口服丙型肝炎复合多表位DNA减毒鼠伤寒沙门活菌苗的实验研究
作者：黄建生 胡幼卿 解咏梅 许谆 张明徽 张丽芸 陈立茵 任大明
单位：黄建生、张丽芸、陈立茵 510515 广州，第一军医大学免疫学教研室；张明徽 第二军医大学免疫学教研室；胡幼卿，解咏梅，许谆，任大明 复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室
关键词：肝炎病毒，丙型；口服DNA疫苗；多表位疫苗；免疫应答
中华传染病杂志990405 【摘要】 目的 利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体，探讨丙型肝炎病毒(HCV)口服DNA疫苗的可行性。方法 把HCV复合多表位抗原基因PCX克隆到真核表达载体pcDNA3(CMV启动子)，构建HCV真核表达载体pcDNA3/PCX，转化减毒鼠伤寒沙门菌SL3261，获得HCV重组口服DNA活菌苗SL3261(pcDNA3/PCX)，免疫小鼠及家兔后，检测特异性免疫应答及安全性。结果 SL3261(pcDNA3/PCX)在小鼠及家兔中均可诱发低水平的特异性体液免疫及细胞免疫应答，免疫动物未见明显的毒性反应。结论 HCV口服减毒鼠伤寒沙门菌DNA疫苗可诱发特异性的免疫应答，为HCV疫苗的研究提供新的理论及实验依据。
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Immunogenicity of a multi-epitopes antigen gene of hepatitis C virus carried by attenuated Salmonella typhimurium SL3261
HUANG Jiansheng, HU Youqing, XIE Yongmei, et al.
Immunological Department, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To use Salmonella typhimurium as a vehicle to explore the possibility of oral live DNA vaccine against hepatitis C virus (HCV).Methods A multi-epitopes antigen gene of HCV was cloned into a eukaryotic vector pcDNA3 and introduced into attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to construct HCV oral live DNA vaccine candidate SL3261 (pcDNA3/PCX). The recombinant bacterium was used to orally immunize mice and rabbits. Meanwhile, specific humoral and cellular immune responses and safety were detected.Results Low level of specific antibodies and cellular immune responses were induced without obvious toxicity in the immunized mice and rabbits after oral administration of the live bacteria.Conclusion The results indicate that the HCV recombinant oral live DNA vaccine can induce specific immune responses which might be able to provide an alternative for HCV vaccines.
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【Key words】 Hepatitis C virus Oral DNA vaccine Multi-epitopes vaccine Immune response
既往认为减毒鼠伤寒沙门菌只能以原核方式表达外源抗原，但目前的研究发现，该菌是一种良好的活载体，可携带外源真核DNA表达载体，口服后可被肠道上皮细胞中的巨噬细胞所吞噬并表达外源抗原，经抗原提呈细胞处理后，诱发特异性的免疫应答[1-3]。我们已经在丙型肝炎病毒(HCV)基因产物中优选了5个高度保守的免疫原性强的T及/或B细胞表位，设计成一个HCV复合多表位抗原基因PCX与β-半乳糖苷酶(GZ)基因融合后，在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门菌等宿主中获得高效表达，产物为GZ-PCX抗原，并在小鼠及家兔中诱发了理想的特异性免疫应答，证实该多表位抗原具有良好的免疫原性及特异性[4,5]。本研究把PCX基因克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3后，并把重组质粒转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL3261[6]中，构建HCV减毒口服DNA活菌苗SL3261(pcDNA3/PCX)，免疫小鼠及家兔后，研究该重组DNA活菌苗在体内的免疫应答及其安全性。
