赤芍提取物的抗疱疹病毒Ⅱ型作用
作者：刘妮 林艳芳 朱宇同
单位：广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405
关键词：赤芍；药理学；疱疹，生殖器；中药疗法；疱疹病毒2型，人；药物作用
广州中医药大学学报990417摘要：为探讨赤芍提取物对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)的抑制作用，用兔肾细胞作体外治疗、预防及中和实验，对赤芍抗HSV-Ⅱ作用进行评价。结果：赤芍无毒浓度为12.5 g/L，有效抑制浓度为 1.56 g/L，对HSV-Ⅱ的感染有抑制病毒生长和对病毒颗粒有直接杀伤作用。提示赤芍提取物确有明显的抗HSV-Ⅱ复制的作用。
分类号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)04-0308-03
, http://www.100md.com
Anti-HSV-Ⅱ Effect of Radix Paeoniae Rubra
LIU Ni LIN Yanfang ZHU Yutong
(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405，China)
Abstract： Objective:To study the inhibitory effect of the extract Radix Paenoniae Rubra on HSV-Ⅱ.Method:Using rabbit kidney cells in vitro for the therapeutic,prophylactic and neutralizing experiments.Result:The non-toxic concentration of Radix Paeoniae Rura is 12.5 g/L and the effective concentration is 1.56 g/L. The drug can inhibit the growth of HSV-Ⅱ and kill the virus particle directly.Conclusion:The aqueous extract of Radix Paeoniae Rubra inhibits the replication of HBV-Ⅱ virus in vitro.
, 百拇医药
Key words:RADIX PAEONIAE RUBRA/pharmacology; HERPES GEMTALIS/TCD ther.;
HERPESVIRUS-2 HOMINS/drug eff.
Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)对生殖器感染及其所引起的并发症严重威胁着患者健康，临床上虽有几种化学药物用于治疗，但不是毒性大，就是有耐药性产生[1]，从而限制了临床应用，因此，有必要开发新药。中草药是中华医学的瑰宝，来源广泛，抗病毒作用正日益受到人们的重视。传统中医对泌尿生殖器感染的病因病机认为系体内蕴热，湿热下注二阴而生疱疹。《开宝本草》：“别本注云，赤芍利小便，下气”。《药品化义》：“赤芍，味苦能泻，带酸入肝，专泻肝火。盖肝藏血，用此清热凉血”。《本经逢原》：“赤芍药，性专下气，故止痛不减当归”。为此，我们采用兔肾细胞通过不同的给药途径，对赤芍提取物的抗HSV-Ⅱ作用进行了较细致的实验研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞 原代兔肾细胞取自 5 日龄内乳兔，剪碎加胰蛋白酶 4 ℃ 消化过夜。去胰酶后加含 10 %胎牛血清的杜布可改良的伊格尔培养基(DMEM)，37 ℃、5%CO2培养 2 d，再滴 96 孔细胞板，长成单层后备用。乳兔由广东省卫生厅实验动物中心提供。
1.2 病毒 HSV-Ⅱ株由湖北医科大学病毒研究所提供。实验一般用每 0.1 mL 中含 100 个组织培养半数感染病毒量(100 TCID50)攻击。
1.3 药物
1.3.1 赤芍提取物提取方法 称一定量赤芍，加蒸馏水煮沸 1/2 h ，除渣过滤，煮 2 次，将 2 次溶液合并，隔水浓缩至 100%浓度，4 ℃保存，用前 8 000 r/min 离心20 min，将上清用 0.45 μm醋酸纤维膜过滤除菌。
, 百拇医药
1.3.2 无环鸟苷(ACV) 为湖北医工所提供，用 2%胎牛DMEM配成 1 g/L，4 ℃ 保存备用。
1.4 细胞毒性实验 细胞长成单层后，加入不同浓度的药物；37 ℃ 培养 4 d，每天观察细胞形态变化。
1.5 药物抗病毒实验
