逆转录-聚合酶链反应快速检测血清HDV RNA
作者：戴二黑 刘月梅 冯建荣 崔荣辉 马艾 和玉平
单位：050021 河北省石家庄市第五医院
关键词：
中华传染病杂志990416 丁型肝炎病毒(HDV)是一种缺陷性共价闭环单股负链RNA病毒，长约1700个核苷酸，由于HDV RNA G+C含量高易形成二级结构以及易变异等原因使逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功率不高[1，2]。我们根据Chao等[3]报道的HDV RNA序列建立了一种RT-PCR方法，并对43份肝炎血清进行了检测，现报道如下。
材料与方法
一、血清标本
3份HDV RNA阳性血清，由北京市肝炎研究所黄德庄教授赠送。23例血清HDV标志阳性患者均系在我院住院患者。其中HDAg阳性10例，抗-HD-IgM阳性1例，抗-HD阳性8例，HDAg与抗-HD-IgM阳性2例，HDAg与抗-HD阳性2例。另外17例HBsAg、HBeAg和抗-HBc阳性且HDV标志阴性患者。
, 百拇医药
二、引物设计
根据Chao等[3]报道的序列，选择HDV基因组的保守区序列设计引物，引物1为5′-TGGGCAACATTCCGAGGGAC-3′，与HDV的核酸序列725～745位互补；引物2为5′-TTCGGGTCGGCATGGCATCT-3′与HDV的887～906位互补，由中国科学院北京科海医疗生物工程公司合成，扩增长度为181bp。
三、HDV RNA提取
取血清50μl，加100μl裂解液(含12g异硫氰酸胍，10ml 1mol/L Tris HCl pH 6.4,2.2ml 0.2mol/L EDTA,0.26ml Triton X-100)加玻璃粉液20μl混匀。室温间歇振荡45分钟。然后用50%乙醇10mmol Tris pH 7.4 1mmol EDTA 5mmol NaCl洗2次。沉淀加去离子水20μl，56℃10分钟然后离心。
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四、cDNA合成
20×dNTP 1μl、引物2(15μmol/L)1μl、5×RT buffer 5μl、提取液16.5μl，70℃5分钟然后加AMV 8U和RNasin 20U，42℃水浴1小时，95℃灭活5分钟。
五、PCR扩增
引物1和2(5μmol/L)各2μl，10×buffer 5μl、1×dNTP 2μl、Taq酶1U、逆转录产物2μl、去离子水37μl、石蜡油50μl。94℃预变性3分钟后，按94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分。
六、PCR反应产物分析
(一) 扩增产物电泳分析 取10μl反应产物加2μl溴酚蓝缓冲液，在2%琼脂糖凝胶(含EB50μg/ml)中电泳，100伏，30分钟，紫外检测仪下观察，在DNA分子标记181bp处出现荧光带者为阳性，否则为阴性。
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(二) 限制性内切酶鉴定 PCR阳性反应产物提取DNA后，分别用XbaI内切酶和TaqI内切酶进行酶切分析，分别于第59bp和122bp处以及78bp和103bp处有阳性带者为酶切阳性。
七、HDV标志检测
采用ELISA法检测患者血清HDAg、抗-HD和抗-HD-IgM，试剂由北京市肝炎研究所提供。
结果
一、RT-PCR扩增产物及酶切鉴定
用已证实HDV RNA阳性血清进行RT-PCR检测，可见产物为单一核酸条带，位于267bp和174bp之间，与由引物推算的产物大小181bp一致。将该靶基因序列经计算机酶切位点分析，发现存在2个酶切位点：(1) XbaI内切酶位点，能将扩增产物切为59bp和122bp 2个片段；(2) TaqI内切酶位点，能将扩增产物切为78bp和103bp 2个片段。电泳结果与之相等(图1)。
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1：XbaI酶切后；2：未经酶切；3：TaqI酶切后；M：DNA分子量标记PGEM-7Zf(+)/HaeⅢ
图1 RT-PCR扩增产物及其酶切结果
二、敏感性和特异性
所有3例已证实HDV RNA阳性血清经RT-PCR检测均阳性。17例HDV标志阴性血清未检测到HDV RNA。
三、HDV标志阳性血清标本检测结果
在23例HDV标志阳性患者中血清HDV RNA阳性者17例。HDV感染者血清HDV RNA与其他血清标志的关系见表1。
表1 HDV感染者血清HDV RNA
与其他血清标志关系 血清HDV标志
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例数
HDV
RNA(+)
HDAg
(+)
10
9
抗-HD-IgM
(+)
1
1
抗-HD
(+)
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8
3
HDAg与抗-HD-IgM
(+)
2
2
HDAg与抗-HD
(+)
2
2
合计
23
17
