PCR产物快速克隆测序
作者：崔天盆 周新
单位：崔天盆(同济医科大学附属协和医院检验科，武汉430022)，周新(湖北医科大学检验系)
关键词：载脂蛋白E；基因克隆；DNA测序；T载体
临床检验杂志990410 摘要 采用自制T载体，快速克隆apo E外显子4基因PCR扩增产物，经双脱氧末端终止法测序证明为ε3等位基因。该方法快速、价廉，在基因诊断中便于推广。
Cloning of PCR products of apolipoprotein E utilizing the T-vectors
CUI Tianpen,ZHOU Xin,(Laboratory Department,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
, http://www.100md.com
Abstract To establish a rapid,simple and practical method for cloning polymerase chain reaction (PCR)products.Apolipoprotein E(apoE)exon 4 was amplified by using PCR.The PCR products was cloned into a plasmid T-vector.The recobinant pUC-apoE is ε3 allele used sequecing.T-vector cloning is considered a rapid,practical and inexpensive technique for cloning PCR products.
Key words apolipoprotein E; T-vector; DNA sequence
随着分子生物学的发展和人类基因组计划的顺利实施，基因诊断已逐渐进入临床实验室，成为临床检验的常规项目。基因诊断常用的有聚合酶链反应(PCR)，单链构象多态性分析(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，限制性酶切多态性分析(RFLP)，核酸杂交和DNA测序等技术，其中DNA测序是基因诊断的金标准[1]。PCR是一种模拟天然复制过程的体外基因扩增技术，由于操作简便迅速，已成基因诊断中的重要手段，不足的是PCR产物难以克隆，其原因是Taq DNA聚合酶能在扩增 产物的3′端加上一个非配对碱基，且90%以上是dA[2]。分子生物学常在PCR引物5′末端设计酶切位点，双酶切后克隆，而我们在临床实验室做基因诊断实验如SSCP及DGGE中发现异常带，此时来不及设计酶切位点，费用也较高，此时我们构建T载体，它可直接克隆未加任何修饰的PCR产物。下面以载脂蛋白E(apo E)PCR产物为例介绍T载体克隆法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 器材
1.1.1 仪器 PE2400型PCR扩增仪，恒温摇床，冷冻恒温循环仪，台式高速冷冻离心机，ABI PRISMTM310基因分析仪。
1.1.2 化学试剂 TE饱和酚，氯仿/异戊醇，无水乙醇，70%乙醇，3 mol/L NaAc(pH 5.0)，碱裂解法提取质粒的溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，5×TBE，CaCl2，DNA加样缓冲液(含0.25 g/dl溴酚蓝，0.25 g/dl二甲苯青FF，30%甘油)。均用分析纯试剂配制。基因克隆宿主菌E.coli JM101，其基因型为：supE thiΔ(lac-proAB)F′[traD 36 proAB+lacq lacZ ΔM15]，可支持带有琥珀突变的载体生长的宿主菌。JM101为湖北医科大学病毒所伍欣星教授惠赠。
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1.1.3 细菌培养用品 胰蛋白胨、酵母提取物为Oxiod公司产品，IPTG和X-gal为Promega公司产品。
1.1.4 基因克隆用酶和载体 Klenow、EcoR I、BamH I、pUC18为华美生物工程公司产品，RNase A，Sma I，T4噬菌体DNA连接酶为Promega公司产品。
1.2 方法
1.2.1 模板制备及PCR扩增 采用经典酚抽提法从人静脉血有核细胞中提取基因组DNA，参照Richard等[3]合成一对引物P1、P2用来扩增载脂蛋白E外显子4基因。