1.5.1 对病毒所致细胞病变(CPE)的抑制作用 细胞长成单层时加入不同浓度的药物，每浓度 4 孔，同时接种 100 TCID50 HSV-Ⅱ病毒，37 ℃、5%CO2培养 4 d。当病毒对照CPE达++(25%～75%)时，判断结果。
1.5.2 对病毒感染的预防作用 细胞长成单层后加入不同浓度药物，于 37 ℃ 培养过夜，弃掉含药物的维持液，用Hanks缓冲液洗涤 2 次，加入 100 TCID50病毒攻击，37 ℃培养 4 d。
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1.5.3 对病毒治疗作用 细胞长成单层后用 100 TCID50病毒攻击，37 ℃ 作用 1 h，弃掉含病毒的维持液，用Hanks缓冲液洗涤 2 次，加不同浓度药物 37 ℃ 培养 4 d。观察CPE产生情况。
1.5.4 对病毒的直接杀伤作用 将 1.25 g/L赤芍与病毒液等量混合；同时设对照 2%胎牛DMEM与病毒液等量混合于 37 ℃ 处理 12 h 后。稀释成 10-1～10-5感染细胞，37 ℃、5%CO2培养 4 d，观察CPE产生情况。
1.5.5 药物阻止病毒复制的动力学测定 用1.56 g/L浓度的赤芍液加等量含 TCID50 10-5/mL HSV-Ⅱ为实验组，病毒对照组不加药物仅加等量维持液，每组均放于 37 ℃、5%CO2孵箱中培养，分别于 24 h、48 h、72 h、96 h 后取出，稀释为 10-1～10-8不同浓度，每一浓度接种 4 孔，每孔 0.1 mL分别接种于 96 孔已长好的兔肾细胞中。放于 37℃、5%CO2孵箱中培养，96 h 后判定结果。以横坐标为不同感染持续时间(h)和纵坐标为病毒滴度 lgx(lgx=n，n个滴度即 TCID50 病毒含量为 10n/mL)制成病毒复制曲线。
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实验均设病毒对照组、药物对照、细胞对照ACV作为药物阳性对照，实验重复 2 次。
2 结果
2.1 药物对细胞最大无毒性浓度测定 赤芍的最大无毒浓度为 12.5 g/L，ACV最大无毒浓度为 100 mg/L。在此浓度范围以上时，细胞萎缩、空泡或脱落。
2.2 药物对病毒所致细胞病变(CPE)的抑制作用 在赤芍浓度为 1.56 g/L 时，能完全抑制病毒所致病变(见图 1～3)。阳性药ACV 6.25 mg/L 时能完全抑制病毒所致病变(见表 1)。
图1 正常兔肾细胞
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图2 赤芍提物抗HSV-Ⅱ实验
图3 HSV-Ⅱ所致CPE
表 1 赤芍提取物对HSV-Ⅱ的作用 HSV-Ⅱ病毒病变程度
病毒对照
ρACV=12.5 mg。L-1
抑制作用
-
-
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-
-
-
治疗作用
-
+
-
预防作用
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-
细胞病变程度表示：“-”<10%，“+”25%，“”50%，“”75%，“”>90%2.3 药物对病毒感染的预防作用 药物对病毒感染的预防作用表明赤芍与病毒作用 24 h无明显阻断病毒侵入细胞的作用(见表 1)。
2.4 赤芍对病毒治疗作用 病毒对照组在第 4 天细胞全部出现CPE，而赤芍浓度在 12.5 g/L 时能完全阻止病毒复制，浓度为 6.25 g/L 时阻止 75%细胞出现CPE(见表 1)。
2.5 药物对病毒的直接杀伤作用 结果表明，赤芍与病毒混合液作用 12 h 后使HSV的感染力明显减弱，其病毒感染滴度为 1.00，未加药物的病毒对照组细胞全部出现CPE，其病毒感染滴度为 2.50。
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2.6 赤芍阻止病毒复制的动力学测定 HSV对照组于 72 h 达高峰，TCID50病毒滴度为106.67/mL，此时实验组已下降 2.67 个对数值(即TCID50滴度为104/mL)(如图 4)。从图中可以看出，HSV在加入赤芍后，病毒复制动力学明显改变，48 h 后与对照组比较下降 2 个对数值，说明药物有效地抑制了病毒的增殖。
图 4 赤芍对HSV-Ⅱ滴度的影响
3 讨论
HSV是人类重要致病病毒，能引起生殖器疱疹，通过性行为传播复发性疾病。在过去 20 年中美国生殖器疱疹增加了 16 倍，世界卫生组织估计全球每年新发生殖器疱疹病例达 2 千万。我国生殖器疱疹病毒感染患病人数近年急剧上升，而妇女除了局部感染以外，也是造成宫颈癌的重要病因之一[2]。
, 百拇医药