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材料与方法
一、材料
(一) 质粒与菌株 质粒pUC119/PCX为复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室提供。质粒pcDNA3为第一军医大学钟雄林老师惠赠。减毒鼠伤寒沙门菌LB5000及SL3261为Stanford大学Stocker BAD教授及何笑松博士赠送。
(二) 试剂 HRP-兔抗鼠IgA、小牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-兔抗鼠IgG购自Calbiochem-Novabiochem International Inc;蛋白质GZ-PCX为我室纯化产品[5]；HCV EIA2 Kit(批号为971009)为华美生物工程公司产品。
(三) 动物 ICR小鼠及新西兰家兔均购自海军医学研究所实验动物中心，健康雌性4周龄小鼠，体重17～20g，每组4只；新西兰家兔体重2～2.5kg，每组3只。
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二、方法
(一) 真核表达载体的构建[7] pUC119/PCX、pcDNA3经HindⅢ/BamHⅠ双酶切后，用胶回收Kit(华舜生物工程公司)分别回收PCX片段及载体大片段，两者在12°C连接过夜，转化TG1，培养过夜后，挑取单菌落接种于2ml LB培养基中，37°C培养10小时，按常规碱变性方法抽提质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳。分别取比对照质粒pcDNA3略大的质粒进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切，2%琼脂糖电泳鉴定。
(二) 重组活菌苗的构建 参照文献[8]进行。质粒pcDNA3及pcDNA3/PCX分别先转化到LB5000后，抽提被修饰的质粒后再转化SL3261，获得重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活菌苗SL3261(pcDNA3)及SL3261(pcDNA3/PCX)。
(三) 口服免疫 口服免疫方法参照文献[8]进行。免疫剂量小鼠及家兔分别为1×108 cfu/次及2×109cfu/次，隔周相同剂量连续免疫4次，隔2周采集血清1次。
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(四) 免疫血清特异性抗体的检测 1.检测抗-GZ-PCX IgG：ELISA方法参照文献[7]，以GZ-PCX包被，二抗为HRP-羊抗免及HRP-兔抗鼠IgG,1∶10 000稀释。2.检测鼠抗-GZ-PCX IgA:ELISA方法同上，以GZ-PCX包被，二抗为HRP-兔抗鼠IgA,以1∶1 000稀释。3.检测鼠sIgG及sIgA：小鼠放净血后，取约10cm小肠及全肺，用0.8ml PBS分别灌洗完全后，离心取上清作为一抗，二抗为HRP-兔抗鼠IgG或IgA,1∶1000稀释。4.兔抗GZ-PCX血清与HCV EIA2 Kit包被抗原反应：分别用免疫血清及空白对照血清(1∶10稀释)与华美HCV EIA2 Kit包被抗原反应，检测免疫血清识别HCV基因表达产物的特异性，二抗为HRP-羊抗人IgG,1∶10000稀释。5.CD4+、CD8+淋巴细胞亚群的检测：自小鼠眼球取血2～3滴，取20μl抗凝血，加入20μl的抗CD4或抗CD8荧光抗体，作用15分钟后加入200μl红细胞裂解液，5分钟后加入1ml PBS,3 000r/min 2分钟，沉淀用400μl PBS重悬后，在Facscalibur流式细胞仪(Becton Dickinson Inc)上检测CD4+及CD8+T细胞数，并计算CD4+/CD8+比值。6.迟发性超敏反应(DTH)：用GZ-PCX抗原注射于小鼠后足趾皮下或家兔腿部皮内，注射剂量分别为10、50μg，观察注射部位的变化。7.安全性：免疫各周分别称取各组小鼠平均体重，观察小鼠的存活率及肝脾大小。
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结果
一、重组菌株的构建
PCX克隆到pcDNA3后，质粒经HindⅢ/BamHⅠ酶切后，可切出约270bp的目的片段，重组SL3261(pcDNA3/PCX)中可抽提出质粒DNA pcDNA3/PCX，说明重组正确。
二、抗-GZ-PCX IgG的检测结果