P1：5′-AA CAA CTG ACC CCG GTG GCG G-3′
P2：5′-GAT GGC GCT GAG GCC GCG CTC-3′
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该区基因含apoE 112和158位氨基酸对应的核苷酸序列。扩增方法见文献[3，5]，扩增片段长292 bp。
1.2.2 T载体的构建 取质粒pUC18 DNA 1 μg，用Sma Ⅰ酶切消化产生平端。酚抽提，无水乙醇沉淀，用10 μl双蒸水溶解，加入2 μl 10×DNA聚合酶缓冲液，2 μl 10 mmol/L dTTP，灭菌双蒸水6 μl，最后加入Taq DNA聚合酶1 U，72°C 2小时。在反应缺乏其它三种核苷酸时，Taq DNA聚合酶能在每个载体片段的3′末端加上一个dT；经酚抽提和乙醇沉淀后，T载体的构建就完成了。
1.2.3 T载体与apo E PCR产物连接 纯化T载体0.4 μg，PCR产物0.125 μg，混匀用无水乙醇沉淀，待乙醇挥发后，加8 μl水溶解，10×连接缓冲液1 μl，T4噬菌体DNA连接酶1 μl(3 U)，混匀，离心，15°C过夜。
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1.2.4 重组质粒转化感受态细胞[4] 取30 μg重组质粒转化JM101感受态细胞。
1.2.5 重组质粒pUC-apo E的筛选与鉴定 重组质粒转化感受态细胞涂布于含amp，X-gal和IPTG的LB平板上，37°C培养过夜后，生成蓝色和白色菌落，其中白色菌落可能含重组质粒pUC-apoE。挑选白色菌落扩大培养后，用碱裂解法提取质粒。
双酶切鉴定 用BamH I和EcoR I对可能重组质粒进行双酶切鉴定。在PCR产物(292 bp)稍后可见阳性片段为重组成功的pUC-apoE上切下的apoE基因。
1.2.6 DNA序列测定 双酶切鉴定阳性重组子，扩大培养后，大量制备质粒，用P1为引物，在PE公司ABI PRISMTM全自动基因分析仪上测序。
1.2.7 apoE PCR产物平末端连接及克隆[4] apoE PCR产物经割胶纯化，乙醇沉淀，干后溶于0.1×TE 10 μl，用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段将DNA末端切平。载体pUC 18用Sma Ⅰ切平。最后用T4 DNA连接酶将上述PCR产物与载体连接，转化并筛选鉴定重组质粒。
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2 结果
2.1 两种克隆方法克隆效率比较 表1可看出T-A互补克隆法的克隆效率明显高于平末端连接克隆法。T-A互补法实际上是一种粘性末端连接法，且不需Klenow酶。
表1 两种PCR产物处理方法克隆效率的比较
Table 1 Transformfation efficiency for two metheds of PCR products ligation Ligation method
Blunt end ligation
T-vector ligation
Transformation efficiency
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(recombinant/μg DNA)
8×105
2.2×107
2.2 筛选鉴定 质粒DNA凝胶电泳分析。挑取白色菌落扩大培养后，小量碱裂解法制备质料DNA，1 g/dl琼脂糖凝胶电泳。结果可见阳性重组子稍落后于pUC 18质粒，见图1。单酶切鉴定，pUC 18和pUC-apoE重组质粒分别用BamH Ⅰ酶切，可见线化重组质粒稍落后于线化pUC18质粒，见图1。双酶切鉴定，重组pUC-apoE用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后，apoE片段带有pUC18多克隆位点上的21个核苷酸和两个dT，故为315 bp，稍落后于apoE PCR产物(292 bp)见图1。
2.3 DNA序列测定 pUC-apoE用引物P1，在AB1 310 PRIMTM全自动测序仪上，用双脱氧终止法进行测序，结果见图2，该重组子克隆了apoE ε3单倍体，即112位氨基酸对应密码子为TGC，而158位氨基酸对应密码CGC，见序列图中划线碱基。
