复合定量PCR检测谷胱苷肽-S转移酶和多药耐药相关基因mRNA表达水平方法的建立及初步应用
作者：陈高明 王白岚李春海
单位：孙丽亚 军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物学室，北京100850
关键词：定量聚合酶链反应；谷胱苷肽-S转移酶；多药耐药相关基因
临床检验杂志990401 摘要 用β-肌动蛋白(β-actin)作内参照，设计不同扩增片段的谷胱苷肽-S转移酶(GST-π)和多药耐药基因(MDR1)引物，建立同时定量检测GST-π和MDR1 mRNA表达水平的复合定量PCR法。扩增条带光密度值用凝胶成像系统检测，基因相对表达水平用目的基因和β-actin光密度比值计算。本法灵敏度高、重复性好，能作批量分析。室内X控制图可有效控制定量PCR扩增和电泳质量，保证本法能检测出小于2倍的表达差异。在乳腺癌组织中GST-π和MDR1 mRNA中位数分别为0.27和1.32，且表达水平呈明显正相关(r＝0.323，P<0.05)。
, 百拇医药
Detection of the expression of GST-π and MDR1 by complex quantitative polymerase chain reaction and its clinical application
CHEN Gaoming,WANG Bailan,LI Chunhai,et al
(The Department of Tumor Molecular Bilolgy,Affiliated Hospital of Beijing Academy Military Medical Science,Beijing,100850)
Abstract Based on the principle that the quantity of PCR product is a reflection of the quantity of template at the exponential increasing stage. A reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) quantitative technique of glutathione S-transferase isoenzyme-π(GST-π)and multi-drug resistance gene(MDR1)expression was developed through the setting the housekeeper gene,β-actin and scanning the total optical density of productive bands on the gel.The individual Xcontrol method of complex quantitative PCR was established too.The RT-PCR described here is a sensitive,reproducible,nonradioactive method.Using the present technique,71 samples of breast carcinoma were examined.The median of GST-π and MDR1 was 0.27 and 1.32,at the same time,it's expression lever have positive correlation in breast carcinoma.The quantitative RT-PCR method can be applied to show the tiny difference of the GST-π and MDR1 mRNA expression in breast carcinomas.
, 百拇医药
Key words quantitative PCR; glutathione S-transferase; multi-drug resistance gene; quality control
肿瘤化疗药物耐药是多因素多机制的综合结果，即耐药的产生往往涉及许多耐药相关基因的表达。对耐药相关基因之间关系的研究较多，因为耐药相关基因之间关系的明确有助于耐药机理的理解及简化逆转耐药的方案。为了研究谷胱苷肽-S转移酶(glutathion S-transterase-π，GST-π)和多药耐药相关基因(multidrug-resistant gene，MDR1)的关系，我们建立了复合定量PCR技术，并检测了两种多药耐药相关基因在乳腺癌组织的表达。
1 材料和方法
1.1 材料 总核糖核酸(RNA)提取、逆转录及PCR相关试剂购自Promega公司；PCR扩增使用PE公司2400型热循环仪；凝胶成像系统为Kodak产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 RNA制备 细胞RNA提取用异硫氰酸氢胍-酚-氯仿(acid gunidinium-thiocyanate-phenol-
chloroform，AGPC)一步法[1]。
1.2.2 引物设计 所有引物均跨外显子设计，扩增片段长度相差50 bp以上，退火温度差异在0.5°C以内，并且理论上三种引物扩增时不会产生引物二聚体，引物设计使用PRIMERS和PCRDESN软件。MDR1：5′(2596～2615 bp)；3′(2733～2752 bp)[2]；GST-π：5′(863～882)；3′(1192～1213)[3]；β-actin：5′(346～367 bp)；3′(558～580 bp)[4]。MDR1，GST-π和β-actin的扩增片段长度分别为167 bp，350 bp和234 bp。
