龋变牙面出现氧化还原电位(Eh)机理的研究
作者：黄力子 王成龙 阎鹏 李振钢 关素敏 王多宁 唐荣银 李刚
单位：710032西安第四军医大学口腔医学院口腔预防医学教研室(黄力子、王成龙、阎鹏、李振钢、关素敏、唐荣银、李刚)，基础部化学教研室(王多宁)
关键词：龋病；氧化还原电位(Eh)；超氧化物阴离子自由基；龋病发病机理的生物电化学理论
临床口腔医学杂志990401 提 要 目的 探讨龋变牙面出现氧化还原电位(Eh)的机理。方法 实验1采用化学发光法检测患者龋变组织及唾液中的超氧化物阴离子自由基含量并进行统计分析比较；实验2利用牙齿表面电位测试仪测出龋变牙面Eh后，分别在龋洞内滴入0.5ml生理盐水和SOD生理盐水稀释液，观察二者对Eh的影响。结果 实验1发现龋变组织内超氧化物阴离子自由基含量高于该患者唾液近100倍；实验2发现龋洞内滴入SOD生理盐水稀释液后，其Eh迅速由负向正转化。说明SOD清除龋洞内自由基可减小Eh负电位。结论 龋变牙面出现Eh负电位与龋变组织内含有高浓度超氧化物阴离子自由基有关，自由基的未配对的电子是形成Eh负电位的物质基础。
A Study of Redox Potential(Eh) Formalion on Decayed Tooth Surface
Huang Lizi,Wang Chenglong,Yan Peng et al.
Department of Preventive Dentistry, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi an 7100328
Abstract Objective To study the mechanism of redox-potential(Eh) formation on decayed tooth surface. Methods In experiment l, the values of superoxide anion free radicals in decayed tooth tissue and in saliva were measured by chemiluminescence method. In experiment 2, after measuring the Eh on decayed tooth surface by tooth surface potential monitor, 0.05ml of normal saline and salinediluted SOD solution were dropped into the decayed tooth tissue respectively to observe their effects to Eh. Results It was found that the value of superoxide anion free radicals in decayed tooth tissue was significantly higher than that in saliva(statyistically differentP<0.05). When SOD solution was dropped into decayed tooth tissue the negative Eh was greatly decreased, indicating that SOD can remove the free radicals in decayed tissue hence reducing the negative Eh. Conclusion The negative Eh on decayed tooth surface is related to the high concentration of superoxide free radicals and the unpaired electron of free radicals is the basis for negative Eh formation.
