生脉成骨胶囊预防激素性股骨头缺血性坏死的实验研究
作者：袁 浩 李 雄 何 伟 樊粤光 方 斌 张德兴
单位：广州中医药大学 第一附属医院全国中医髋病治疗中心 广东 广州 510405
关键词：股骨头坏死；中医药疗法；生脉成骨胶囊；预防应用；动物实验
中国中医骨伤科990402 摘要 为了评价生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死的预防作用。将120只SD大白鼠随机分成6组，即正常对照组、激素造模组、激素加安妥明应用组、激素加生脉成骨胶囊高、中、低剂量组。全部动物同时开始实验，于实验后第4周、第8周、第12周分三批处死动物进行脏器标本检查、股骨头大体形态及光镜检查，墨汁灌注透明片观察，并采用Metamoph全自动图象分析处理系统进行病理图象的分析处理、骨的组织形态学和计量学分析，结果进行统计学处理。证实生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死有明显的预防作用，其预防作用优于安妥明。
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中图分类法：R681.4 文献标识码：A 文章编号：1005-0205(1999)04-0004-05
An Experimental Research on Prevention of
Glucocorticoids-induced ANFH with ‘shengmaichenggu’ capsule
Yuan Hao,Li Xiong,He Wei,et al
The Nationwide TCM Clinic & Research Center of the Hip Diseases
The First affiliated Hospital of Guang Zhou TCM University
, 百拇医药
ABSTRACT To evaluate the prevention of glucocorticoids-induced avascular necrosis of the femoral head with ‘shengmaichenggu’ capsule,120 adult SD rats were divided into six groups randomly,ie normal control group,glucocorticoid-model group,clofibratum group and three-dose groups including high-dose,medium-dose and low-dose groups.All animals were performed the experiment simultaneously and were killed at the time of fourth week,eighth week,twelfth week respectively.Their viscera specimen,the gross shape and microscope and ink-perfused specimens of the femoral head were observed and analyzed by auto-photograh software of Metamoph.In the end,the prevention effect of shengmai chengigu capsule was evaluated.The experiment confirmed that shengmaichenggu capsule has a remarkable effect to ANFH and the effect is better than clofibratum.
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KEY WRODS Avascular necrosis of the femoral head TCM ‘shengmaichenggu’ Capsule Prevention Experimental research
长期或间断大量使用肾上腺皮质类固醇激素，能引起股骨头缺血性坏死，在临床上已逐步被人们所重视。自1957年pietrogrami和Mastromarino报道第一例由于治疗天疱疮连续应用四年激素而发生骨坏死的报道[1]以来，其发病率逐年迅猛增长。据文献报道国外1960年以前仅见20余例，1964～1977年猛增至450例以上。[2]据广州中医药大学第一附属医院全国中医髓病治疗中心对692例股骨头缺血性坏死病因调查分析[3]中显示，激素导致的股骨头坏死占11.6%，其中双侧坏死占激素性坏死的61%。可见激素导致的股骨头缺血性坏死已经占有很高的比例。
中医历来就重视疾病的预防，早在《内经》就提出了，“治未病”的思想，强调“防患于未然”。《素问.四气调神大论》说：“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱。夫病已而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎？”因此，中医药在股骨头缺血性坏死的预防上也必能作出重大的贡献。
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中药在治疗股骨头缺血性坏死方面已经显示出强大的优势。我们研制的生脉成骨胶囊，临床验证两千余例病人，疗效优良。对单纯服用生脉成骨胶囊的192例股骨头缺血性坏死患者的临床观察，优良率达88.6%，[4]显示了生脉成骨胶囊在治疗激素性股骨头坏死的临床疗效方面令人满意。一系列动物实验证实了生脉成骨胶囊有明显地改善骨髓微循环，促进骨质修复，加快新骨生成，促进骨组织血管修复和再生的作用，在药效学试验上证实其具有活血化瘀。消肿止痛、补肾健骨、扶正固本作用。因而在预防激素性股骨头缺血性坏死上也必将有所作为。本实验立足于此，通过动物实验研究来证实生脉成骨胶囊对于激素性股骨头缺血性坏死的预防作用。
材料和方法