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Figure 1 Restriction endonuclease analysis on pUC-apoE
图1 pUC-apoE的限制性酶切鉴定
Figure 2 Scheme of DNA sequencing on pUC-apoE
图2 pUC-apoE测序结果
3 讨论
本文以apoE外显子4片段的T载体克隆法为例，该方法同样适合临床检验中其它PCR产物的克隆。对病原体进行基因检测，有时需测序后予以确认，此时可用T载体克隆；用SSCP或DGGE检出可能的原癌基因、抑癌基因或体内其它基因的突变或多态性，同样可用T载体克隆后进行测序。
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PCR产物克隆方法很多，与基因诊断有关的方法主要有粘性末端连接克隆法，平末端连接克隆法，T-A互补克隆法等。粘性末端连接法需事先在两引物5′端设计酶切位点和保护碱基，这样会增加费用，也费时，但粘性末端法克隆效率高，且可定向克隆，在分子生物学中较常用。平末端连接法克隆效率低，筛选也较费时。本研究表明，T-A互补法克隆效率明显高于平端连接法，与经典粘性末端连接法克隆效率相近，T载体制备简单，试剂易得。用自制T载体的T-A互补法克隆简便，快速，省钱。也可从一些生物工程公司购买T载体，如Invitrogen公司的PCRTMⅡ和Promega公司的pGEM-T载体，使用方便、快速。也有些作者介绍PCR产物直接测序的方法，但因PCR产物的非均一性，测序结果不很理想。如T载体克隆法广泛用于临床基因诊断，必将促进其发展。
参考文献
1 马立人，王全立主编.基因诊断研究新进展.北京：新时代出版社，1997
, 百拇医药
2 White BA.PCR Cloning Protocols.New Jersey:Humana Press，1997，61～110
3 Richard P,Thomas G,de Iuluets MP,et al. Common and rare genotypes of human apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase chain reaction-amplififed DNA，Clin Chem，1994，40：24～29
4 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版.北京：科学出版社，1992
5 周新.动脉粥样硬化与生物化学检验.武汉：湖北科技出版社，1997，54～55
(1998-09-07收稿，1999-01-18修回), 百拇医药
单位：崔天盆(同济医科大学附属协和医院检验科，武汉430022)，周新(湖北医科大学检验系)
关键词：载脂蛋白E；基因克隆；DNA测序；T载体
临床检验杂志990410 摘要 采用自制T载体，快速克隆apo E外显子4基因PCR扩增产物，经双脱氧末端终止法测序证明为ε3等位基因。该方法快速、价廉，在基因诊断中便于推广。
Cloning of PCR products of apolipoprotein E utilizing the T-vectors
CUI Tianpen,ZHOU Xin,(Laboratory Department,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
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Abstract To establish a rapid,simple and practical method for cloning polymerase chain reaction (PCR)products.Apolipoprotein E(apoE)exon 4 was amplified by using PCR.The PCR products was cloned into a plasmid T-vector.The recobinant pUC-apoE is ε3 allele used sequecing.T-vector cloning is considered a rapid,practical and inexpensive technique for cloning PCR products.