SL3261(pcDNA3/PCX)口服免疫小鼠及家兔后，分别于第8周时始可检测到低水平的抗-GZ-PCX IgG，并于第10周时滴度达到最高，分别为1∶400及1∶1600(图1)，与载体及空白对照组差异均存在显著性(P<0.05)。家兔所诱发的免疫应答持续时间更长，于4月后特异性抗体仍呈阳性，但小鼠中则只出现一过性的抗体，维持时间仅1月左右。
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■兔SL3261(pcDNA3/PCX) ▲兔SL3261(pcDNA3) ○兔空白对照
*鼠SL3261(pcDNA3/PCX) ●鼠SL3261(pcDNA3) ◆鼠空白对照
图1 免疫家兔及小鼠抗-GZ-PCX IgG(抗体1∶100稀释)
的检测结果
三、鼠抗-GZ-PCX IgGA及抗-GZ-PCX sIgG及sIgA的检测结果
SL3261(pcDNA3/PCX)组小鼠血清中未能检测到-GZ-PcX IgA。小鼠肠道及肺泡灌洗液中sIgG及sIgA均略有升高，但与空白对照组相比，差异未见显著性(P>0.05,图2)。
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■SL3261(pcDNA3/PCX) □空白对照
图2 鼠抗-GZ-PCX抗体(第12周)的检测结果
四、兔免疫血清与HCV EIA2 Kit包被抗原反应的特异性
免疫后第10周，兔SL3261(pcDNA3/PCX)血清可被EIA2包被的HCV抗原所特异识别，平均A值为0.097，而SL3261(pcDNA3)组及空白对照组则分别0.023及0.025，差异有显著性(P<0.05)，提示免疫血清中含有抗-HCV的特异性抗体。
五、淋巴细胞亚群分类
SL3261(pcDNA3/PCX)免疫小鼠后10周，其CD4/CD8平均比值为3.10，而空白对照组为3.94，两者比较差异无显著性(P>0.2)。但免疫后CD8+ T细胞比例升高，对疫苗诱发特异性保护作用可能有一定作用。
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六、DTH
疫苗组小鼠诱发针对GZ-PCX蛋白的DTH反应，免疫小鼠的足趾出现明显的红肿，于注射后第3天消失，而载体及空白对照组则未见反应。免疫家兔的DTH反应区平均分别为0.9cm、0.3cm(P<0.05)及0(P<0.001)，可见口服DNA疫苗免疫后可诱发针对GZ-PCX基因中的PCX复合表位的DTH反应。
七、安全性
免疫后小鼠体重出现一过性下降，但8周后升至正常，小鼠及家兔行为未见异常，无腹泻及死亡，处死小鼠及家兔后未见肝脾明显肿大。
讨论
DNA疫苗是近年来疫苗研究中最鼓舞人心的进展之一，其主要方法是把外源DNA直接注射到肌肉细胞或上皮细胞等，使之获得表达并诱发特异性的免疫学反应。但最近有人报道，借助其它一些细菌载体，如减毒鼠伤寒沙门菌等，DNA疫苗亦可进行口服免疫。Darji等[1,2]报道，他们把编码Listeria monocytogenes的真核表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门菌中，免疫小鼠后，活菌苗可能通过淋巴结穿过肠上皮的细胞壁，侵入吞噬细胞后表达了目的蛋白，并诱发了高水平的特异性免疫应答及保护力。Sizemore等[3]也用该系统表达了真核载体pCMVβ基因。可见利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体表达真核基因是行之有效的。
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我们把人工合成的HCV复合多表位抗原基因克隆于带CMV启动子的真核表达载体上，利用减毒鼠伤寒沙门菌SL3261作为载体，也成功地诱发了低水平的特异性免疫应答。由于所表达的抗原分子量较小，表达产物在体内可能不够稳定，或由于口服活菌苗在体内寄生的数量较少，导致所诱发的抗体反应较弱。以前，我们曾把pcDNA3/PCX直接肌肉注射免疫小鼠及家兔，结果在家兔诱发了较高的特异性抗体反应，但持久性较差(最高1∶3 200)。与带原核启动子的SL3261(pWR/PCX)活菌苗相比，其诱发的免疫应答也较弱，可能原因是原核表达载体表达的目的抗原分子量较大，表达量较高，因此所诱发的免疫应答也较强。
淋巴细胞亚群分类结果说明，CD8+ T细胞在活菌苗免疫后比例升高，由于CD8+细胞在HCV的免疫应答中发挥重要的作用，因此该活菌苗免疫后CD8+T细胞升高可能具有一定意义。迟发性超敏反应的结果也说明该活菌苗可诱发特异性的细胞免疫应答。
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该HCV复合多表位口服DNA活菌苗的动物免疫结果已初步证实，HCV口服DNA活菌苗可诱发特异性体液及细胞免疫应答，为HCV疫苗的研究提供了新的途径。对HCV抗原基因进行优选及加入其它辅助分子，如霍乱毒素B亚单位，可望诱发高水平的体液及细胞免疫应答。
本课题为国家自然科学基金资助课题(编号：39780002)
