嗜热吸水链霉菌抗体检测的临床意义
作者：黄汉菊 黄庆华 刘为民 刘绍春
单位：黄汉菊，黄庆华，刘为民(同济医科大学微生物学教研室，武汉430030)；刘绍春(同济医科大学病理学教研室)
关键词：农民肺；嗜热吸水链霉菌；免疫转印膜技术
临床检验杂志990412 自1932年Campbell首次报告5例“农民肺”以来，国内外学者对嗜热放线菌与呼吸道感染的关系进行了广泛的研究。我校于1982年在洪湖县1例农民肺死亡者家的铺草中分离出嗜热吸水链霉菌H9-4(Streptomyces thermohydroscopicus H9-4)，并以分离的感染菌和其代谢产物诱导分别制成兔和鼠实验性农民肺的动物模型[1]。经动物实验和临床观察，确认嗜热吸水链霉菌H9-4可引起过敏性肺泡炎，即“农民肺”。该病在临床诊断中有一定的困难，为此，我们探讨了免疫转印技术在临床早期诊断中的应用价值。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株与培养基 嗜热吸水链霉菌H9-4菌种，从湖北省洪湖地区农民肺死者铺草中分离出，并经中国科学院鉴定。Emerson液体培养基由本室配制，葡萄糖10 g，酵母粉5 g，牛肉膏4 g，蛋白胨4 g，NaCl 2.5 g加水1000 ml，高压蒸汽灭菌后加入过滤的微量无素(I、S、P微量元素每100 ml培养基中加入1 ml)。
1.2 待测病人血清 同济医院小儿科喘息性支气管炎患儿血清122份；正常儿童血清60份；潜江总口农场哮喘病人血清78份；巴东移民正常体检血清110份；同济医大职工体检血清100份。
1.3 酶标鼠抗人IgG单抗(军事医学科学院微生物流行病研究所提供)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备抗原 取嗜热吸水链霉菌H9-4菌种置入Emerson液体培养基中，经52°C振摇培养4天，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次，于-30°C反复冻融5次，超声粉碎后离心(15 000 r/min)，收集上清液浓缩即可作为抗原粗制品。
, 百拇医药
1.4.2 间接凝集试验 用“O”型醛化红细胞，经鞣化后载上上述裂解的H9-4 Ag，将病人血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀释，各取0.1 ml分别加入一次性Ⅴ型聚苯乙烯塑料板的凹孔内，然后每孔加入0.1 ml H9-4 Ag致敏的诊断血细胞悬液，置震荡器中震荡2分钟取出，置37°C湿盒中，2小时观察结果。以稀释倍数1∶32以上仍出现++血球凝集视为阳性患者。
1.4.3 对流免疫电泳 将H9-4 Ag，病人血清分别加入琼脂孔内，电泳40分钟后取出观察结果，以白色沉淀线清晰可见，视为阳性；若置6小时后，仍清晰可见视为强阳性。
1.4.4 免疫转印试验 将H9-4 Ag经SDS-PAGE(40 mA，100V)4小时电泳分离蛋白质条带后，再转印到硝酸纤维素膜上(50V，200 mA，8小时)。转印好的硝酸纤维膜置4°C冰箱内备用。将待检血清加在已转印的硝酸纤维膜上孵育2小时，然后用PBS-吐温洗3次，每次10分钟，再加上酶标抗人IgG抗体(1∶200)孵育2小时，洗3次后，经显色观察条带。
, 百拇医药
2 结果
结果见表1。
表1 三种方法检测结果的比较 分 组
血清
份数
间接凝集
对流电泳
免疫转印
阳性数
阳性率
(%)
阳性数
阳性率
, 百拇医药
(%)
阳性数
阳性率
(%)
喘息患儿(农村)
(城市)
62
25
40
25
48
21
33.8
, 百拇医药
60
18
30
18
36
14
23
正常儿童
60
5
8
5
11
3
, 百拇医药
5
潜江农场哮喘病人
78
50
64
50
70
45
57
巴东移民
110
1
0.9
, 百拇医药 0
0
同济医大职工
100
8
8
8
12
4
4
3 讨论
3.1 从三种试验方法比较，间接血凝试验以及对流电泳试验的假阳性率较高。只可以作为流行病学普查粗筛。而免疫转印技术操作方便、方法实用，且其免疫转印膜置4°C环境一年时间仍可使用[2]。该法证明的73 kD多肽是嗜热吸水链霉菌的主要抗原成分，该抗原的证实有助于农民肺的早期实验诊断。
, 百拇医药
3.2 本实验结果提示湖北省以嗜热吸水链霉菌为“农民肺”主要致病菌。值得提出的是“农民肺”的致病菌还有其他放线菌，因此其他地区实验室尚需使用相应的菌株作为对照比较研究。
参考文献
1 胡辉，朱景玉.热吸水链霉菌代谢产物诱导鼠实验农民肺的研究.同济医科大学学报，1989，1：20
2 车东媛，刘绍春，黄侠君，等.实验性农民肺光镜、电镜及免疫组化学研究.中华结核和呼吸系统疾病杂志，1986,9:236
(1998-10-28收稿，1999-03-15修回), 百拇医药
单位：黄汉菊，黄庆华，刘为民(同济医科大学微生物学教研室，武汉430030)；刘绍春(同济医科大学病理学教研室)
关键词：农民肺；嗜热吸水链霉菌；免疫转印膜技术