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讨论 由于HDV基因组中G+C比例高达60%，基因组全长约1.7kb，61%～70%碱基发生分子内配对，形成复杂的二、三级结构。另外由于HDV各株之间的变异性较大，使采用RT-PCR检测HDV RNA的成功率不高。我们采用Chao等[3]报道的序列，选择HDV RNA的保守区序列设计引物，从而确保了扩增产物的敏感性和特异性。扩增产物为181bp单一核酸条带与理论值相符。经酶切鉴定证明为HDV特异性扩增产物。3例已证实为HDV RNA阳性血清经RT-PCR检测结果均为阳性。而17例HDV标志阴性患者血清结果均为阴性。进一步证明RT-PCR是诊断HDV RNA简便快速、灵敏特异的方法，适合于在临床上推广应用。
在23例HDV标志阳性患者血清中，经RT-PCR技术检测有17例血清HDV RNA阳性，而且与血清HDAg和抗-HD-IgM检出的符合率较高，分别为14/15和3/3。有文献报道HDAg、抗-HD-IgM与HDV RNA是病毒复制指标，三者符合率较高[4，5]。我们的结果与之相符。另外在8例抗-HD阳性而其他指标阴性患者血清中检测出3例HDV RNA阳性，说明有病毒复制。因此应用RT-PCR技术检测HDV RNA有助于我们对HDV在体内的感染状态有更进一步认识，有助于临床诊断、治疗及预后判断等。
, 百拇医药
(本研究得到军事医学科学院微生物流行病学研究所杨瑞馥研究员指导，特此志谢)
本课题受河北省科委资助
参考文献
1 朱晓洁.有关丁型肝炎病原学研究的进展.国外医学流行病学传染病学分册，1994，21：68-70.
2 刘晓松，林勇.丁型肝炎的诊断和治疗进展.国外医学流行病学传染病学分册，1992，19：248-251.
3 Chao YC,Lee CM,Tang HS,et al.Molecular cloning and characterization of an isolate of hepatitis delta virus from Taiwan.Hepatology,1991,13:345-352.
, 百拇医药
4 Jardi R,Buti M,Cotrina M,et al.Determination of hepatitis delta virus RNA by polymerase chain reaction in acute and chronic delta infection.Hepatology,1995,21:25-29.
5 Saldanha J,Di Blasi F,Bas C,et al.Detection of hepatitis delta virus RNA in chronic liver disease.J Hepatol,1989,9:23-28.
(收稿：1999-01-19 修回：1999-09-14), http://www.100md.com
单位：050021 河北省石家庄市第五医院
关键词：
中华传染病杂志990416 丁型肝炎病毒(HDV)是一种缺陷性共价闭环单股负链RNA病毒，长约1700个核苷酸，由于HDV RNA G+C含量高易形成二级结构以及易变异等原因使逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功率不高[1，2]。我们根据Chao等[3]报道的HDV RNA序列建立了一种RT-PCR方法，并对43份肝炎血清进行了检测，现报道如下。
材料与方法
一、血清标本
3份HDV RNA阳性血清，由北京市肝炎研究所黄德庄教授赠送。23例血清HDV标志阳性患者均系在我院住院患者。其中HDAg阳性10例，抗-HD-IgM阳性1例，抗-HD阳性8例，HDAg与抗-HD-IgM阳性2例，HDAg与抗-HD阳性2例。另外17例HBsAg、HBeAg和抗-HBc阳性且HDV标志阴性患者。
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二、引物设计
根据Chao等[3]报道的序列，选择HDV基因组的保守区序列设计引物，引物1为5′-TGGGCAACATTCCGAGGGAC-3′，与HDV的核酸序列725～745位互补；引物2为5′-TTCGGGTCGGCATGGCATCT-3′与HDV的887～906位互补，由中国科学院北京科海医疗生物工程公司合成，扩增长度为181bp。
三、HDV RNA提取
取血清50μl，加100μl裂解液(含12g异硫氰酸胍，10ml 1mol/L Tris HCl pH 6.4,2.2ml 0.2mol/L EDTA,0.26ml Triton X-100)加玻璃粉液20μl混匀。室温间歇振荡45分钟。然后用50%乙醇10mmol Tris pH 7.4 1mmol EDTA 5mmol NaCl洗2次。沉淀加去离子水20μl，56℃10分钟然后离心。
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四、cDNA合成
20×dNTP 1μl、引物2(15μmol/L)1μl、5×RT buffer 5μl、提取液16.5μl，70℃5分钟然后加AMV 8U和RNasin 20U，42℃水浴1小时，95℃灭活5分钟。
五、PCR扩增
引物1和2(5μmol/L)各2μl，10×buffer 5μl、1×dNTP 2μl、Taq酶1U、逆转录产物2μl、去离子水37μl、石蜡油50μl。94℃预变性3分钟后，按94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分。
