PCR-DGGE检测GCG-R基因第二外显子
作者：王玉明 段勇 宋滇平 赵淮 刘华 杨惠英
单位：昆明医学院第一附属医院检验科，昆明650032
关键词：胰高血糖素受体基因；变性梯度凝胶电泳；基因突变
PCR 摘要 糖尿病是一种与遗传有着密切联系，并危害人类健康的常见病和多发病。最近，国外有人发现胰高血糖素受体(GCG-R)基因上的一个错义突变与常见型非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)高度相关。本文应用聚合酶链反应一变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对200例无亲缘关系中国昆明地区汉族人的GCG-R基因第二外显子研究结果表明，所有研究对象均不存在错义突变。
Study a missense mutation in the glucagon receptor gene of exon 2 in NIDDM by PCR-DGGE
, 百拇医药
WANG Yuming,DUAN Yong,SONG Dianping,et al.
(First Affiliated of Kunming Medical College,Kunming 650032)
Abstract Diabete mellitus is a generically and recurrent disease which hazard the people's health,with relatively to heterogene.Lastest,oversea researchers had found that there is one missense mutation high relative with NIDDM patients in GCG-R gene. It was observed to 160 the Han peoples by PCR-DGGE in Kunming region of China,results showed that there were no missense mutation in all samples,so indicated the G1y40Ser missense mutation have not relation with NIDDM in Kunming region of China.
, 百拇医药
Key Words GCG-R; PCR-DGGE; Mutation
糖尿病是一种危害人类健康的常见病和多发病，居世界致残率、致死率第三位，其中90%左右为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，其发病不仅与环境因素有关，而且与遗传有着密切联系。最近，有人在对一组法兰西和撤丁岛NIDDM患者进行的研究中首次发现胰高糖素受体(Glucagon Receptor，GCG-R)基因第二外显子上的一个错义突变(Gly40/Ser)与NIDDM高度相关[1]。鉴于中国人GCG-R基因突变/变异与常见型NIDDM的关联情况尚无报道，本文旨在应用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析方法(PCR-DGGE)对中国云南昆明地区汉族人NIDDM患者之GCG-R基因第二外显子进行研究，探讨这一新的致病候选基因与中国人常见型NIDDM的关联情况。
1 材料和方法
1.1 主要仪器 PE9600基因扩增仪，BIO-RAD Power Pac 3000型电泳仪，D GENE System和Gel Doc 1000紫外检测系统。
, 百拇医药
1.2 研究对象 200例无亲缘关系的中国云南昆明地区汉族人为研究对象。其中根据WHO诊断标准确诊为NIDDM的患者120例(男47例，女73例，年龄38～77岁)；无糖尿病家族史的健康对照组80例(男32例，女48例，年龄34～75岁)。
1.3 基因扩增 用酚/氯仿法从人体外周血白细胞中提取DNA为模板[2]。根据Hager等文献报告[1]设计PCR引物，在下游引物的5′端加上40个只含GC碱基的片段：上游引物为5′-TGT CTG GTT GCT TGT GCA TG-3′和下游引物为5′CGC CGC CGC CGC CCG CGC CGC CGC CGC CCG CGC CGC CGC CGA AGA GAA CTC AGG AAG TGC-3′。扩增片段长度为196个碱基。在文献[3]基础上，对镁离子浓度和退火温度进行调整后，应用PCR技术扩增胰高血糖素受体基因的第二外显子。
, 百拇医药 1.4 变性凝胶电泳 在Fischman报告[4]的基础上，参照仪器说明书进行垂直和平行DGGE。
1.4.1 垂直DGGE 制备变性剂20%～80%(100%的变性剂为40 g/dl甲酰胺和7 mol/L尿素)，呈线性增加梯度，方向与电泳方向垂直，7.5 g/dl聚丙烯酰胺凝胶；样品为含有GC片段的PCR扩增产物100 μl和等量的载样缓冲液混合；电泳缓冲液温度60°C，电压130 V，时间4小时；电泳结束后用50 mg/ml溴乙锭，1×TAE染色10分钟，再用1×TAE缓冲液浸泡5分钟，以退去部分杂色。使用Gel Doc 1000紫外检测系统观察电泳结果。