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1.2.3 逆转录合成cDNA链 取1 μg细胞总RNA，加5倍逆转录缓冲液4 μl，5 mmol/L 4种脱氧核糖核苷底物2 μl，100 μg/ml 15聚胸腺嘧啶逆转录引物2 μl，65°C 10分钟后移至冰浴，再加入RNA酶抑制剂10 U，鸟成骨细胞瘤病毒逆转录酶10 U，补充总量到20 μl。42°C 1小时后95°C 5分钟，-20°C保存。
1.2.4 PCR扩增及产物定量 每50 μl体系含10倍PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，GST-π、MDR1及β-actin引物各30 pmol/L，二甲基亚砜(DMSO)0.5 μl，Taq DNA聚合酶2 U，100 ng总RNA对应的模板。94°C变性1分钟，55°C退火1分钟，72°C延伸2分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。分析时取扩增产物10 μl，20 g/L琼脂糖电泳，溴化乙锭染色。凝胶成像系统照相，1D软件定量分析各条带的吸光度，以GST-π/β-actin和MDR1/β-actin吸光度比值代表耐药相关基因表达的相对量。
, 百拇医药
2 实验和结果
2.1 复合定量PCR扩增结果 以质粒作阳性对照，三例乳腺癌样品的PCR典型扩增结果见图1。GST-π、MDR1和β-actin分别得到350 bp、167 bp和234 bp左右的条带，与所设计的扩增片段大小相符。阴性对照未见任何扩增条带，说明上述条带为特异性扩增产物。
2.2 反应体系优化 用混合cDNA作模板，在6只反应管中分别加入Mg2+，使其终浓度分别为1.0，1.2，1.4，1.6，1.8和2.0 mmol/L，PCR扩增30个循环。电泳结果表明Mg2+在1.5 mmol/L时，扩增条带整齐且亮度适中，无拖尾。确定Mg2+浓度后，同法梯度加入甘油和DMSO，结果表明甘油对结果无影响而1%的DMSO可明显提高扩增效率，稳定扩增体系。
, 百拇医药
M：marker；P：positive control；N：negative control；S1，S2，S3：sample of breast cancer
Figure 1 The PCR results of GST-π，MDR1and β-actin in samples of breast cancer
图1 乳腺癌组织GST-π和MDR1基因及内参β-actin的PCR扩增结果
2.3 动力学分析 指数扩增是PCR定量的基础，分析终点必需落在指数增长区内。参考文献[5，6]，用乳腺癌混合样品cDNA作模板，作6个平行管行PCR扩增，第22个循环时，每隔2个循环取出一管，直到32个循环止。同时电泳，测定条带的总吸光度，绘制扩增动力学图。GST-π，MDR1和β-actin的动力学分析结果见图2。从图2可知三种基因在22至30个循环内均呈指数扩增，β-actin由于基因表达水平较高，最先达到平台期。检测临床样本时循环数应控制在30个循环数以内。
, 百拇医药
Figure 2 The dynamic figure of GST-π and MDR1 amplification by complex quantitative PCR method
图2 复合定量PCR测定GST-π和MDR1扩增动力图
2.4 重复性检测 批内和批间重复性检测均用乳腺癌样品的混合cDNA作模板。批内检测作四个平行管，批间检测每天重复作一次PCR，连续四天，扩增28个循环后，电泳结果用1D软件分析耐药相关基因和β-actin吸光度比值。计算
，s和CV。
MDR1的批内CV为3.9%(＝1.0475)，批间CV为15.4%(＝1.0197)。GST-π的批内CV为8.3%(＝0.6974)，批间CV为18.9%(＝0.7108)。
, 百拇医药
2.5 复合定量PCR的质量控制 每次PCR扩增时，另管用2 μl定量质控物代替模板，扩增结果分析同样品。以均值为中心线，均值±1/2均值为上下控制线，建立质控图。
Figure 3 The individual Xcontrol figure of MDR1 from Jan,1990 to Apr，1998
图3 1998年1月至4月MDR1的X控制图
图3显示看出第3，7，8和9次测定失控。分析发现失控的主要原因为电泳效果较差。
2.6 乳腺癌组织GST-π和MDR1 mRNA的表达 为了研究GST-π和MDR1的关系，我们检测了77例乳腺癌样品中的MDR1，其中63例同时测定了二者的表达情况，GST-π的中位数为0.27，MDR1的中位数为1.32。63例的结果表明MDR1和GST-π呈明显正相关(Spearman相关分析，r＝0.323，P<0.05)。
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3 讨论
定量PCR可分为无内参照定量PCR，共扩增内参定量PCR和竞争定量PCR等。共扩增定量PCR方法简便，用目的基因和看家基因(house-keeper gene)的比值来代表相对表达水平，能有效消除部分RNA降解的影响，并且还能同时检测多条扩增条带。我们选用共扩增作为复合定量PCR的方法学基础。复合定量PCR在基因水平相关性研究方面有许多优势。由于PCR重复性较差，结果离散度大，两种基因在同样的反应条件下测定，可最大限度避免单独定量检测的误差积累。
复合定量PCR由于扩增基因多，影响因素相应增多，所以体系的优化尤为重要，经验证明加入DMSO可以稳定体系，提高扩增产量，减小扩增引物间的干扰。另外，对复合定量PCR进行必要的质量控制也非常重要。质控应该包括RNA提取过程，cDNA合成过程，PCR过程和电泳过程。用看家基因作内参照，可有效地控制RNA提取过程和cDNA合成过程。我们建立的上下控制线定值的X控制图对PCR和电泳过程的控制效果较好，实践证明失控的主要原因多为电泳效果较差。另外，我们把上下控制线定为均值±1/2均值，可有效控制大于二倍的检测误差。
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检测乳腺癌样本中GST-π和MDR1的表达及其关系表明本法为共表达研究提供了一个简便可行的方法。共表达研究常用双标记技术，通过免疫组化的手段检测两种蛋白在同一细胞的表达情况，技术要求复杂，而本法操作简便，又能批量检测，很适合临床样本的筛查。