参考文献
1 Darji A, Guzman CA, Geratel B, et al. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell,1997,91:765-775.
2 Lowrie DB. DNA vaccination exploits normal biology. Nature Medicine, 1998,4:147-148.
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3 Sizemore DR, Branstrom AA, Sadoff JC. Attenuated bacteria as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. Vaccine, 1997,15:804-807.
4 黄建生，解咏梅，林元凯，等.丙型肝炎病毒复合多表位抗原基因的高效表达及免疫原性研究.微生物学报，1999，39:87-90.
5 黄建生，解咏梅，沈先荣，等.HCV多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析.复旦学报，1998，37：551-554.
6 Brown A, Hormaeche CE, Demarco de Hormache R, et al. An attenuated aroA Salmonella typhimurium vaccine ellicts humoral and cellular immunity to cloney β-galactosidase in mice. J Infect Dis, 1987,155:86-92.
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7 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laborarory Press, 1989.53-70.
8 Huang JS, Wang CC, Ren DM, et al. Immunogenicity of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of Plasmodium falciparum. J Med Col PLA, 1997,12:166-171.
(收稿：1998-11-20 修回：1999-04-18), 百拇医药
单位：黄建生、张丽芸、陈立茵 510515 广州，第一军医大学免疫学教研室；张明徽 第二军医大学免疫学教研室；胡幼卿，解咏梅，许谆，任大明 复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室
关键词：肝炎病毒，丙型；口服DNA疫苗；多表位疫苗；免疫应答
中华传染病杂志990405 【摘要】 目的 利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体，探讨丙型肝炎病毒(HCV)口服DNA疫苗的可行性。方法 把HCV复合多表位抗原基因PCX克隆到真核表达载体pcDNA3(CMV启动子)，构建HCV真核表达载体pcDNA3/PCX，转化减毒鼠伤寒沙门菌SL3261，获得HCV重组口服DNA活菌苗SL3261(pcDNA3/PCX)，免疫小鼠及家兔后，检测特异性免疫应答及安全性。结果 SL3261(pcDNA3/PCX)在小鼠及家兔中均可诱发低水平的特异性体液免疫及细胞免疫应答，免疫动物未见明显的毒性反应。结论 HCV口服减毒鼠伤寒沙门菌DNA疫苗可诱发特异性的免疫应答，为HCV疫苗的研究提供新的理论及实验依据。
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Immunogenicity of a multi-epitopes antigen gene of hepatitis C virus carried by attenuated Salmonella typhimurium SL3261
HUANG Jiansheng, HU Youqing, XIE Yongmei, et al.
Immunological Department, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To use Salmonella typhimurium as a vehicle to explore the possibility of oral live DNA vaccine against hepatitis C virus (HCV).Methods A multi-epitopes antigen gene of HCV was cloned into a eukaryotic vector pcDNA3 and introduced into attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to construct HCV oral live DNA vaccine candidate SL3261 (pcDNA3/PCX). The recombinant bacterium was used to orally immunize mice and rabbits. Meanwhile, specific humoral and cellular immune responses and safety were detected.Results Low level of specific antibodies and cellular immune responses were induced without obvious toxicity in the immunized mice and rabbits after oral administration of the live bacteria.Conclusion The results indicate that the HCV recombinant oral live DNA vaccine can induce specific immune responses which might be able to provide an alternative for HCV vaccines.