1.4.2 平行DGGE 根据垂直DGGE结果选择平行DGGE的变性剂浓度范围，制备变性剂呈线性梯度增加，方向与电泳方向平行，7.5 g/dl聚丙烯酰胺凝胶；样品为10 μl PCR扩增产物和等量的载样缓冲液混合。除电泳时间进一步确定外，其余同“垂直DGGE”的条件。
, 百拇医药
2 结果
2.1 垂直DGGE 由于DNA系列是未知的，需进行垂直DGGE，以明确目的基因片段和电泳迁移率与变性剂的关系。垂直DGGE结果如图1所示的过度点的变性剂浓度为59%，选择40%～70%为对胰高血糖素受体基因的第二外显子进行平行DGGE的变性剂浓度范围。
2.2 电泳时间的确定 为探讨平行DGGE所需最适电泳时间，从电泳开始到结束，每间隔1 h顺序加入一份样品，共7次。根据电泳结果(图2)，选择趋于同一水平电泳区带中所需时间最少者5 h，为平行DGGE的最适电泳时间。
2.3 平行DGGE 经对120例常见型NIDDM患者和健康对照者80例的GCG-R基因第二外显子进行平行DGGE分析，电泳结果均只显示一条区带，表明所有研究对象不存在突变。电泳结果见图3。
, 百拇医药
Figure 1 Perpendicular denaturing gradient gel electrophoresis of GCG-R exon 2(20%～80% denaturant,the DNA fragment melts at a denaturing concentration of 59%)
图1 GCG-R第二外显子的垂直DGGE(变性剂浓度20%～80%，过度点的变性剂浓度为59%)
Figure 2 The best electrophoresis time of parallel DGGE of GCG-R exon 2(40%～70% denaturant,loading one sample per hour and total loaded 7.Lanes 5,6 and 7 in one level.)
, 百拇医药
图2 GCG-R第二外显子平行DGGE的最佳时间确定(变性剂浓度40%～70%，从电泳开始到结束，每间隔1 h顺序加入一份样品，共7次。其中区带5，6和7趋于一致)
Figure 3 Parallel denaturing gradient gel of GCG-R exon 2(40%～70% denaturant,lanes 1～5 are normal controls,lanes 6～16 are NIDDM patients)
图3 GCG-R第二外显子的平行DGGE(变性剂浓度40%～70%。区带1～5为正常对照，6～16为NIDDM患者)
3 讨论
, 百拇医药
DGGE是根据DNA解链特性，能可靠快速地检测含有一个碱基突变、长度达536 bp的DNA片段[4～6]的凝胶体系。在对目的基因片段进行PCR扩增时，把由30～50个GC碱基组成的寡核苷酸链加在其中一条引物的5′端，使扩增所获的DNA产物的一端只含GC碱基即GC-Clamp，为片段中Tm最高的区域，而其他部分由于所含碱基种类不同Tm值也不同，而且明显低于最高Tm值。把带有GC-Clamp DNA片段放入变性剂(尿素和甲酰胺)呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当它泳动达一定浓度变性剂时(此变性剂浓度的变性效果相当于DNA片段中具最低解链温度区域的Tm值)，双链DNA便发生部分解链。部分解链后的DNA分子呈分枝状使迁移速度明显减慢，几乎处于停顿状态。因而DNA片段中只要一个碱基变异，将影响碱基间的协同作用，导致Tm的改变，在不同变性剂浓度水平上发生部分解链而使泳动几乎停顿，达到检测DNA系列中点突变的目的。从而几乎能检测到所有的突变，达到较高的敏感性[7]。
在没有阳性对照的情况下，确定变性点是实验成功的关键。由于目的片段的长度和碱基的组成不同，其Tm值也不同，因此有必要确定变性点的变性剂浓度。一旦变性点确定后，选择适当的电泳时间也是实验所必须的。如果电泳时间过短，片段未泳动到变性点处，DNA双链不解链，达不到检查的目的；时间太长，会使解链的DNA离开变性点而重新复性。电泳时间应选择趋于同一水平电泳区带中所需时间最少者。
, http://www.100md.com
本文应用PCR-DGGE技术对无亲缘关系的中国云南昆明地区汉族人120例NIDDM患者和健康对照者80例的GCG-R基因第二外显子研究结果表明，所有研究对象均不存在突变，可推断不存在Gly40/Ser的错义突变，其结论与对日本人群的研究一致[8，9]。初步表明，在中国云南昆明地区汉族NIDDM患者GCG-R基因第二外显子Gly40/Ser错义突变与NIDDM不存在关联，同时第二外显子也不存在碱基的变异。
参考文献
1 Hager J,Henser L,Vaise C,et al. Amissense mutation in the glucagon receptor gene is associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature Genetic，1995，9：299
