缩至5 mgFe/ml，作为阴性对照。
1.2 McAb-SPIO免疫活性测定
向含有1 ml QGY-7723肝癌细胞的混悬液的2支试管内(细胞数为2×105个/ml)，分别加入0.5 ml McAb-SPIO和lgG-SPIO，于37℃孵育2小时，然后用生理盐水离心洗二次，再离心收集细胞沉淀，分别向各管加入65% HNO3(0.5 ml)和0.1 ml H2O2在100℃消化，用原子吸收光谱法测各管的含铁总量
1.3 标记前后SPIO的弛豫时间变化
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取内径0.5 cm试管，将McAb-SPIO按0，0.5，1.0，1.5 mg Fe/ml的浓度梯度配制；按同样浓度梯度配制一般SPIO液，同时置于我院Siemens Vision Plus MR 仪用头部线圈扫描(Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列，8个回波，TR=2000 ms，TE分别为14，28，......，112 ms)测定并比较标记前后SPIO各管的T2值(SPIO主要缩短T2值，对T1值影响小，故只测定T2值变化)。
1.4 肝癌裸鼠模型的建立及McAb-SPIO的定向增强作用
将QGY-7721肝癌细胞按7×106个/ml接种于6周龄鼠(n=12，由第一军医大学动物中心提供)颈部皮下，3周后肿瘤生长至0.5～0.8 cm。
实验前24小时裸鼠均从尾静脉注入墨汁0.5 ml，目的是预先封闭网状内皮系统，然后将动物分为二组，实验组8只分别从尾静脉注入0.3 mg Fe/20 g体重的McAb-SPIO，对照组4只则从尾静脉注入同样含铁量的lgG-SPIO，二组动物均分别在增强前及增强后第24小时行MR扫描，获T*2加权像(Turbo FLASH序列，是检测SPIO强化效应最敏感成像序列)，翻转角20°，TR 600 ms，TE 15 ms，层厚3 mm，矩阵256×256)，比较瘤灶信号强度变化。
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2 结果
2.1 McAb-SPIO的免疫活性估测
加入McAb-SPIO管内的含铁总量为1.9 mg，而对照管(加入LgG-SPIO)的含铁总量仅为0.3 mg，表明McAb-SPIO仍保持较高的免疫活性，与靶细胞(QGY-7723)有特异结合
2.2 标记前后SPIO对T2弛豫值影响(表1)
表1 标记前后SPIO对T2值(ms)影响 含铁量(mg/ml)
0
0.5
1
1.5
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SPIO
1000
678
447
280
McAb-SPIO
1018
692
433
286
配对t检验，二管T2值无显著差异(P>0.05)
从表上可见，标记McAb后对SPIO的造影效果无明显影响
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2.3 McAb-SPIO对裸鼠瘤灶的定向强化作用
裸鼠皮下瘤结在T2*加权像上均呈中等偏高或高信号，实验组注射McAb-SPIO后，瘤结信号强度多有轻、中度降低，表现出等或低信号(图2，3)。而对照组注射lgG-SPIO后，瘤结信号未见明显降低。
图2 T*2加权冠状像显示裸鼠皮下有类圆形高信号瘤结
图3 注射McAb-SPIO后24小时T*2加权像上，瘤结信号有所降低
3 讨论
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本文实验表明，在SPIO(一种顺磁性示踪剂)的外周包被单克隆抗体Hab18，经静脉输注后，SPIO粒子可以借抗原(肝癌组织细胞)和抗体的特异性结合逐渐浓聚在裸鼠肿瘤内部，由于SPIO粒子引起局部微观磁场的均匀性改变，导致氢质子横向弛豫的加快，T2值缩短，因此，在对磁化率效应(Susceptibility effect)敏感的磁共振梯度回波序列所获T2*加权像上，可以观察到肿瘤的信号强度出现特异性的变化，有助于肝脏肿瘤的定性诊断，同时这种方法也有可能应用到其它肿瘤的磁共振免疫成像实践[3]。
理论上，SPIO粒子虽具有比Gd元素更强的磁性，但SPIO粒子的体积较大，进入血循环后，容易受网状内皮系统的吞噬而被清除[4]，为了克服这一问题，我们静注适量的墨汁使裸鼠体内的网状内皮系统预先封闭，从而减少McAb-SPIO在循环到达瘤靶前的损失。尽管采取了上述措施，但增强前后瘤靶的信号变化仍不理想，原因可能与标记后抗体的免疫活性仍有一定损失有关，此外，寻找更加理想的顺磁性标志物也是今后改进的方向。
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本实验由于受到时间和条件的限制，未能就注射McAb-SPIO后瘤灶的动态增强时间曲线及最佳成像参数进行研究，这些均有待于今后进一步的探索。
参考文献：
1 Weissleder R. Papisov MI. Pharmaceutical iron oxides for MR imaging. Rev. Magn. Reson. Med. 1992; 4:1.
2 许乙凯，颜江华，张嘉宁,等.标记抗人肺癌单抗超顺磁性氧化铁粒子的磁共振免疫显像实验[J]，临床放射学杂志，1998；17(5)：310.
3 Tiefenauer LX, Kuhne G, Andres RY. Et al. Antibody-Magnetite nanoparticles: in vitro characterization of a potential tumor-specific contrast agent for Magnetic Resonance Imaging. Bioconjug. Chem 1993;4:347-352.
4 Bulte JWM, Hoekstra Y, Kamman RL et al Specific MR imaging of human lymphocyte by monoclonal antibody guided dextran-magnetite particles, Magn Reson Med 1992;52:148.
收稿日期：1999-04-10, 百拇医药