1 动物的分组及用药 健康纯种SD大白鼠120只，体重250～300g，雌雄各半，由广东省实验动物中心提供。随机分为6组：正常对照组12只，按24.5mg/kg，每周一次肌注生理盐水；模型组(激素应用组)24只，醋酸强的松龙按24.5mg/kg(此剂量参照wang[5]12.25mg/kg给大白兔应用造模的剂量折算)，每周一次，肌肉注射，同时应用青霉素5万U/只，每周一次肌注预防感染。阳性药物对照组(激素应用加安妥明组)21只，与模型组一样用药同时给予安妥明240mg/kg，每日一次灌胃。(该剂量以《实验药物手册》[6]上成人剂量0.5g/日换算)激素加生脉成骨方高剂量组：同模型组一样用药同时，每日给予生脉成骨高浓度混悬液灌胃。(含生脉成骨胶囊7.68g/kg，成人临床生药用量为1g/kg.d)激素加生脉成骨方中剂量组：同模型组一样用药同时，每日给予生脉成骨中浓度混悬液灌胃。(含生脉成骨胶囊3.84g/kg)激素加生脉成骨方高剂量组：同模型组一样用药同时，每日给予生脉成骨低浓度混悬液灌胃。(含生脉成骨胶囊1.92g/kg)
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2 观察指标 全部动物在同等环境、条件下饲养。同时开始实验，于实验后4周、8周、12周分三批处死动物进行如下检查。
2.1 股骨头大体形态 包括股骨头外形，关节软骨色泽、外形。
2.2 光镜制片方法 将动物股骨头沿冠状面劈开，用10%的福尔马林缓冲液固定，5%的硝酸溶液脱钙，石蜡包埋，切片后一份作H.E染色，一份做V.G染色，一份作Masson三色染色。
2.3 墨汁灌注透明标本制备 将动物用戊巴比妥钠(0.25g/kg)麻醉后，取腹部正中切口，显露腹主动脉和下腔静脉，分别插上导管，经腹主动脉持续恒温(37.2°C)恒压注入肝素生理盐水约500m1，直到下腔静脉导管流出清澈溶液，再灌人2.5%戊二醛溶液，最后注入珠江牌墨汁至老鼠双足趾甲下颜色转黑，取下股骨头放于4°C的冰箱中24小时，用10%甲醛固定，盐酸混合液脱钙，酒精逐级脱水，制成30um冠状面连续切片，再经二甲苯透明后封片。
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实验结果
1股骨头大体标本观察 在实验动物中，无一例股骨头出现塌陷，模型组股骨头关节软骨稍微黄，少光泽，甚至软骨下暗红瘀斑，但无塌陷，12周标本较第4周易切凿。
2 光镜检查
2.1 正常组 (1)骨小梁整齐清晰排列规则，致密饱满。(2)骨皮质及骨小梁中骨细胞清析可见，核较大，位于中央，偶可见骨陷窝空虚。(3)软骨下面较丰富，管径较大的血管壁结构清晰。(4)髓腔内生血细胞丰富，形态正常。(5)骨小梁周沿成骨细胞数量多。(6)墨汁灌注标本示毛细血管丰富，交织成网状，边缘清晰。
2.2 模型组 (1)骨小梁稀疏，变细，甚至有断裂现象，结构紊乱，有碎片出现。(2)骨皮质及骨小梁中骨细胞坏死，空骨陷窝明显增多，第4周平均空骨陷窝率即达到29.6%，第12周平均空骨陷窝率达到37.9%。(3)髓腔内脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状，生血细胞数量减少。(4)坏死骨小梁间隙有明显纤维肉芽组织增生，随着时间推移，逐渐包绕坏死骨小梁。(5)骨小梁周沿稍可见棱形，成骨细胞排列，但数量很少，骨小梁周沿未见明显新骨沉积性生长。(6)髓腔内多核破骨细胞数量增多。(7)软骨下小血管数量明显减少，在高倍下，V.G片中可见需管壁结构破坏，内膜增生，中层平滑细胞结构紊乱，弹性纤维断裂，部分血管有栓塞。(8)软骨下髓腔内有新、旧的出血迹象。(9)墨汁灌注标本显示，毛细血管稀疏，边缘不清，血窦欠丰富，数量少，周沿似有墨汁弥散。(10)上述病理表现随着时间的推移逐渐加重。
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2.3 安妥明加激素组 (1)骨小梁细长，结构尚齐整，偶有断裂现象。(2)空骨陷窝较少，但仍可见。(3)骨髓内生血细胞尚丰富，无明显空泡变性。(4)成骨细胞数量较少，骨小梁周沿无明显新骨沉积生长，破骨细胞数量亦较少。(5)软骨下血管数量欠丰富，血管壁结构尚正常，软骨下髓腔内亦可见陈旧出血迹象。(6)墨汁灌注标本毛细血管数量较少，边沿尚清晰，血窦欠丰富，数量少，无明显墨汁弥散。(7)上述病理表现随着时间的推移稍有加重。
2.4 生脉成骨胶囊高剂量加激素组：(1)骨小梁排列整齐，规则，致密饱满，无碎裂。(2)骨小梁上骨细胞核清晰可见，位于中央，少见空骨陷窝存在，与正常组比较无显著性差异(P>0.05)。(3)软骨细胞排列整齐，软骨下血管丰富，Masson三色与V.G染色示小血管壁清晰正常。(4)髓腔内造血细胞丰富，无明显大的脂肪滴。(5)骨小梁周沿，梭形成骨细胞数量增多，排列致密，Masson三色可以提示，骨小梁周沿有一层具有活性的新生骨存在。(6)破骨细胞也相应有所增加。(7)骨小梁间隙，有纤维肉芽组织增生，随着时间推移，纤维肉芽组织中出现血管生长。(8)墨汁透明标本显示，毛细血管致密，边沿清晰，血窦丰富，数量多，周沿无明显墨汁弥散。(9)髓腔内无新鲜或陈旧的出血现象。(10)各时间病理表现无明显差别。
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2.5 生脉成骨胶囊中剂量加激素组：(1)骨小梁排列尚整齐规则，但较高剂量组稍欠饱满。(2)骨小梁上骨细胞可见部分空骨陷窝，但较模型组少，统计学处理有显著性差异(P<0.01)。(3)软骨下血管仍较丰富，血管壁结构尚清晰，无明显髓腔出血征象。(4)成骨细胞仍较丰富，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，软骨成骨活跃。(5)纤维肉芽组织可见在坏死骨周沿生长，有血管长入。(6)墨汁透明标本血管密度较模型组与安妥明组均较多，统计学处理有显著性差异(P<0.01)。血管管径较后二组均较宽。
2.6 生脉成骨低剂量加激素组：(1)骨小梁排列较模型组排列整齐、规则，但亦可见部分稀疏瘦长征象。(2)骨小梁上空骨陷窝率较模型组与安妥明组低，12周仅为19.6%，统计学处理有显著性差异(P<0.01)。(3)软骨下血管数较丰富，血管密度与正常组比较均无显著性差异(P>0.05)。(4)墨汁灌注标本血管稍丰富，边沿可见稍有墨汁弥散，软骨下血管结构尚正常，无明显髓腔内出血。(5)髓腔内生血细胞尚丰富，成骨细胞与破骨细胞计数与正常组比较均无显著性差异(P>0.05)。(具体情况见统计表)