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【Key words】 Hepatitis C virus Oral DNA vaccine Multi-epitopes vaccine Immune response
既往认为减毒鼠伤寒沙门菌只能以原核方式表达外源抗原，但目前的研究发现，该菌是一种良好的活载体，可携带外源真核DNA表达载体，口服后可被肠道上皮细胞中的巨噬细胞所吞噬并表达外源抗原，经抗原提呈细胞处理后，诱发特异性的免疫应答[1-3]。我们已经在丙型肝炎病毒(HCV)基因产物中优选了5个高度保守的免疫原性强的T及/或B细胞表位，设计成一个HCV复合多表位抗原基因PCX与β-半乳糖苷酶(GZ)基因融合后，在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门菌等宿主中获得高效表达，产物为GZ-PCX抗原，并在小鼠及家兔中诱发了理想的特异性免疫应答，证实该多表位抗原具有良好的免疫原性及特异性[4,5]。本研究把PCX基因克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3后，并把重组质粒转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL3261[6]中，构建HCV减毒口服DNA活菌苗SL3261(pcDNA3/PCX)，免疫小鼠及家兔后，研究该重组DNA活菌苗在体内的免疫应答及其安全性。
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材料与方法
一、材料
(一) 质粒与菌株 质粒pUC119/PCX为复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室提供。质粒pcDNA3为第一军医大学钟雄林老师惠赠。减毒鼠伤寒沙门菌LB5000及SL3261为Stanford大学Stocker BAD教授及何笑松博士赠送。
(二) 试剂 HRP-兔抗鼠IgA、小牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-兔抗鼠IgG购自Calbiochem-Novabiochem International Inc;蛋白质GZ-PCX为我室纯化产品[5]；HCV EIA2 Kit(批号为971009)为华美生物工程公司产品。
(三) 动物 ICR小鼠及新西兰家兔均购自海军医学研究所实验动物中心，健康雌性4周龄小鼠，体重17～20g，每组4只；新西兰家兔体重2～2.5kg，每组3只。
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二、方法
(一) 真核表达载体的构建[7] pUC119/PCX、pcDNA3经HindⅢ/BamHⅠ双酶切后，用胶回收Kit(华舜生物工程公司)分别回收PCX片段及载体大片段，两者在12°C连接过夜，转化TG1，培养过夜后，挑取单菌落接种于2ml LB培养基中，37°C培养10小时，按常规碱变性方法抽提质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳。分别取比对照质粒pcDNA3略大的质粒进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切，2%琼脂糖电泳鉴定。
(二) 重组活菌苗的构建 参照文献[8]进行。质粒pcDNA3及pcDNA3/PCX分别先转化到LB5000后，抽提被修饰的质粒后再转化SL3261，获得重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活菌苗SL3261(pcDNA3)及SL3261(pcDNA3/PCX)。
(三) 口服免疫 口服免疫方法参照文献[8]进行。免疫剂量小鼠及家兔分别为1×108 cfu/次及2×109cfu/次，隔周相同剂量连续免疫4次，隔2周采集血清1次。