临床检验杂志990412 自1932年Campbell首次报告5例“农民肺”以来，国内外学者对嗜热放线菌与呼吸道感染的关系进行了广泛的研究。我校于1982年在洪湖县1例农民肺死亡者家的铺草中分离出嗜热吸水链霉菌H9-4(Streptomyces thermohydroscopicus H9-4)，并以分离的感染菌和其代谢产物诱导分别制成兔和鼠实验性农民肺的动物模型[1]。经动物实验和临床观察，确认嗜热吸水链霉菌H9-4可引起过敏性肺泡炎，即“农民肺”。该病在临床诊断中有一定的困难，为此，我们探讨了免疫转印技术在临床早期诊断中的应用价值。
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1 材料和方法
1.1 菌株与培养基 嗜热吸水链霉菌H9-4菌种，从湖北省洪湖地区农民肺死者铺草中分离出，并经中国科学院鉴定。Emerson液体培养基由本室配制，葡萄糖10 g，酵母粉5 g，牛肉膏4 g，蛋白胨4 g，NaCl 2.5 g加水1000 ml，高压蒸汽灭菌后加入过滤的微量无素(I、S、P微量元素每100 ml培养基中加入1 ml)。
1.2 待测病人血清 同济医院小儿科喘息性支气管炎患儿血清122份；正常儿童血清60份；潜江总口农场哮喘病人血清78份；巴东移民正常体检血清110份；同济医大职工体检血清100份。
1.3 酶标鼠抗人IgG单抗(军事医学科学院微生物流行病研究所提供)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备抗原 取嗜热吸水链霉菌H9-4菌种置入Emerson液体培养基中，经52°C振摇培养4天，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次，于-30°C反复冻融5次，超声粉碎后离心(15 000 r/min)，收集上清液浓缩即可作为抗原粗制品。
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1.4.2 间接凝集试验 用“O”型醛化红细胞，经鞣化后载上上述裂解的H9-4 Ag，将病人血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀释，各取0.1 ml分别加入一次性Ⅴ型聚苯乙烯塑料板的凹孔内，然后每孔加入0.1 ml H9-4 Ag致敏的诊断血细胞悬液，置震荡器中震荡2分钟取出，置37°C湿盒中，2小时观察结果。以稀释倍数1∶32以上仍出现++血球凝集视为阳性患者。
1.4.3 对流免疫电泳 将H9-4 Ag，病人血清分别加入琼脂孔内，电泳40分钟后取出观察结果，以白色沉淀线清晰可见，视为阳性；若置6小时后，仍清晰可见视为强阳性。
1.4.4 免疫转印试验 将H9-4 Ag经SDS-PAGE(40 mA，100V)4小时电泳分离蛋白质条带后，再转印到硝酸纤维素膜上(50V，200 mA，8小时)。转印好的硝酸纤维膜置4°C冰箱内备用。将待检血清加在已转印的硝酸纤维膜上孵育2小时，然后用PBS-吐温洗3次，每次10分钟，再加上酶标抗人IgG抗体(1∶200)孵育2小时，洗3次后，经显色观察条带。
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2 结果
结果见表1。
表1 三种方法检测结果的比较 分 组
血清
份数
间接凝集
对流电泳
免疫转印
阳性数
阳性率
(%)
阳性数
阳性率
, 百拇医药
(%)
阳性数
阳性率
(%)
喘息患儿(农村)
(城市)
62
25
40
25
48
21
33.8
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60
18
30
18
36
14
23
正常儿童
60
5
8
5
11
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5
潜江农场哮喘病人
78
50
64
50
70
45
57
巴东移民
110
1
0.9
, 百拇医药 0
0
同济医大职工
100
8
8
8
12
4
4
3 讨论
3.1 从三种试验方法比较，间接血凝试验以及对流电泳试验的假阳性率较高。只可以作为流行病学普查粗筛。而免疫转印技术操作方便、方法实用，且其免疫转印膜置4°C环境一年时间仍可使用[2]。该法证明的73 kD多肽是嗜热吸水链霉菌的主要抗原成分，该抗原的证实有助于农民肺的早期实验诊断。
, 百拇医药
3.2 本实验结果提示湖北省以嗜热吸水链霉菌为“农民肺”主要致病菌。值得提出的是“农民肺”的致病菌还有其他放线菌，因此其他地区实验室尚需使用相应的菌株作为对照比较研究。
参考文献
1 胡辉，朱景玉.热吸水链霉菌代谢产物诱导鼠实验农民肺的研究.同济医科大学学报，1989，1：20
2 车东媛，刘绍春，黄侠君，等.实验性农民肺光镜、电镜及免疫组化学研究.中华结核和呼吸系统疾病杂志，1986,9:236
(1998-10-28收稿，1999-03-15修回), 百拇医药