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经q检验，高剂量组(4)与正常组(1)在4w、8w、12w比较均无显著性差异(P>0.05)，模型组与各用药组(4、5、6)、安妥明组(3)比较均有显著性差异(P<0.01)。安妥明组与各用药组比较有显著性差异(P<0.01)。
表1 各组空骨陷窝率比较(x±s) 组别
4W
8W
12W
1
12.7±3.55
13.4±3.13
13.1±3.20
2
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29.6±3.82
32.8±12.6
37.9±8.89
3
22.1±2.79
25.6±4.13
28.4±2.11
4
12.4±4.02
12.9±3.64
13.2±4.47
5
, 百拇医药
15.3±4.02
15.6±3.64
17.5±4.03
6
17.1±3.15
18.3±3.30
19.6±2.70
表2 各组毛细血管密度比较 (x±s) 组别
4W
8W
12W
1
, 百拇医药
27.9±2.65
28.59±2.83
28.52±1.83
2
9.93±1.44
9.81±2.08
9.6±1.36
3
17.93±2.15
17.83±1.53
17.1±2.60
4
, 百拇医药
37.8±2.12
38.94±1.26
39.37±1.18
5
28.87±3.10
27.63±2.48
29.27±1.82
6
25.61±2.57
26.46±4.44
26.32±2.09
经q检验，4w、8w、12w中剂量组(5)与正常组(1)比较无显著性差异(P>0.05)，模型组(2)与正常组、安妥明组(3)、各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。表3 软骨下区血管计数比较 (x±s) 组别
, 百拇医药
4W
8W
12W
1
9.0±2.48
8.3±3.97
9.25±1.53
2
6.75±2.73
6.6±1.88
6.2±2.69
3
8.0±2.92
, 百拇医药
8.2±2.22
7.8±2.38
4
10.5±2.06
10.75±3.55
10.8±1.84
5
9.0±2.25
9.2±1.04
9.8±1.61
6
8.5±2.06
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8.6±1.37
8.75±2.01
经q检验，4w时，中剂量组(5)与正常组比较无显著性差异(P>0.05)，模型组与各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。安妥明组(3)低剂量组(6)比较无显著性差异(P>0.05)。8W时，安妥明组(3)与正常组(1)比较显著性差异(P<0.01)，模型组(2)与用药组(4、5、6)均有显著性差异(P<0.01)。12W时，中剂量组(5)与正常组(1)比较无显著性差异(P>0.05)，模型组(2)与用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。表4 成骨细胞计数比较 (x±s) 组别
4W
8W
12W
1
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27.3±1.44
27.67±1.44
27.75±2.01
2
18.75±1.53
17.8±1.04
18.2±1.04
3
21.75±1.53
21.5±2.05
21.2±1.62
4
, 百拇医药
31.75±4.18
33.2±3.21
34.4±2.07
5
29.25±2.72
29.0±1.24
29.4±1.41
6
27.5±2.05
27.06±1.41
28.4±1.10
经q检验，低剂量组(6)与正常组(1)比较无显著性差异(P>0.05)，模型组(2)与各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。模型组(2)与安妥明组(3)与正常组(1)比较显著性差异(P<0.01)。表5 破骨细胞计数比较 (x±s) 组别
, 百拇医药
4W
8W
12W
1
4.3±0.48
3.9±0.53
4.5±0.61
2
11.2±0.56
9.1±1.41
11.6±0.69
3
5.40±0.53
, 百拇医药
6.0±0.59
6.4±0.66
4
4.46±0.37
4.4±0.49
4.9±0.71
5
4.80±0.37
5.0±0.58
5.2±0.56
6
5.95±0.83
, 百拇医药
6.2±0.56
6.3±0.681
经q检验，模型组(2)与各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。安妥明组(3)与低剂量组(6)比较无显著性差异(P<0.05)。表6 软骨下区小血管直径比较 (x±s) 组别
4W
8W
12W
1
24.38±0.87
24.48±0.99
23.31±0.79
, 百拇医药
2
12.49±0.86
12.42±0.66
10.21±0.56
3
12.18±0.46
13.3±0.67
11.82±0.38
4
27.89±0.60
28.48±0.47
30.34±0.71
, 百拇医药
5
25.07±0.39
25.39±0.64
28.14±0.43
6
23.66±0.36
22.68±0.92
22.89±1.04
经q检验，模型组(2)与各用药组(4、5、6)比较有显著性差异(P<0.01)。模型组(2)与安妥明组(3)比较无显著性差异(P>0.05)。
3 结果小结 在本实验条件下，生脉成骨胶囊具有明显的预防激素性股骨头缺血性坏死的作用，表现在以下几个方面