总之，本法简单，灵敏，可用于临床样本的批量分析，并且能检测GST-π和MDR1 mRNA小于2倍的表达差异，为耐药相关基因共表达研究提供了一条新的思路，值得进一步推广。
作者简介:解放军九四医院，南昌330002
参考文献
1 王尧河，张云汉，卞丽红，等.异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取组织中的RNA.河南医科大学学报，1997，32(3)：25
2 Chen C J,Chin J E,Ueda K,et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl(p-Glycoprotein)gene from multidrug-resistant human cells.Cell，1986，47：381
, 百拇医药
3 Cowell I G,Dixon K H,Pemble S,et al. The structure of the human glutathion S-transferase pi gene. Biochem J，1988，255(1)：79
4 Sadayo N I,Hiroshi H,Premkumar R,et al. Molecular structure of the human cytoplasmic β-actin gene:interspecies homology of sequence in the introns.Proc Natl Acad Sci USA，1985，83：6133
5 杨居祥，王一礼，司履生，等.逆转录-聚合酶链反应测定多药耐药基因.中华医学检验杂志，1996，19(3)：99
6 陈高明，李春海，王尧河，等.TR-PCR定量检测GST-πmRNA的表达.中国肿瘤临床，1998，25(12)：858
(1998-09-07收稿，1999-02-09修回), http://www.100md.com
单位：孙丽亚 军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物学室，北京100850
关键词：定量聚合酶链反应；谷胱苷肽-S转移酶；多药耐药相关基因
临床检验杂志990401 摘要 用β-肌动蛋白(β-actin)作内参照，设计不同扩增片段的谷胱苷肽-S转移酶(GST-π)和多药耐药基因(MDR1)引物，建立同时定量检测GST-π和MDR1 mRNA表达水平的复合定量PCR法。扩增条带光密度值用凝胶成像系统检测，基因相对表达水平用目的基因和β-actin光密度比值计算。本法灵敏度高、重复性好，能作批量分析。室内X控制图可有效控制定量PCR扩增和电泳质量，保证本法能检测出小于2倍的表达差异。在乳腺癌组织中GST-π和MDR1 mRNA中位数分别为0.27和1.32，且表达水平呈明显正相关(r＝0.323，P<0.05)。
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Detection of the expression of GST-π and MDR1 by complex quantitative polymerase chain reaction and its clinical application
CHEN Gaoming,WANG Bailan,LI Chunhai,et al
(The Department of Tumor Molecular Bilolgy,Affiliated Hospital of Beijing Academy Military Medical Science,Beijing,100850)
Abstract Based on the principle that the quantity of PCR product is a reflection of the quantity of template at the exponential increasing stage. A reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) quantitative technique of glutathione S-transferase isoenzyme-π(GST-π)and multi-drug resistance gene(MDR1)expression was developed through the setting the housekeeper gene,β-actin and scanning the total optical density of productive bands on the gel.The individual Xcontrol method of complex quantitative PCR was established too.The RT-PCR described here is a sensitive,reproducible,nonradioactive method.Using the present technique,71 samples of breast carcinoma were examined.The median of GST-π and MDR1 was 0.27 and 1.32,at the same time,it's expression lever have positive correlation in breast carcinoma.The quantitative RT-PCR method can be applied to show the tiny difference of the GST-π and MDR1 mRNA expression in breast carcinomas.