Key words Caries Redox potential(Eh) Superoxide anion free radical Bio-electrochemical theory of cariogenesis.
1987～1990年作者在临床上发现龋变牙面相对于同一患牙的正常牙面经常表现为负电位〔1〕，即出现负的氧化还原电位(Eh)。这一客观事实此后反复由王成龙、阎鹏等证实〔2，3〕。根据这一临床事实，结合现代电化学理论和口腔医学有关文献，1990年作者黄力子(在全国第二届龋病研究讨论会上)提出了“龋病发病机理的生物电化学理论”的新假说〔4，5〕，1996年唐林、黄力子在实验室用电化学方法在离体人牙上制成了深达牙本质的电化学人工龋模型〔6，7〕，证实了电化学的阳极氧化作用对牙齿确有脱矿破坏的电化学腐蚀作用。1997年李振钢证实电化学人工龋的脱矿量与通过电解池的电量成正比，符合电化学的法拉第定律〔8〕。为进一步证实新假说。同年王成龙发现：当在临床上去除龋洞内的龋变组织后，龋变牙面的Eh负电位立即消失，证明生物电来源于龋变组织〔9〕。本实验旨在证实龋变组织内可能存在的自由基是产生生物电的物质基础。
材料和方法
1.主要仪器和试剂
牙齿表面电位测试仪(第四军医大学和西安电子科技大学联合研制〔1〕)。
发光光度计(DG 3030型，华东电子管厂)
Luminol液(0.1mmol/L，第四军医大学化学教研室制备)
超氧化物歧化酶(简称SOD，甘肃夏河生物制剂厂制,用生理盐水稀释至0.1mg/ml)
2.病例选择
临床选择有龋洞但无牙髓炎症状，检查无穿髓点的患者34例，不计年龄、性别。
3.实验方法
实验1选择19例患者，每例选1个龋洞。先用牙齿表面电位测试仪测试，全部Eh为负电位。然后从龋洞内取出龋变组织，1/10000分析天平称重后用生理盐水按10%比例稀释，匀浆，1000 r/min离心5min，取上清液，6小时内进行加Luminol或加SOD+Luminol两种实验，分别测定两种实验的发光强度。以相同方法测定同一患者的唾液作为对照，进行统计分析。
实验2选择15例患者，每例选1个龋洞。先用牙齿表面电位测试仪测试，待获得10个连续稳定的数据，取其均数作为对照值后，不间断测量，先在龋洞内滴入0.05ml(1滴)生理盐水，测量10个连续数据作均数。此后，再在龋洞内滴入0.05mlSOD生理盐水稀释液，测量10个连续数据作均数。对获得的3组数值进行方差分析。
结 果
1.实验1得出19例患者的实验组(龋变组织)和对照组(唾液)的发光值和SOD的抑制发光值，说明龋变组织和唾液中均含有超氧化物阴离子自由基，但含量不同。龋变组织加入SOD后，绝大部分发光值被抑制,说明它含有的超氧化物阴离子自由基量大；而唾液加入SOD后，只有部分发光值被抑制,说明它含有的超氧化物阴离子自由基量小，具体结果(表1、2)。
表1 加SOD对两组发光值的影响
单位：发光值/(s.mg) 组别
对 照 组
对 照 组
t
p
t
p
L组
SOD+L组
17.40±28.26
2.47
<0.05
0.26±0.16
2.75
<0.01
1.77±1.91
0.13±0.04
表2 两组抑制发光值的比较
单位：发光值/(s.mg) 组别
*t
p
实验组
15.64±26.85
2.09
<0.05
对照组
0.17±0.17
*由表1中Σ[L组-(SOD+L组)]/19演算而得。
2.实验2得出15例患者的对照组，加生理盐水组和加SOD组共3组数据，相互间有差异(表3)。
表3 生理盐水及SOD对龋变牙面电位的影响(
,mV) 分 组例数
电 位
对照组
15
-232.122±35.29
*
生理盐水组
15
-228.620±22.89
**
SOD组
15
-147.058±27.32
***
*对照组与生理盐水组之间相差不显著,P>0.05
**生理盐水组与SOD组之间相差极显著，P<0.01
***对照组与SOD组之间相差极显著,P<0.01
讨 论