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3.1 生脉成骨胶囊各应用组骨小梁质量较模型组好，与正常组基本一致，安妥明应用组骨小梁质量较模型组好，但较生脉成骨胶囊应用组差。
3.2 生脉成骨胶囊各应用组空骨陷窝率较模型组有显著降低(P<0.01)，但与正常组无显著差异(P>0.05)：安妥明应用组空骨陷窝率较模型组显著降低(P<0.01)，但较用药组显著提高(P<0.01)。
3.3 生脉成骨胶囊应用组股骨头髓腔中脂肪变性程度较模型组明显减轻，但较安妥明应用组程度稍重。
3.4 生脉成骨胶囊应用组软骨下血管计数及软骨下区小血管直径与模型组比较显著增加(P<0.01)，光镜下小血管结构较模型组完整，无明显髓腔内出血征象。
3.5 生脉成骨胶囊应用组墨汁灌注透明片显示血管密度较模型组及安妥明应用组显著增高(P<0.01)，与正常组差别不明显(P>0.05)，无明显墨汁弥散。
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3.6 生脉成骨胶囊应用组成骨细胞计数较模型组显著增加(P<0.01)，破骨细胞计数较模型组显著降低(P<0.01)。
结论
1 生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死有明显的预防作用。
2 生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死的预防作用优于安妥明。
讨论
从本组实验来看，生脉成骨胶囊具有预防激素性股骨头坏死的作用。其作用的方式及机理可以从以下几个方面来说明：
1 生脉成骨胶囊保护和改善微循环，保证了骨组织的有效灌注，给骨细胞提供一个良好的内外环境，使由于脂质代谢紊乱带来的有毒物质及时得到转输与排泄。
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Satio认为反复的髓腔内出血与股骨头缺血性坏死的发病机理密切相关，[17]小动脉的血管壁结构损害和血管组织破裂的痕迹被认为是股骨头坏死的特征表现，并且和髓腔内出血及骨小梁、骨髓坏死密切相关。[7]我们在本组实验中模型组软骨下的小动脉出现了内膜增生、平滑肌纤维结构紊乱以及反复的髓腔内出血，墨汁灌注标本出现区域性的墨汁缺乏现象……说明激素在导致股骨头缺血性坏死过程中，血管的损害(包括破裂和栓塞)是一个相当重要的环节。静脉淤滞与骨内高压并不是激素性股骨头缺血性坏死的根本原因，它只是股骨头坏死过程中的一个阶段与环节，但是这两者出现却能加剧股骨头缺血性坏死的发展。生脉成骨胶囊应用的几组动物这样的现象得到了大大抑制与改善。究其原因主要是由于生脉成骨胶囊保护和改善了血管结构，保证了组织的有效灌注，给骨细胞提高供了一个良好的内外环境，使由于脂质代谢紊乱带来的有毒物质及时得到转输与排泄，从而缓减了对细胞和组织的毒害。生脉成骨胶囊的药效学实验已经证实其能够降低血液粘度，改善血液的高凝状态和毛细血管网充盈状态，改善和保护微循环，这些作用将使微小血管得以保护，静脉淤滞现象得以缓解，骨内高压得以控制，从而延缓和阻止了股骨头缺血性坏死的发生。从而达到预防股骨头缺血性坏死的目的。
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2 生脉成骨胶囊增强骨细胞的活力，预防了骨细胞内脂肪的异常堆积。
激素导致的股骨头缺血性坏死中，最显著的特征是骨细胞的坏死。应用生脉成骨胶囊组的空骨陷窝率较模型组有显著降低(P<0.01)，与正常组无显著差异(P>0.05)。说明生脉成骨胶囊能增强骨细胞活性，预防了骨细胞内脂肪的异常堆积。其作用方式仍有待于进一步研究，但可能有三种，一种是通过改善血液循环，改善了骨细胞的内外环境，使细胞毒性物质及早排出从而维护骨细胞的正常生理功能，同时也有效防止了脂质在细胞、髓腔内的堆积；二是可能切断了脂质进入骨细胞的途径，防止了骨细胞的脂肪化。三可能促进了骨细胞自身的生理代谢反应、DNA合成水平，从而使细胞活性增强。
3 生脉成骨胶囊激发成骨细胞活性，调节骨的代谢，促进新骨生长，保持了骨小梁的完整结构。
骨组织处于经常性的更新过程，并通过这一过程进行骨的连续不断的塑建。这一过程是通过骨的吸收与再生来完成的。而骨的吸收与再生主要是通过成骨细胞与破骨细胞的作用来实现。
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大量激素导致股骨头内的骨细胞坏死，同时也抑制了成骨细胞的活性，因而在本组实验中模型组的成骨细胞计数与生脉成骨胶囊的成骨细胞计数有显著性差异(P<0.01)，生脉成骨胶囊组的成骨细胞数显著高于模型组，这说明生脉成骨胶囊能够激发成骨细胞的活性，使成骨细胞数量增多，从而促进新生骨的形成，维持了骨组织的力学枢架，维护了血管与细胞正常功能的顺利进行。
项目基金：国家中医药管理局科研基金(A59-06)
作者简介：袁浩(1926-)，男(汉族)，浙江富阳人，广州中医药大学 教授，博士导师。
参考文献
[1] Pietrogrande V.and Mastromarino R.Osteopatia da prolongato trattamen to cortisono.Orthop.Traumatol,1957,25:791
, 百拇医药
[2] Idiopathic necrosis of the femoral epiphyseal nucleus in rats.Clinical Orthopedics and related research,1992,4:277
[3] 樊粤光，袁浩，何伟，等.692例股骨头缺血性坏死病因调查分析.广州中医药大学学报，1994，11(1)：29～31
[4] 袁浩，何伟，李雄，等.生脉成骨胶囊治疗股骨头缺血性坏死的临床疗效观察——附193例286髋疗效分析.中医正骨，1999，2：45～46
[5] wang,GJ steroid-induced femoral head pressure changes and their response to lipid-clearing agents.Clin Orthop,1983,289:174
[6] 王道隐，实用药物手册.山东科学技术出版社，1987：514