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Key words quantitative PCR; glutathione S-transferase; multi-drug resistance gene; quality control
肿瘤化疗药物耐药是多因素多机制的综合结果，即耐药的产生往往涉及许多耐药相关基因的表达。对耐药相关基因之间关系的研究较多，因为耐药相关基因之间关系的明确有助于耐药机理的理解及简化逆转耐药的方案。为了研究谷胱苷肽-S转移酶(glutathion S-transterase-π，GST-π)和多药耐药相关基因(multidrug-resistant gene，MDR1)的关系，我们建立了复合定量PCR技术，并检测了两种多药耐药相关基因在乳腺癌组织的表达。
1 材料和方法
1.1 材料 总核糖核酸(RNA)提取、逆转录及PCR相关试剂购自Promega公司；PCR扩增使用PE公司2400型热循环仪；凝胶成像系统为Kodak产品。
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1.2 方法
1.2.1 RNA制备 细胞RNA提取用异硫氰酸氢胍-酚-氯仿(acid gunidinium-thiocyanate-phenol-
chloroform，AGPC)一步法[1]。
1.2.2 引物设计 所有引物均跨外显子设计，扩增片段长度相差50 bp以上，退火温度差异在0.5°C以内，并且理论上三种引物扩增时不会产生引物二聚体，引物设计使用PRIMERS和PCRDESN软件。MDR1：5′(2596～2615 bp)；3′(2733～2752 bp)[2]；GST-π：5′(863～882)；3′(1192～1213)[3]；β-actin：5′(346～367 bp)；3′(558～580 bp)[4]。MDR1，GST-π和β-actin的扩增片段长度分别为167 bp，350 bp和234 bp。
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1.2.3 逆转录合成cDNA链 取1 μg细胞总RNA，加5倍逆转录缓冲液4 μl，5 mmol/L 4种脱氧核糖核苷底物2 μl，100 μg/ml 15聚胸腺嘧啶逆转录引物2 μl，65°C 10分钟后移至冰浴，再加入RNA酶抑制剂10 U，鸟成骨细胞瘤病毒逆转录酶10 U，补充总量到20 μl。42°C 1小时后95°C 5分钟，-20°C保存。
1.2.4 PCR扩增及产物定量 每50 μl体系含10倍PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，GST-π、MDR1及β-actin引物各30 pmol/L，二甲基亚砜(DMSO)0.5 μl，Taq DNA聚合酶2 U，100 ng总RNA对应的模板。94°C变性1分钟，55°C退火1分钟，72°C延伸2分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。分析时取扩增产物10 μl，20 g/L琼脂糖电泳，溴化乙锭染色。凝胶成像系统照相，1D软件定量分析各条带的吸光度，以GST-π/β-actin和MDR1/β-actin吸光度比值代表耐药相关基因表达的相对量。
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2 实验和结果
2.1 复合定量PCR扩增结果 以质粒作阳性对照，三例乳腺癌样品的PCR典型扩增结果见图1。GST-π、MDR1和β-actin分别得到350 bp、167 bp和234 bp左右的条带，与所设计的扩增片段大小相符。阴性对照未见任何扩增条带，说明上述条带为特异性扩增产物。
2.2 反应体系优化 用混合cDNA作模板，在6只反应管中分别加入Mg2+，使其终浓度分别为1.0，1.2，1.4，1.6，1.8和2.0 mmol/L，PCR扩增30个循环。电泳结果表明Mg2+在1.5 mmol/L时，扩增条带整齐且亮度适中，无拖尾。确定Mg2+浓度后，同法梯度加入甘油和DMSO，结果表明甘油对结果无影响而1%的DMSO可明显提高扩增效率，稳定扩增体系。
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M：marker；P：positive control；N：negative control；S1，S2，S3：sample of breast cancer
Figure 1 The PCR results of GST-π，MDR1and β-actin in samples of breast cancer
图1 乳腺癌组织GST-π和MDR1基因及内参β-actin的PCR扩增结果
2.3 动力学分析 指数扩增是PCR定量的基础，分析终点必需落在指数增长区内。参考文献[5，6]，用乳腺癌混合样品cDNA作模板，作6个平行管行PCR扩增，第22个循环时，每隔2个循环取出一管，直到32个循环止。同时电泳，测定条带的总吸光度，绘制扩增动力学图。GST-π，MDR1和β-actin的动力学分析结果见图2。从图2可知三种基因在22至30个循环内均呈指数扩增，β-actin由于基因表达水平较高，最先达到平台期。检测临床样本时循环数应控制在30个循环数以内。