2 段勇，王玉明，赵淮，等.从血细胞快速抽提DNA的方法探讨.昆明医学院学报，1998，19(2)：28
, 百拇医药
3 王玉明，段勇，赵淮，等.变性梯度凝胶电泳中PCR实验条件探讨.临床检验杂志，1999，17(3)：159
4 Fischman S G,Lerman L S. DNA fragments differing by single base-pair substitution are separated in denaturing gradient gels:Correspondence with melting theory.Proc Natl Acad Sci，1983，80：1579
5 Hansen L H,Abrahamsen N,Hager J,et al. The Gly40Ser mutation in the human glucagon receptor gene as sociated with NIDDM results in a receptor with reduced sensitivity glucagon. Diabetes，1996，45：725
, 百拇医药
6 Myers R M,Lumelsky N,Lerman L S,et al. Detection of single base substitutions in total genomic DNA. Nature，1985，313：495
7 Sheffield V C, Cox D R,Lerman L S,et al. Attachment of a 40-base-pair G+C-rich sequence(GC-clamp)to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes.Proc Natl Acad Sci，1989，86：232
8 Ogata M. Iwasa ki N,Ohgaeara H,et al. Absence of the Gly40Ser mutation in the glucagon receptor gene in Japanese subjects with NIDDM. Diabetes Res Clin Pract，1996，33：71
9 Odawara M,Matsunuma A, Yaniashita K.Gly40Ser substitution in the glucagon receptor is rarely involved in the pathogenesis of NIDDM in Japanese patients.Diabetes Care，1996，19：547
(1998-11-10收稿，1999-02-09修回), http://www.100md.com
单位：昆明医学院第一附属医院检验科，昆明650032
关键词：胰高血糖素受体基因；变性梯度凝胶电泳；基因突变
PCR 摘要 糖尿病是一种与遗传有着密切联系，并危害人类健康的常见病和多发病。最近，国外有人发现胰高血糖素受体(GCG-R)基因上的一个错义突变与常见型非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)高度相关。本文应用聚合酶链反应一变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对200例无亲缘关系中国昆明地区汉族人的GCG-R基因第二外显子研究结果表明，所有研究对象均不存在错义突变。
Study a missense mutation in the glucagon receptor gene of exon 2 in NIDDM by PCR-DGGE
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WANG Yuming,DUAN Yong,SONG Dianping,et al.
(First Affiliated of Kunming Medical College,Kunming 650032)
Abstract Diabete mellitus is a generically and recurrent disease which hazard the people's health,with relatively to heterogene.Lastest,oversea researchers had found that there is one missense mutation high relative with NIDDM patients in GCG-R gene. It was observed to 160 the Han peoples by PCR-DGGE in Kunming region of China,results showed that there were no missense mutation in all samples,so indicated the G1y40Ser missense mutation have not relation with NIDDM in Kunming region of China.