[7] Saito,S.Kenji Ohozono,Keiro ono.Early Arteriopathy and postulated pathogenesis of osteonecrosis of the femoral head.Clin Orthop,1992,277:98～110
收稿日期：1999-01-02, 百拇医药
单位：广州中医药大学 第一附属医院全国中医髋病治疗中心 广东 广州 510405
关键词：股骨头坏死；中医药疗法；生脉成骨胶囊；预防应用；动物实验
中国中医骨伤科990402 摘要 为了评价生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死的预防作用。将120只SD大白鼠随机分成6组，即正常对照组、激素造模组、激素加安妥明应用组、激素加生脉成骨胶囊高、中、低剂量组。全部动物同时开始实验，于实验后第4周、第8周、第12周分三批处死动物进行脏器标本检查、股骨头大体形态及光镜检查，墨汁灌注透明片观察，并采用Metamoph全自动图象分析处理系统进行病理图象的分析处理、骨的组织形态学和计量学分析，结果进行统计学处理。证实生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死有明显的预防作用，其预防作用优于安妥明。
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中图分类法：R681.4 文献标识码：A 文章编号：1005-0205(1999)04-0004-05
An Experimental Research on Prevention of
Glucocorticoids-induced ANFH with ‘shengmaichenggu’ capsule
Yuan Hao,Li Xiong,He Wei,et al
The Nationwide TCM Clinic & Research Center of the Hip Diseases
The First affiliated Hospital of Guang Zhou TCM University
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ABSTRACT To evaluate the prevention of glucocorticoids-induced avascular necrosis of the femoral head with ‘shengmaichenggu’ capsule,120 adult SD rats were divided into six groups randomly,ie normal control group,glucocorticoid-model group,clofibratum group and three-dose groups including high-dose,medium-dose and low-dose groups.All animals were performed the experiment simultaneously and were killed at the time of fourth week,eighth week,twelfth week respectively.Their viscera specimen,the gross shape and microscope and ink-perfused specimens of the femoral head were observed and analyzed by auto-photograh software of Metamoph.In the end,the prevention effect of shengmai chengigu capsule was evaluated.The experiment confirmed that shengmaichenggu capsule has a remarkable effect to ANFH and the effect is better than clofibratum.
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KEY WRODS Avascular necrosis of the femoral head TCM ‘shengmaichenggu’ Capsule Prevention Experimental research
长期或间断大量使用肾上腺皮质类固醇激素，能引起股骨头缺血性坏死，在临床上已逐步被人们所重视。自1957年pietrogrami和Mastromarino报道第一例由于治疗天疱疮连续应用四年激素而发生骨坏死的报道[1]以来，其发病率逐年迅猛增长。据文献报道国外1960年以前仅见20余例，1964～1977年猛增至450例以上。[2]据广州中医药大学第一附属医院全国中医髓病治疗中心对692例股骨头缺血性坏死病因调查分析[3]中显示，激素导致的股骨头坏死占11.6%，其中双侧坏死占激素性坏死的61%。可见激素导致的股骨头缺血性坏死已经占有很高的比例。
中医历来就重视疾病的预防，早在《内经》就提出了，“治未病”的思想，强调“防患于未然”。《素问.四气调神大论》说：“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱。夫病已而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎？”因此，中医药在股骨头缺血性坏死的预防上也必能作出重大的贡献。
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中药在治疗股骨头缺血性坏死方面已经显示出强大的优势。我们研制的生脉成骨胶囊，临床验证两千余例病人，疗效优良。对单纯服用生脉成骨胶囊的192例股骨头缺血性坏死患者的临床观察，优良率达88.6%，[4]显示了生脉成骨胶囊在治疗激素性股骨头坏死的临床疗效方面令人满意。一系列动物实验证实了生脉成骨胶囊有明显地改善骨髓微循环，促进骨质修复，加快新骨生成，促进骨组织血管修复和再生的作用，在药效学试验上证实其具有活血化瘀。消肿止痛、补肾健骨、扶正固本作用。因而在预防激素性股骨头缺血性坏死上也必将有所作为。本实验立足于此，通过动物实验研究来证实生脉成骨胶囊对于激素性股骨头缺血性坏死的预防作用。