六、PCR反应产物分析
(一) 扩增产物电泳分析 取10μl反应产物加2μl溴酚蓝缓冲液，在2%琼脂糖凝胶(含EB50μg/ml)中电泳，100伏，30分钟，紫外检测仪下观察，在DNA分子标记181bp处出现荧光带者为阳性，否则为阴性。
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(二) 限制性内切酶鉴定 PCR阳性反应产物提取DNA后，分别用XbaI内切酶和TaqI内切酶进行酶切分析，分别于第59bp和122bp处以及78bp和103bp处有阳性带者为酶切阳性。
七、HDV标志检测
采用ELISA法检测患者血清HDAg、抗-HD和抗-HD-IgM，试剂由北京市肝炎研究所提供。
结果
一、RT-PCR扩增产物及酶切鉴定
用已证实HDV RNA阳性血清进行RT-PCR检测，可见产物为单一核酸条带，位于267bp和174bp之间，与由引物推算的产物大小181bp一致。将该靶基因序列经计算机酶切位点分析，发现存在2个酶切位点：(1) XbaI内切酶位点，能将扩增产物切为59bp和122bp 2个片段；(2) TaqI内切酶位点，能将扩增产物切为78bp和103bp 2个片段。电泳结果与之相等(图1)。
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1：XbaI酶切后；2：未经酶切；3：TaqI酶切后；M：DNA分子量标记PGEM-7Zf(+)/HaeⅢ
图1 RT-PCR扩增产物及其酶切结果
二、敏感性和特异性
所有3例已证实HDV RNA阳性血清经RT-PCR检测均阳性。17例HDV标志阴性血清未检测到HDV RNA。
三、HDV标志阳性血清标本检测结果
在23例HDV标志阳性患者中血清HDV RNA阳性者17例。HDV感染者血清HDV RNA与其他血清标志的关系见表1。
表1 HDV感染者血清HDV RNA
与其他血清标志关系 血清HDV标志
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例数
HDV
RNA(+)
HDAg
(+)
10
9
抗-HD-IgM
(+)
1
1
抗-HD
(+)
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8
3
HDAg与抗-HD-IgM
(+)
2
2
HDAg与抗-HD
(+)
2
2
合计
23
17
, 百拇医药
讨论 由于HDV基因组中G+C比例高达60%，基因组全长约1.7kb，61%～70%碱基发生分子内配对，形成复杂的二、三级结构。另外由于HDV各株之间的变异性较大，使采用RT-PCR检测HDV RNA的成功率不高。我们采用Chao等[3]报道的序列，选择HDV RNA的保守区序列设计引物，从而确保了扩增产物的敏感性和特异性。扩增产物为181bp单一核酸条带与理论值相符。经酶切鉴定证明为HDV特异性扩增产物。3例已证实为HDV RNA阳性血清经RT-PCR检测结果均为阳性。而17例HDV标志阴性患者血清结果均为阴性。进一步证明RT-PCR是诊断HDV RNA简便快速、灵敏特异的方法，适合于在临床上推广应用。
在23例HDV标志阳性患者血清中，经RT-PCR技术检测有17例血清HDV RNA阳性，而且与血清HDAg和抗-HD-IgM检出的符合率较高，分别为14/15和3/3。有文献报道HDAg、抗-HD-IgM与HDV RNA是病毒复制指标，三者符合率较高[4，5]。我们的结果与之相符。另外在8例抗-HD阳性而其他指标阴性患者血清中检测出3例HDV RNA阳性，说明有病毒复制。因此应用RT-PCR技术检测HDV RNA有助于我们对HDV在体内的感染状态有更进一步认识，有助于临床诊断、治疗及预后判断等。
, 百拇医药
(本研究得到军事医学科学院微生物流行病学研究所杨瑞馥研究员指导，特此志谢)
本课题受河北省科委资助
参考文献
1 朱晓洁.有关丁型肝炎病原学研究的进展.国外医学流行病学传染病学分册，1994，21：68-70.
2 刘晓松，林勇.丁型肝炎的诊断和治疗进展.国外医学流行病学传染病学分册，1992，19：248-251.
3 Chao YC,Lee CM,Tang HS,et al.Molecular cloning and characterization of an isolate of hepatitis delta virus from Taiwan.Hepatology,1991,13:345-352.
, 百拇医药
4 Jardi R,Buti M,Cotrina M,et al.Determination of hepatitis delta virus RNA by polymerase chain reaction in acute and chronic delta infection.Hepatology,1995,21:25-29.
5 Saldanha J,Di Blasi F,Bas C,et al.Detection of hepatitis delta virus RNA in chronic liver disease.J Hepatol,1989,9:23-28.
(收稿：1999-01-19 修回：1999-09-14), http://www.100md.com