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Key Words GCG-R; PCR-DGGE; Mutation
糖尿病是一种危害人类健康的常见病和多发病，居世界致残率、致死率第三位，其中90%左右为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，其发病不仅与环境因素有关，而且与遗传有着密切联系。最近，有人在对一组法兰西和撤丁岛NIDDM患者进行的研究中首次发现胰高糖素受体(Glucagon Receptor，GCG-R)基因第二外显子上的一个错义突变(Gly40/Ser)与NIDDM高度相关[1]。鉴于中国人GCG-R基因突变/变异与常见型NIDDM的关联情况尚无报道，本文旨在应用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析方法(PCR-DGGE)对中国云南昆明地区汉族人NIDDM患者之GCG-R基因第二外显子进行研究，探讨这一新的致病候选基因与中国人常见型NIDDM的关联情况。
1 材料和方法
1.1 主要仪器 PE9600基因扩增仪，BIO-RAD Power Pac 3000型电泳仪，D GENE System和Gel Doc 1000紫外检测系统。
, 百拇医药
1.2 研究对象 200例无亲缘关系的中国云南昆明地区汉族人为研究对象。其中根据WHO诊断标准确诊为NIDDM的患者120例(男47例，女73例，年龄38～77岁)；无糖尿病家族史的健康对照组80例(男32例，女48例，年龄34～75岁)。
1.3 基因扩增 用酚/氯仿法从人体外周血白细胞中提取DNA为模板[2]。根据Hager等文献报告[1]设计PCR引物，在下游引物的5′端加上40个只含GC碱基的片段：上游引物为5′-TGT CTG GTT GCT TGT GCA TG-3′和下游引物为5′CGC CGC CGC CGC CCG CGC CGC CGC CGC CCG CGC CGC CGC CGA AGA GAA CTC AGG AAG TGC-3′。扩增片段长度为196个碱基。在文献[3]基础上，对镁离子浓度和退火温度进行调整后，应用PCR技术扩增胰高血糖素受体基因的第二外显子。
, 百拇医药 1.4 变性凝胶电泳 在Fischman报告[4]的基础上，参照仪器说明书进行垂直和平行DGGE。
1.4.1 垂直DGGE 制备变性剂20%～80%(100%的变性剂为40 g/dl甲酰胺和7 mol/L尿素)，呈线性增加梯度，方向与电泳方向垂直，7.5 g/dl聚丙烯酰胺凝胶；样品为含有GC片段的PCR扩增产物100 μl和等量的载样缓冲液混合；电泳缓冲液温度60°C，电压130 V，时间4小时；电泳结束后用50 mg/ml溴乙锭，1×TAE染色10分钟，再用1×TAE缓冲液浸泡5分钟，以退去部分杂色。使用Gel Doc 1000紫外检测系统观察电泳结果。
1.4.2 平行DGGE 根据垂直DGGE结果选择平行DGGE的变性剂浓度范围，制备变性剂呈线性梯度增加，方向与电泳方向平行，7.5 g/dl聚丙烯酰胺凝胶；样品为10 μl PCR扩增产物和等量的载样缓冲液混合。除电泳时间进一步确定外，其余同“垂直DGGE”的条件。
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2 结果
2.1 垂直DGGE 由于DNA系列是未知的，需进行垂直DGGE，以明确目的基因片段和电泳迁移率与变性剂的关系。垂直DGGE结果如图1所示的过度点的变性剂浓度为59%，选择40%～70%为对胰高血糖素受体基因的第二外显子进行平行DGGE的变性剂浓度范围。
2.2 电泳时间的确定 为探讨平行DGGE所需最适电泳时间，从电泳开始到结束，每间隔1 h顺序加入一份样品，共7次。根据电泳结果(图2)，选择趋于同一水平电泳区带中所需时间最少者5 h，为平行DGGE的最适电泳时间。
2.3 平行DGGE 经对120例常见型NIDDM患者和健康对照者80例的GCG-R基因第二外显子进行平行DGGE分析，电泳结果均只显示一条区带，表明所有研究对象不存在突变。电泳结果见图3。
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Figure 1 Perpendicular denaturing gradient gel electrophoresis of GCG-R exon 2(20%～80% denaturant,the DNA fragment melts at a denaturing concentration of 59%)
图1 GCG-R第二外显子的垂直DGGE(变性剂浓度20%～80%，过度点的变性剂浓度为59%)
Figure 2 The best electrophoresis time of parallel DGGE of GCG-R exon 2(40%～70% denaturant,loading one sample per hour and total loaded 7.Lanes 5,6 and 7 in one level.)