材料和方法
1 动物的分组及用药 健康纯种SD大白鼠120只，体重250～300g，雌雄各半，由广东省实验动物中心提供。随机分为6组：正常对照组12只，按24.5mg/kg，每周一次肌注生理盐水；模型组(激素应用组)24只，醋酸强的松龙按24.5mg/kg(此剂量参照wang[5]12.25mg/kg给大白兔应用造模的剂量折算)，每周一次，肌肉注射，同时应用青霉素5万U/只，每周一次肌注预防感染。阳性药物对照组(激素应用加安妥明组)21只，与模型组一样用药同时给予安妥明240mg/kg，每日一次灌胃。(该剂量以《实验药物手册》[6]上成人剂量0.5g/日换算)激素加生脉成骨方高剂量组：同模型组一样用药同时，每日给予生脉成骨高浓度混悬液灌胃。(含生脉成骨胶囊7.68g/kg，成人临床生药用量为1g/kg.d)激素加生脉成骨方中剂量组：同模型组一样用药同时，每日给予生脉成骨中浓度混悬液灌胃。(含生脉成骨胶囊3.84g/kg)激素加生脉成骨方高剂量组：同模型组一样用药同时，每日给予生脉成骨低浓度混悬液灌胃。(含生脉成骨胶囊1.92g/kg)
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2 观察指标 全部动物在同等环境、条件下饲养。同时开始实验，于实验后4周、8周、12周分三批处死动物进行如下检查。
2.1 股骨头大体形态 包括股骨头外形，关节软骨色泽、外形。
2.2 光镜制片方法 将动物股骨头沿冠状面劈开，用10%的福尔马林缓冲液固定，5%的硝酸溶液脱钙，石蜡包埋，切片后一份作H.E染色，一份做V.G染色，一份作Masson三色染色。
2.3 墨汁灌注透明标本制备 将动物用戊巴比妥钠(0.25g/kg)麻醉后，取腹部正中切口，显露腹主动脉和下腔静脉，分别插上导管，经腹主动脉持续恒温(37.2°C)恒压注入肝素生理盐水约500m1，直到下腔静脉导管流出清澈溶液，再灌人2.5%戊二醛溶液，最后注入珠江牌墨汁至老鼠双足趾甲下颜色转黑，取下股骨头放于4°C的冰箱中24小时，用10%甲醛固定，盐酸混合液脱钙，酒精逐级脱水，制成30um冠状面连续切片，再经二甲苯透明后封片。
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实验结果
1股骨头大体标本观察 在实验动物中，无一例股骨头出现塌陷，模型组股骨头关节软骨稍微黄，少光泽，甚至软骨下暗红瘀斑，但无塌陷，12周标本较第4周易切凿。
2 光镜检查
2.1 正常组 (1)骨小梁整齐清晰排列规则，致密饱满。(2)骨皮质及骨小梁中骨细胞清析可见，核较大，位于中央，偶可见骨陷窝空虚。(3)软骨下面较丰富，管径较大的血管壁结构清晰。(4)髓腔内生血细胞丰富，形态正常。(5)骨小梁周沿成骨细胞数量多。(6)墨汁灌注标本示毛细血管丰富，交织成网状，边缘清晰。
2.2 模型组 (1)骨小梁稀疏，变细，甚至有断裂现象，结构紊乱，有碎片出现。(2)骨皮质及骨小梁中骨细胞坏死，空骨陷窝明显增多，第4周平均空骨陷窝率即达到29.6%，第12周平均空骨陷窝率达到37.9%。(3)髓腔内脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状，生血细胞数量减少。(4)坏死骨小梁间隙有明显纤维肉芽组织增生，随着时间推移，逐渐包绕坏死骨小梁。(5)骨小梁周沿稍可见棱形，成骨细胞排列，但数量很少，骨小梁周沿未见明显新骨沉积性生长。(6)髓腔内多核破骨细胞数量增多。(7)软骨下小血管数量明显减少，在高倍下，V.G片中可见需管壁结构破坏，内膜增生，中层平滑细胞结构紊乱，弹性纤维断裂，部分血管有栓塞。(8)软骨下髓腔内有新、旧的出血迹象。(9)墨汁灌注标本显示，毛细血管稀疏，边缘不清，血窦欠丰富，数量少，周沿似有墨汁弥散。(10)上述病理表现随着时间的推移逐渐加重。
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2.3 安妥明加激素组 (1)骨小梁细长，结构尚齐整，偶有断裂现象。(2)空骨陷窝较少，但仍可见。(3)骨髓内生血细胞尚丰富，无明显空泡变性。(4)成骨细胞数量较少，骨小梁周沿无明显新骨沉积生长，破骨细胞数量亦较少。(5)软骨下血管数量欠丰富，血管壁结构尚正常，软骨下髓腔内亦可见陈旧出血迹象。(6)墨汁灌注标本毛细血管数量较少，边沿尚清晰，血窦欠丰富，数量少，无明显墨汁弥散。(7)上述病理表现随着时间的推移稍有加重。
2.4 生脉成骨胶囊高剂量加激素组：(1)骨小梁排列整齐，规则，致密饱满，无碎裂。(2)骨小梁上骨细胞核清晰可见，位于中央，少见空骨陷窝存在，与正常组比较无显著性差异(P>0.05)。(3)软骨细胞排列整齐，软骨下血管丰富，Masson三色与V.G染色示小血管壁清晰正常。(4)髓腔内造血细胞丰富，无明显大的脂肪滴。(5)骨小梁周沿，梭形成骨细胞数量增多，排列致密，Masson三色可以提示，骨小梁周沿有一层具有活性的新生骨存在。(6)破骨细胞也相应有所增加。(7)骨小梁间隙，有纤维肉芽组织增生，随着时间推移，纤维肉芽组织中出现血管生长。(8)墨汁透明标本显示，毛细血管致密，边沿清晰，血窦丰富，数量多，周沿无明显墨汁弥散。(9)髓腔内无新鲜或陈旧的出血现象。(10)各时间病理表现无明显差别。
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2.5 生脉成骨胶囊中剂量加激素组：(1)骨小梁排列尚整齐规则，但较高剂量组稍欠饱满。(2)骨小梁上骨细胞可见部分空骨陷窝，但较模型组少，统计学处理有显著性差异(P<0.01)。(3)软骨下血管仍较丰富，血管壁结构尚清晰，无明显髓腔出血征象。(4)成骨细胞仍较丰富，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，软骨成骨活跃。(5)纤维肉芽组织可见在坏死骨周沿生长，有血管长入。(6)墨汁透明标本血管密度较模型组与安妥明组均较多，统计学处理有显著性差异(P<0.01)。血管管径较后二组均较宽。