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Figure 2 The dynamic figure of GST-π and MDR1 amplification by complex quantitative PCR method
图2 复合定量PCR测定GST-π和MDR1扩增动力图
2.4 重复性检测 批内和批间重复性检测均用乳腺癌样品的混合cDNA作模板。批内检测作四个平行管，批间检测每天重复作一次PCR，连续四天，扩增28个循环后，电泳结果用1D软件分析耐药相关基因和β-actin吸光度比值。计算
，s和CV。MDR1的批内CV为3.9%(
＝1.0475)，批间CV为15.4%(＝1.0197)。GST-π的批内CV为8.3%(＝0.6974)，批间CV为18.9%(＝0.7108)。, 百拇医药
2.5 复合定量PCR的质量控制 每次PCR扩增时，另管用2 μl定量质控物代替模板，扩增结果分析同样品。以均值为中心线，均值±1/2均值为上下控制线，建立质控图。
Figure 3 The individual Xcontrol figure of MDR1 from Jan,1990 to Apr，1998
图3 1998年1月至4月MDR1的X控制图
图3显示看出第3，7，8和9次测定失控。分析发现失控的主要原因为电泳效果较差。
2.6 乳腺癌组织GST-π和MDR1 mRNA的表达 为了研究GST-π和MDR1的关系，我们检测了77例乳腺癌样品中的MDR1，其中63例同时测定了二者的表达情况，GST-π的中位数为0.27，MDR1的中位数为1.32。63例的结果表明MDR1和GST-π呈明显正相关(Spearman相关分析，r＝0.323，P<0.05)。
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3 讨论
定量PCR可分为无内参照定量PCR，共扩增内参定量PCR和竞争定量PCR等。共扩增定量PCR方法简便，用目的基因和看家基因(house-keeper gene)的比值来代表相对表达水平，能有效消除部分RNA降解的影响，并且还能同时检测多条扩增条带。我们选用共扩增作为复合定量PCR的方法学基础。复合定量PCR在基因水平相关性研究方面有许多优势。由于PCR重复性较差，结果离散度大，两种基因在同样的反应条件下测定，可最大限度避免单独定量检测的误差积累。
复合定量PCR由于扩增基因多，影响因素相应增多，所以体系的优化尤为重要，经验证明加入DMSO可以稳定体系，提高扩增产量，减小扩增引物间的干扰。另外，对复合定量PCR进行必要的质量控制也非常重要。质控应该包括RNA提取过程，cDNA合成过程，PCR过程和电泳过程。用看家基因作内参照，可有效地控制RNA提取过程和cDNA合成过程。我们建立的上下控制线定值的X控制图对PCR和电泳过程的控制效果较好，实践证明失控的主要原因多为电泳效果较差。另外，我们把上下控制线定为均值±1/2均值，可有效控制大于二倍的检测误差。
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检测乳腺癌样本中GST-π和MDR1的表达及其关系表明本法为共表达研究提供了一个简便可行的方法。共表达研究常用双标记技术，通过免疫组化的手段检测两种蛋白在同一细胞的表达情况，技术要求复杂，而本法操作简便，又能批量检测，很适合临床样本的筛查。
总之，本法简单，灵敏，可用于临床样本的批量分析，并且能检测GST-π和MDR1 mRNA小于2倍的表达差异，为耐药相关基因共表达研究提供了一条新的思路，值得进一步推广。
作者简介:解放军九四医院，南昌330002
参考文献
1 王尧河，张云汉，卞丽红，等.异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取组织中的RNA.河南医科大学学报，1997，32(3)：25
2 Chen C J,Chin J E,Ueda K,et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl(p-Glycoprotein)gene from multidrug-resistant human cells.Cell，1986，47：381
, 百拇医药
3 Cowell I G,Dixon K H,Pemble S,et al. The structure of the human glutathion S-transferase pi gene. Biochem J，1988，255(1)：79
4 Sadayo N I,Hiroshi H,Premkumar R,et al. Molecular structure of the human cytoplasmic β-actin gene:interspecies homology of sequence in the introns.Proc Natl Acad Sci USA，1985，83：6133
5 杨居祥，王一礼，司履生，等.逆转录-聚合酶链反应测定多药耐药基因.中华医学检验杂志，1996，19(3)：99
6 陈高明，李春海，王尧河，等.TR-PCR定量检测GST-πmRNA的表达.中国肿瘤临床，1998，25(12)：858
(1998-09-07收稿，1999-02-09修回), http://www.100md.com