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(四) 免疫血清特异性抗体的检测 1.检测抗-GZ-PCX IgG：ELISA方法参照文献[7]，以GZ-PCX包被，二抗为HRP-羊抗免及HRP-兔抗鼠IgG,1∶10 000稀释。2.检测鼠抗-GZ-PCX IgA:ELISA方法同上，以GZ-PCX包被，二抗为HRP-兔抗鼠IgA,以1∶1 000稀释。3.检测鼠sIgG及sIgA：小鼠放净血后，取约10cm小肠及全肺，用0.8ml PBS分别灌洗完全后，离心取上清作为一抗，二抗为HRP-兔抗鼠IgG或IgA,1∶1000稀释。4.兔抗GZ-PCX血清与HCV EIA2 Kit包被抗原反应：分别用免疫血清及空白对照血清(1∶10稀释)与华美HCV EIA2 Kit包被抗原反应，检测免疫血清识别HCV基因表达产物的特异性，二抗为HRP-羊抗人IgG,1∶10000稀释。5.CD4+、CD8+淋巴细胞亚群的检测：自小鼠眼球取血2～3滴，取20μl抗凝血，加入20μl的抗CD4或抗CD8荧光抗体，作用15分钟后加入200μl红细胞裂解液，5分钟后加入1ml PBS,3 000r/min 2分钟，沉淀用400μl PBS重悬后，在Facscalibur流式细胞仪(Becton Dickinson Inc)上检测CD4+及CD8+T细胞数，并计算CD4+/CD8+比值。6.迟发性超敏反应(DTH)：用GZ-PCX抗原注射于小鼠后足趾皮下或家兔腿部皮内，注射剂量分别为10、50μg，观察注射部位的变化。7.安全性：免疫各周分别称取各组小鼠平均体重，观察小鼠的存活率及肝脾大小。
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结果
一、重组菌株的构建
PCX克隆到pcDNA3后，质粒经HindⅢ/BamHⅠ酶切后，可切出约270bp的目的片段，重组SL3261(pcDNA3/PCX)中可抽提出质粒DNA pcDNA3/PCX，说明重组正确。
二、抗-GZ-PCX IgG的检测结果
SL3261(pcDNA3/PCX)口服免疫小鼠及家兔后，分别于第8周时始可检测到低水平的抗-GZ-PCX IgG，并于第10周时滴度达到最高，分别为1∶400及1∶1600(图1)，与载体及空白对照组差异均存在显著性(P<0.05)。家兔所诱发的免疫应答持续时间更长，于4月后特异性抗体仍呈阳性，但小鼠中则只出现一过性的抗体，维持时间仅1月左右。
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■兔SL3261(pcDNA3/PCX) ▲兔SL3261(pcDNA3) ○兔空白对照
*鼠SL3261(pcDNA3/PCX) ●鼠SL3261(pcDNA3) ◆鼠空白对照
图1 免疫家兔及小鼠抗-GZ-PCX IgG(抗体1∶100稀释)
的检测结果
三、鼠抗-GZ-PCX IgGA及抗-GZ-PCX sIgG及sIgA的检测结果
SL3261(pcDNA3/PCX)组小鼠血清中未能检测到-GZ-PcX IgA。小鼠肠道及肺泡灌洗液中sIgG及sIgA均略有升高，但与空白对照组相比，差异未见显著性(P>0.05,图2)。
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图2 鼠抗-GZ-PCX抗体(第12周)的检测结果
四、兔免疫血清与HCV EIA2 Kit包被抗原反应的特异性
免疫后第10周，兔SL3261(pcDNA3/PCX)血清可被EIA2包被的HCV抗原所特异识别，平均A值为0.097，而SL3261(pcDNA3)组及空白对照组则分别0.023及0.025，差异有显著性(P<0.05)，提示免疫血清中含有抗-HCV的特异性抗体。
五、淋巴细胞亚群分类
SL3261(pcDNA3/PCX)免疫小鼠后10周，其CD4/CD8平均比值为3.10，而空白对照组为3.94，两者比较差异无显著性(P>0.2)。但免疫后CD8+ T细胞比例升高，对疫苗诱发特异性保护作用可能有一定作用。
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六、DTH
疫苗组小鼠诱发针对GZ-PCX蛋白的DTH反应，免疫小鼠的足趾出现明显的红肿，于注射后第3天消失，而载体及空白对照组则未见反应。免疫家兔的DTH反应区平均分别为0.9cm、0.3cm(P<0.05)及0(P<0.001)，可见口服DNA疫苗免疫后可诱发针对GZ-PCX基因中的PCX复合表位的DTH反应。
七、安全性
免疫后小鼠体重出现一过性下降，但8周后升至正常，小鼠及家兔行为未见异常，无腹泻及死亡，处死小鼠及家兔后未见肝脾明显肿大。
讨论