2.6 生脉成骨低剂量加激素组：(1)骨小梁排列较模型组排列整齐、规则，但亦可见部分稀疏瘦长征象。(2)骨小梁上空骨陷窝率较模型组与安妥明组低，12周仅为19.6%，统计学处理有显著性差异(P<0.01)。(3)软骨下血管数较丰富，血管密度与正常组比较均无显著性差异(P>0.05)。(4)墨汁灌注标本血管稍丰富，边沿可见稍有墨汁弥散，软骨下血管结构尚正常，无明显髓腔内出血。(5)髓腔内生血细胞尚丰富，成骨细胞与破骨细胞计数与正常组比较均无显著性差异(P>0.05)。(具体情况见统计表)
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经q检验，高剂量组(4)与正常组(1)在4w、8w、12w比较均无显著性差异(P>0.05)，模型组与各用药组(4、5、6)、安妥明组(3)比较均有显著性差异(P<0.01)。安妥明组与各用药组比较有显著性差异(P<0.01)。
表1 各组空骨陷窝率比较(x±s) 组别
4W
8W
12W
1
12.7±3.55
13.4±3.13
13.1±3.20
2
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29.6±3.82
32.8±12.6
37.9±8.89
3
22.1±2.79
25.6±4.13
28.4±2.11
4
12.4±4.02
12.9±3.64
13.2±4.47
5
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15.3±4.02
15.6±3.64
17.5±4.03
6
17.1±3.15
18.3±3.30
19.6±2.70
表2 各组毛细血管密度比较 (x±s) 组别
4W
8W
12W
1
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27.9±2.65
28.59±2.83
28.52±1.83
2
9.93±1.44
9.81±2.08
9.6±1.36
3
17.93±2.15
17.83±1.53
17.1±2.60
4
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37.8±2.12
38.94±1.26
39.37±1.18
5
28.87±3.10
27.63±2.48
29.27±1.82
6
25.61±2.57
26.46±4.44
26.32±2.09
经q检验，4w、8w、12w中剂量组(5)与正常组(1)比较无显著性差异(P>0.05)，模型组(2)与正常组、安妥明组(3)、各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。表3 软骨下区血管计数比较 (x±s) 组别
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4W
8W
12W
1
9.0±2.48
8.3±3.97
9.25±1.53
2
6.75±2.73
6.6±1.88
6.2±2.69
3
8.0±2.92
, 百拇医药
8.2±2.22
7.8±2.38
4
10.5±2.06
10.75±3.55
10.8±1.84
5
9.0±2.25
9.2±1.04
9.8±1.61
6
8.5±2.06
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8.6±1.37
8.75±2.01
经q检验，4w时，中剂量组(5)与正常组比较无显著性差异(P>0.05)，模型组与各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。安妥明组(3)低剂量组(6)比较无显著性差异(P>0.05)。8W时，安妥明组(3)与正常组(1)比较显著性差异(P<0.01)，模型组(2)与用药组(4、5、6)均有显著性差异(P<0.01)。12W时，中剂量组(5)与正常组(1)比较无显著性差异(P>0.05)，模型组(2)与用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。表4 成骨细胞计数比较 (x±s) 组别
4W
8W
12W
1
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27.3±1.44
27.67±1.44
27.75±2.01
2
18.75±1.53
17.8±1.04
18.2±1.04
3
21.75±1.53
21.5±2.05
21.2±1.62
4
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31.75±4.18
33.2±3.21
34.4±2.07
5
29.25±2.72
29.0±1.24
29.4±1.41
6
27.5±2.05
27.06±1.41
28.4±1.10
经q检验，低剂量组(6)与正常组(1)比较无显著性差异(P>0.05)，模型组(2)与各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。模型组(2)与安妥明组(3)与正常组(1)比较显著性差异(P<0.01)。表5 破骨细胞计数比较 (x±s) 组别
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4W
8W
12W
1
4.3±0.48
3.9±0.53
4.5±0.61
2
11.2±0.56
9.1±1.41
11.6±0.69
3
5.40±0.53
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6.0±0.59
6.4±0.66
4
4.46±0.37
4.4±0.49
4.9±0.71
5
4.80±0.37
5.0±0.58
5.2±0.56
6
5.95±0.83
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6.2±0.56
6.3±0.681
经q检验，模型组(2)与各用药组(4、5、6)比较均有显著性差异(P<0.01)。安妥明组(3)与低剂量组(6)比较无显著性差异(P<0.05)。表6 软骨下区小血管直径比较 (x±s) 组别