Key words apolipoprotein E; T-vector; DNA sequence
随着分子生物学的发展和人类基因组计划的顺利实施，基因诊断已逐渐进入临床实验室，成为临床检验的常规项目。基因诊断常用的有聚合酶链反应(PCR)，单链构象多态性分析(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，限制性酶切多态性分析(RFLP)，核酸杂交和DNA测序等技术，其中DNA测序是基因诊断的金标准[1]。PCR是一种模拟天然复制过程的体外基因扩增技术，由于操作简便迅速，已成基因诊断中的重要手段，不足的是PCR产物难以克隆，其原因是Taq DNA聚合酶能在扩增 产物的3′端加上一个非配对碱基，且90%以上是dA[2]。分子生物学常在PCR引物5′末端设计酶切位点，双酶切后克隆，而我们在临床实验室做基因诊断实验如SSCP及DGGE中发现异常带，此时来不及设计酶切位点，费用也较高，此时我们构建T载体，它可直接克隆未加任何修饰的PCR产物。下面以载脂蛋白E(apo E)PCR产物为例介绍T载体克隆法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 器材
1.1.1 仪器 PE2400型PCR扩增仪，恒温摇床，冷冻恒温循环仪，台式高速冷冻离心机，ABI PRISMTM310基因分析仪。
1.1.2 化学试剂 TE饱和酚，氯仿/异戊醇，无水乙醇，70%乙醇，3 mol/L NaAc(pH 5.0)，碱裂解法提取质粒的溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，5×TBE，CaCl2，DNA加样缓冲液(含0.25 g/dl溴酚蓝，0.25 g/dl二甲苯青FF，30%甘油)。均用分析纯试剂配制。基因克隆宿主菌E.coli JM101，其基因型为：supE thiΔ(lac-proAB)F′[traD 36 proAB+lacq lacZ ΔM15]，可支持带有琥珀突变的载体生长的宿主菌。JM101为湖北医科大学病毒所伍欣星教授惠赠。
, 百拇医药
1.1.3 细菌培养用品 胰蛋白胨、酵母提取物为Oxiod公司产品，IPTG和X-gal为Promega公司产品。
1.1.4 基因克隆用酶和载体 Klenow、EcoR I、BamH I、pUC18为华美生物工程公司产品，RNase A，Sma I，T4噬菌体DNA连接酶为Promega公司产品。
1.2 方法
1.2.1 模板制备及PCR扩增 采用经典酚抽提法从人静脉血有核细胞中提取基因组DNA，参照Richard等[3]合成一对引物P1、P2用来扩增载脂蛋白E外显子4基因。
P1：5′-AA CAA CTG ACC CCG GTG GCG G-3′
P2：5′-GAT GGC GCT GAG GCC GCG CTC-3′
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该区基因含apoE 112和158位氨基酸对应的核苷酸序列。扩增方法见文献[3，5]，扩增片段长292 bp。
1.2.2 T载体的构建 取质粒pUC18 DNA 1 μg，用Sma Ⅰ酶切消化产生平端。酚抽提，无水乙醇沉淀，用10 μl双蒸水溶解，加入2 μl 10×DNA聚合酶缓冲液，2 μl 10 mmol/L dTTP，灭菌双蒸水6 μl，最后加入Taq DNA聚合酶1 U，72°C 2小时。在反应缺乏其它三种核苷酸时，Taq DNA聚合酶能在每个载体片段的3′末端加上一个dT；经酚抽提和乙醇沉淀后，T载体的构建就完成了。
1.2.3 T载体与apo E PCR产物连接 纯化T载体0.4 μg，PCR产物0.125 μg，混匀用无水乙醇沉淀，待乙醇挥发后，加8 μl水溶解，10×连接缓冲液1 μl，T4噬菌体DNA连接酶1 μl(3 U)，混匀，离心，15°C过夜。
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1.2.4 重组质粒转化感受态细胞[4] 取30 μg重组质粒转化JM101感受态细胞。
1.2.5 重组质粒pUC-apo E的筛选与鉴定 重组质粒转化感受态细胞涂布于含amp，X-gal和IPTG的LB平板上，37°C培养过夜后，生成蓝色和白色菌落，其中白色菌落可能含重组质粒pUC-apoE。挑选白色菌落扩大培养后，用碱裂解法提取质粒。
双酶切鉴定 用BamH I和EcoR I对可能重组质粒进行双酶切鉴定。在PCR产物(292 bp)稍后可见阳性片段为重组成功的pUC-apoE上切下的apoE基因。
1.2.6 DNA序列测定 双酶切鉴定阳性重组子，扩大培养后，大量制备质粒，用P1为引物，在PE公司ABI PRISMTM全自动基因分析仪上测序。