1.活性氧(包括羟自由基、超氧化物阴离子自由基等)与化学发光剂Luminol(3—氨基邻苯二甲酰肼)反应，使之激活，当它返回基态时，就向外发光，利用发光光度计可进行计数；超氧化物歧化酶能特异性抑制超氧化物阴离子自由基，所以能抑制超氧化物阴离子自由基引起的Luminol发光。根据被测物发光强度是否被抑制及抑制的程度，从而可间接检测出超氧化物阴离子自由基的含量。这就是实验1的原理。实验1结果表明：实验组(龋变组织)和对照组(唾液)均含有超氧化物阴离子自由基，但实验组中超氧化物阴离子自由基的水平远远高于对照组，两组之间的抑制发光值相差为15.64/0.17=92倍，表明两组间超氧化物阴离子自由基含量相差近100倍，龋变组织内自由基的含量显著高于唾液(P<0.05)。自由基的特点是具有未配对的电子，这种未配对的电子很容易脱离自由基的电子轨道而成为自由电子。自由基的大量存在即表明自由电子的大量存在，而自由电子的大量存在必然会使龋变组织形成Eh负电位，成为原电池的阳极，产生腐蚀电子流通向龋洞底部牙齿组织，促使龋变不断向牙髓发展。
2.为进一步证实上述设想，证实自由基与龋变牙面Eh负电位的关系，本研究设计了实验2。实验2利用SOD有特异性清除超氧化物阴离子自由基的特性，观察用SOD液滴入龋洞内将自由基基本清除后Eh负电位值是否会随之减小，从而证实自由基与Eh负电位的客观关系。表3的结果说明：在不中断牙齿表面电位测量的情况下，龋洞内滴入生理盐水，Eh负电位无显著变化，而一旦滴入SOD液，使龋洞内自由基得到基本清除，则Eh负电位迅速减小，Eh从负向正转化。应用SNK检验进行组间两两比较表明：加SOD组的Eh负电位，极显著地小于对照组和加生理盐水组(P<0.01)。
3.本研究实验1证实了出现Eh负电位的龋变组织含有比唾液高出近100倍的超氧化物阴离子自由基，实验2证实用SOD清除龋变组织内自由基可以极显著地减小Eh负电位，两个实验相互联系，相互补充，证明龋变牙面出现Eh负电位的机理是由于龋变组织内含有大量超氧化物阴离子自由基，这些自由基带有的未配对的、容易脱离自由基电子轨道的电子，是形成Eh负电位的物质基础。
4.自1890年Miller提出化学细菌学说以来，人们把酸脱矿当作产生龋病的唯一机理。本项研究所获得的新的实验事实，是在20世纪末人类科学技术水平已有极大提高之后，应用电子学、电化学和自由基生物学等现代科学理论技术获得的。这些实验事实至少能提醒人们，研究龋病机理，除了考虑酸脱矿之外，也应该考虑过去没有注意到的生物电、电化学腐蚀、自由基的组织破坏作用等因素。有人提出：龋变牙面出现Eh负电位，含有高浓度超氧化物阴离子自由基，是龋变的原因，还是龋变的结果？本文对这一问题还不能作结论。阎鹏的《龋变组织和牙菌斑内自由基含量与牙面氧化还原电位(Eh)关系的实验研究》中，已经证实了引起龋病发病的牙菌斑中也含有高浓度超氧化物阴离子自由基，它也可以引起菌斑牙面出现Eh负电位，而且，这种Eh负电位也可以用SOD将其减小。这方面的研究结果，将另文报道。
注：本课题由国家自然科学基金资助(3870830)
参考文献
1 黄力子 龋病病变中的生物电现象初探，中华口腔医学杂志，1993；28(5)：297.
2 王成龙、阎鹏、黄力子等.龋变牙面负电位形成机理的研究，实用口腔医学杂志，1998；14(3)：195.
3 阎鹏、黄力子、王成龙等.超氧化物歧化酶对龋变牙面电位影响的临床实验研究，华西口腔医学杂志，1998；16(3)：284.
4 黄力子.龋病发病机理的生物电化学理论.成都：第二届全国龋病研讨会论文摘要汇编.1990：17.
5 黄力子、徐如生.龋病是发生在牙齿上的电化学腐蚀，科学(Scientific American, Chinese Edition),1995;(7):52.
6 唐林 黄力子.电化学因素对牙齿脱矿的影响。第四军医大学学报.1996；1795)：393.
7 黄力子、唐林、徐如生等.龋病发病机理的生物电化学理论(电化学人工龋模型的实验研究)，中华口腔医学杂志.1997；32(1)：34.
8 李振钢.用电化学人工龋模型探讨龋病预防原则和措施的实验研究.第四军医大学学位论文.西安：1997；39.
9 王成龙.龋病发病机理的生物电化学理论与自由基.第四军医大学学位论文.西安：1997：27.
(收稿：1999—06—28)