4W
8W
12W
1
24.38±0.87
24.48±0.99
23.31±0.79
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2
12.49±0.86
12.42±0.66
10.21±0.56
3
12.18±0.46
13.3±0.67
11.82±0.38
4
27.89±0.60
28.48±0.47
30.34±0.71
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5
25.07±0.39
25.39±0.64
28.14±0.43
6
23.66±0.36
22.68±0.92
22.89±1.04
经q检验，模型组(2)与各用药组(4、5、6)比较有显著性差异(P<0.01)。模型组(2)与安妥明组(3)比较无显著性差异(P>0.05)。
3 结果小结 在本实验条件下，生脉成骨胶囊具有明显的预防激素性股骨头缺血性坏死的作用，表现在以下几个方面
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3.1 生脉成骨胶囊各应用组骨小梁质量较模型组好，与正常组基本一致，安妥明应用组骨小梁质量较模型组好，但较生脉成骨胶囊应用组差。
3.2 生脉成骨胶囊各应用组空骨陷窝率较模型组有显著降低(P<0.01)，但与正常组无显著差异(P>0.05)：安妥明应用组空骨陷窝率较模型组显著降低(P<0.01)，但较用药组显著提高(P<0.01)。
3.3 生脉成骨胶囊应用组股骨头髓腔中脂肪变性程度较模型组明显减轻，但较安妥明应用组程度稍重。
3.4 生脉成骨胶囊应用组软骨下血管计数及软骨下区小血管直径与模型组比较显著增加(P<0.01)，光镜下小血管结构较模型组完整，无明显髓腔内出血征象。
3.5 生脉成骨胶囊应用组墨汁灌注透明片显示血管密度较模型组及安妥明应用组显著增高(P<0.01)，与正常组差别不明显(P>0.05)，无明显墨汁弥散。
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3.6 生脉成骨胶囊应用组成骨细胞计数较模型组显著增加(P<0.01)，破骨细胞计数较模型组显著降低(P<0.01)。
结论
1 生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死有明显的预防作用。
2 生脉成骨胶囊对激素性股骨头缺血性坏死的预防作用优于安妥明。
讨论
从本组实验来看，生脉成骨胶囊具有预防激素性股骨头坏死的作用。其作用的方式及机理可以从以下几个方面来说明：
1 生脉成骨胶囊保护和改善微循环，保证了骨组织的有效灌注，给骨细胞提供一个良好的内外环境，使由于脂质代谢紊乱带来的有毒物质及时得到转输与排泄。
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Satio认为反复的髓腔内出血与股骨头缺血性坏死的发病机理密切相关，[17]小动脉的血管壁结构损害和血管组织破裂的痕迹被认为是股骨头坏死的特征表现，并且和髓腔内出血及骨小梁、骨髓坏死密切相关。[7]我们在本组实验中模型组软骨下的小动脉出现了内膜增生、平滑肌纤维结构紊乱以及反复的髓腔内出血，墨汁灌注标本出现区域性的墨汁缺乏现象……说明激素在导致股骨头缺血性坏死过程中，血管的损害(包括破裂和栓塞)是一个相当重要的环节。静脉淤滞与骨内高压并不是激素性股骨头缺血性坏死的根本原因，它只是股骨头坏死过程中的一个阶段与环节，但是这两者出现却能加剧股骨头缺血性坏死的发展。生脉成骨胶囊应用的几组动物这样的现象得到了大大抑制与改善。究其原因主要是由于生脉成骨胶囊保护和改善了血管结构，保证了组织的有效灌注，给骨细胞提高供了一个良好的内外环境，使由于脂质代谢紊乱带来的有毒物质及时得到转输与排泄，从而缓减了对细胞和组织的毒害。生脉成骨胶囊的药效学实验已经证实其能够降低血液粘度，改善血液的高凝状态和毛细血管网充盈状态，改善和保护微循环，这些作用将使微小血管得以保护，静脉淤滞现象得以缓解，骨内高压得以控制，从而延缓和阻止了股骨头缺血性坏死的发生。从而达到预防股骨头缺血性坏死的目的。
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2 生脉成骨胶囊增强骨细胞的活力，预防了骨细胞内脂肪的异常堆积。
激素导致的股骨头缺血性坏死中，最显著的特征是骨细胞的坏死。应用生脉成骨胶囊组的空骨陷窝率较模型组有显著降低(P<0.01)，与正常组无显著差异(P>0.05)。说明生脉成骨胶囊能增强骨细胞活性，预防了骨细胞内脂肪的异常堆积。其作用方式仍有待于进一步研究，但可能有三种，一种是通过改善血液循环，改善了骨细胞的内外环境，使细胞毒性物质及早排出从而维护骨细胞的正常生理功能，同时也有效防止了脂质在细胞、髓腔内的堆积；二是可能切断了脂质进入骨细胞的途径，防止了骨细胞的脂肪化。三可能促进了骨细胞自身的生理代谢反应、DNA合成水平，从而使细胞活性增强。
3 生脉成骨胶囊激发成骨细胞活性，调节骨的代谢，促进新骨生长，保持了骨小梁的完整结构。
骨组织处于经常性的更新过程，并通过这一过程进行骨的连续不断的塑建。这一过程是通过骨的吸收与再生来完成的。而骨的吸收与再生主要是通过成骨细胞与破骨细胞的作用来实现。
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大量激素导致股骨头内的骨细胞坏死，同时也抑制了成骨细胞的活性，因而在本组实验中模型组的成骨细胞计数与生脉成骨胶囊的成骨细胞计数有显著性差异(P<0.01)，生脉成骨胶囊组的成骨细胞数显著高于模型组，这说明生脉成骨胶囊能够激发成骨细胞的活性，使成骨细胞数量增多，从而促进新生骨的形成，维持了骨组织的力学枢架，维护了血管与细胞正常功能的顺利进行。
项目基金：国家中医药管理局科研基金(A59-06)
作者简介：袁浩(1926-)，男(汉族)，浙江富阳人，广州中医药大学 教授，博士导师。
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收稿日期：1999-01-02, 百拇医药