DNA疫苗是近年来疫苗研究中最鼓舞人心的进展之一，其主要方法是把外源DNA直接注射到肌肉细胞或上皮细胞等，使之获得表达并诱发特异性的免疫学反应。但最近有人报道，借助其它一些细菌载体，如减毒鼠伤寒沙门菌等，DNA疫苗亦可进行口服免疫。Darji等[1,2]报道，他们把编码Listeria monocytogenes的真核表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门菌中，免疫小鼠后，活菌苗可能通过淋巴结穿过肠上皮的细胞壁，侵入吞噬细胞后表达了目的蛋白，并诱发了高水平的特异性免疫应答及保护力。Sizemore等[3]也用该系统表达了真核载体pCMVβ基因。可见利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体表达真核基因是行之有效的。
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我们把人工合成的HCV复合多表位抗原基因克隆于带CMV启动子的真核表达载体上，利用减毒鼠伤寒沙门菌SL3261作为载体，也成功地诱发了低水平的特异性免疫应答。由于所表达的抗原分子量较小，表达产物在体内可能不够稳定，或由于口服活菌苗在体内寄生的数量较少，导致所诱发的抗体反应较弱。以前，我们曾把pcDNA3/PCX直接肌肉注射免疫小鼠及家兔，结果在家兔诱发了较高的特异性抗体反应，但持久性较差(最高1∶3 200)。与带原核启动子的SL3261(pWR/PCX)活菌苗相比，其诱发的免疫应答也较弱，可能原因是原核表达载体表达的目的抗原分子量较大，表达量较高，因此所诱发的免疫应答也较强。
淋巴细胞亚群分类结果说明，CD8+ T细胞在活菌苗免疫后比例升高，由于CD8+细胞在HCV的免疫应答中发挥重要的作用，因此该活菌苗免疫后CD8+T细胞升高可能具有一定意义。迟发性超敏反应的结果也说明该活菌苗可诱发特异性的细胞免疫应答。
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该HCV复合多表位口服DNA活菌苗的动物免疫结果已初步证实，HCV口服DNA活菌苗可诱发特异性体液及细胞免疫应答，为HCV疫苗的研究提供了新的途径。对HCV抗原基因进行优选及加入其它辅助分子，如霍乱毒素B亚单位，可望诱发高水平的体液及细胞免疫应答。
本课题为国家自然科学基金资助课题(编号：39780002)
参考文献
1 Darji A, Guzman CA, Geratel B, et al. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell,1997,91:765-775.
2 Lowrie DB. DNA vaccination exploits normal biology. Nature Medicine, 1998,4:147-148.
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3 Sizemore DR, Branstrom AA, Sadoff JC. Attenuated bacteria as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. Vaccine, 1997,15:804-807.
4 黄建生，解咏梅，林元凯，等.丙型肝炎病毒复合多表位抗原基因的高效表达及免疫原性研究.微生物学报，1999，39:87-90.
5 黄建生，解咏梅，沈先荣，等.HCV多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析.复旦学报，1998，37：551-554.
6 Brown A, Hormaeche CE, Demarco de Hormache R, et al. An attenuated aroA Salmonella typhimurium vaccine ellicts humoral and cellular immunity to cloney β-galactosidase in mice. J Infect Dis, 1987,155:86-92.
, http://www.100md.com
7 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laborarory Press, 1989.53-70.
8 Huang JS, Wang CC, Ren DM, et al. Immunogenicity of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of Plasmodium falciparum. J Med Col PLA, 1997,12:166-171.
(收稿：1998-11-20 修回：1999-04-18), 百拇医药