, 百拇医药
图2 GCG-R第二外显子平行DGGE的最佳时间确定(变性剂浓度40%～70%，从电泳开始到结束，每间隔1 h顺序加入一份样品，共7次。其中区带5，6和7趋于一致)
Figure 3 Parallel denaturing gradient gel of GCG-R exon 2(40%～70% denaturant,lanes 1～5 are normal controls,lanes 6～16 are NIDDM patients)
图3 GCG-R第二外显子的平行DGGE(变性剂浓度40%～70%。区带1～5为正常对照，6～16为NIDDM患者)
3 讨论
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DGGE是根据DNA解链特性，能可靠快速地检测含有一个碱基突变、长度达536 bp的DNA片段[4～6]的凝胶体系。在对目的基因片段进行PCR扩增时，把由30～50个GC碱基组成的寡核苷酸链加在其中一条引物的5′端，使扩增所获的DNA产物的一端只含GC碱基即GC-Clamp，为片段中Tm最高的区域，而其他部分由于所含碱基种类不同Tm值也不同，而且明显低于最高Tm值。把带有GC-Clamp DNA片段放入变性剂(尿素和甲酰胺)呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当它泳动达一定浓度变性剂时(此变性剂浓度的变性效果相当于DNA片段中具最低解链温度区域的Tm值)，双链DNA便发生部分解链。部分解链后的DNA分子呈分枝状使迁移速度明显减慢，几乎处于停顿状态。因而DNA片段中只要一个碱基变异，将影响碱基间的协同作用，导致Tm的改变，在不同变性剂浓度水平上发生部分解链而使泳动几乎停顿，达到检测DNA系列中点突变的目的。从而几乎能检测到所有的突变，达到较高的敏感性[7]。
在没有阳性对照的情况下，确定变性点是实验成功的关键。由于目的片段的长度和碱基的组成不同，其Tm值也不同，因此有必要确定变性点的变性剂浓度。一旦变性点确定后，选择适当的电泳时间也是实验所必须的。如果电泳时间过短，片段未泳动到变性点处，DNA双链不解链，达不到检查的目的；时间太长，会使解链的DNA离开变性点而重新复性。电泳时间应选择趋于同一水平电泳区带中所需时间最少者。
, http://www.100md.com
本文应用PCR-DGGE技术对无亲缘关系的中国云南昆明地区汉族人120例NIDDM患者和健康对照者80例的GCG-R基因第二外显子研究结果表明，所有研究对象均不存在突变，可推断不存在Gly40/Ser的错义突变，其结论与对日本人群的研究一致[8，9]。初步表明，在中国云南昆明地区汉族NIDDM患者GCG-R基因第二外显子Gly40/Ser错义突变与NIDDM不存在关联，同时第二外显子也不存在碱基的变异。
参考文献
1 Hager J,Henser L,Vaise C,et al. Amissense mutation in the glucagon receptor gene is associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature Genetic，1995，9：299
2 段勇，王玉明，赵淮，等.从血细胞快速抽提DNA的方法探讨.昆明医学院学报，1998，19(2)：28
, 百拇医药
3 王玉明，段勇，赵淮，等.变性梯度凝胶电泳中PCR实验条件探讨.临床检验杂志，1999，17(3)：159
4 Fischman S G,Lerman L S. DNA fragments differing by single base-pair substitution are separated in denaturing gradient gels:Correspondence with melting theory.Proc Natl Acad Sci，1983，80：1579
5 Hansen L H,Abrahamsen N,Hager J,et al. The Gly40Ser mutation in the human glucagon receptor gene as sociated with NIDDM results in a receptor with reduced sensitivity glucagon. Diabetes，1996，45：725
, 百拇医药
6 Myers R M,Lumelsky N,Lerman L S,et al. Detection of single base substitutions in total genomic DNA. Nature，1985，313：495
7 Sheffield V C, Cox D R,Lerman L S,et al. Attachment of a 40-base-pair G+C-rich sequence(GC-clamp)to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes.Proc Natl Acad Sci，1989，86：232
8 Ogata M. Iwasa ki N,Ohgaeara H,et al. Absence of the Gly40Ser mutation in the glucagon receptor gene in Japanese subjects with NIDDM. Diabetes Res Clin Pract，1996，33：71
9 Odawara M,Matsunuma A, Yaniashita K.Gly40Ser substitution in the glucagon receptor is rarely involved in the pathogenesis of NIDDM in Japanese patients.Diabetes Care，1996，19：547
(1998-11-10收稿，1999-02-09修回), http://www.100md.com