1.2.7 apoE PCR产物平末端连接及克隆[4] apoE PCR产物经割胶纯化，乙醇沉淀，干后溶于0.1×TE 10 μl，用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段将DNA末端切平。载体pUC 18用Sma Ⅰ切平。最后用T4 DNA连接酶将上述PCR产物与载体连接，转化并筛选鉴定重组质粒。
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2 结果
2.1 两种克隆方法克隆效率比较 表1可看出T-A互补克隆法的克隆效率明显高于平末端连接克隆法。T-A互补法实际上是一种粘性末端连接法，且不需Klenow酶。
表1 两种PCR产物处理方法克隆效率的比较
Table 1 Transformfation efficiency for two metheds of PCR products ligation Ligation method
Blunt end ligation
T-vector ligation
Transformation efficiency
, 百拇医药
(recombinant/μg DNA)
8×105
2.2×107
2.2 筛选鉴定 质粒DNA凝胶电泳分析。挑取白色菌落扩大培养后，小量碱裂解法制备质料DNA，1 g/dl琼脂糖凝胶电泳。结果可见阳性重组子稍落后于pUC 18质粒，见图1。单酶切鉴定，pUC 18和pUC-apoE重组质粒分别用BamH Ⅰ酶切，可见线化重组质粒稍落后于线化pUC18质粒，见图1。双酶切鉴定，重组pUC-apoE用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后，apoE片段带有pUC18多克隆位点上的21个核苷酸和两个dT，故为315 bp，稍落后于apoE PCR产物(292 bp)见图1。
2.3 DNA序列测定 pUC-apoE用引物P1，在AB1 310 PRIMTM全自动测序仪上，用双脱氧终止法进行测序，结果见图2，该重组子克隆了apoE ε3单倍体，即112位氨基酸对应密码子为TGC，而158位氨基酸对应密码CGC，见序列图中划线碱基。
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Figure 1 Restriction endonuclease analysis on pUC-apoE
图1 pUC-apoE的限制性酶切鉴定
Figure 2 Scheme of DNA sequencing on pUC-apoE
图2 pUC-apoE测序结果
3 讨论
本文以apoE外显子4片段的T载体克隆法为例，该方法同样适合临床检验中其它PCR产物的克隆。对病原体进行基因检测，有时需测序后予以确认，此时可用T载体克隆；用SSCP或DGGE检出可能的原癌基因、抑癌基因或体内其它基因的突变或多态性，同样可用T载体克隆后进行测序。
, http://www.100md.com
PCR产物克隆方法很多，与基因诊断有关的方法主要有粘性末端连接克隆法，平末端连接克隆法，T-A互补克隆法等。粘性末端连接法需事先在两引物5′端设计酶切位点和保护碱基，这样会增加费用，也费时，但粘性末端法克隆效率高，且可定向克隆，在分子生物学中较常用。平末端连接法克隆效率低，筛选也较费时。本研究表明，T-A互补法克隆效率明显高于平端连接法，与经典粘性末端连接法克隆效率相近，T载体制备简单，试剂易得。用自制T载体的T-A互补法克隆简便，快速，省钱。也可从一些生物工程公司购买T载体，如Invitrogen公司的PCRTMⅡ和Promega公司的pGEM-T载体，使用方便、快速。也有些作者介绍PCR产物直接测序的方法，但因PCR产物的非均一性，测序结果不很理想。如T载体克隆法广泛用于临床基因诊断，必将促进其发展。
参考文献
1 马立人，王全立主编.基因诊断研究新进展.北京：新时代出版社，1997
, 百拇医药
2 White BA.PCR Cloning Protocols.New Jersey:Humana Press，1997，61～110
3 Richard P,Thomas G,de Iuluets MP,et al. Common and rare genotypes of human apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase chain reaction-amplififed DNA，Clin Chem，1994，40：24～29
4 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版.北京：科学出版社，1992
5 周新.动脉粥样硬化与生物化学检验.武汉：湖北科技出版社，1997，54～55
(1998-09-07收稿，1999-01-18修回), 百拇医药