西医主要用无环鸟苷、更昔洛韦等核苷类抗病毒药物治疗，也有采用干扰素与聚肌胞等干扰素诱生剂治疗，由于这些药物有一定毒副作用与耐药性产生，从而限制了它们的临床应用。而祖国的中草药资源非常丰富，有化学药物无法比拟的优点。赤芍是毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，作为一种清热凉血药，广泛用于临床，其镇静消炎与促进免疫作用已见于书籍介绍[3]。但其对疱疹病毒-Ⅱ之体外抑制作用，尚缺乏深入细致的研究。本研究证实赤芍的提取物确有在体外治疗与中和HSV-Ⅱ之作用。这为中药赤芍抗病毒作用提供了科学依据，其开发前景非常乐观。
作者简介：刘妮，女，技师
参考文献：
[1] 杜平，朱关福，刘湘之.现代临床病毒学[M].北京：北京人民军医出版社，1991.176～183，432～435
[2] Catalano L W,Johnson L D.Herpesvirus antibody and carcinoma in situ of the cervix[J].J Am Med Assoc,1971,217:447
[3] 骆和生.清热凉血药.见：骆和生，王建华主编.中药方剂的药理与临床研究进展[M].广州:广州华南理工大学出版社，1991.102
收稿日期：1999-04-21, 百拇医药
单位：广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405
关键词：赤芍；药理学；疱疹，生殖器；中药疗法；疱疹病毒2型，人；药物作用
广州中医药大学学报990417摘要：为探讨赤芍提取物对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)的抑制作用，用兔肾细胞作体外治疗、预防及中和实验，对赤芍抗HSV-Ⅱ作用进行评价。结果：赤芍无毒浓度为12.5 g/L，有效抑制浓度为 1.56 g/L，对HSV-Ⅱ的感染有抑制病毒生长和对病毒颗粒有直接杀伤作用。提示赤芍提取物确有明显的抗HSV-Ⅱ复制的作用。
分类号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)04-0308-03
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Anti-HSV-Ⅱ Effect of Radix Paeoniae Rubra
LIU Ni LIN Yanfang ZHU Yutong
(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405，China)
Abstract： Objective:To study the inhibitory effect of the extract Radix Paenoniae Rubra on HSV-Ⅱ.Method:Using rabbit kidney cells in vitro for the therapeutic,prophylactic and neutralizing experiments.Result:The non-toxic concentration of Radix Paeoniae Rura is 12.5 g/L and the effective concentration is 1.56 g/L. The drug can inhibit the growth of HSV-Ⅱ and kill the virus particle directly.Conclusion:The aqueous extract of Radix Paeoniae Rubra inhibits the replication of HBV-Ⅱ virus in vitro.
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Key words:RADIX PAEONIAE RUBRA/pharmacology; HERPES GEMTALIS/TCD ther.;
HERPESVIRUS-2 HOMINS/drug eff.
Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)对生殖器感染及其所引起的并发症严重威胁着患者健康，临床上虽有几种化学药物用于治疗，但不是毒性大，就是有耐药性产生[1]，从而限制了临床应用，因此，有必要开发新药。中草药是中华医学的瑰宝，来源广泛，抗病毒作用正日益受到人们的重视。传统中医对泌尿生殖器感染的病因病机认为系体内蕴热，湿热下注二阴而生疱疹。《开宝本草》：“别本注云，赤芍利小便，下气”。《药品化义》：“赤芍，味苦能泻，带酸入肝，专泻肝火。盖肝藏血，用此清热凉血”。《本经逢原》：“赤芍药，性专下气，故止痛不减当归”。为此，我们采用兔肾细胞通过不同的给药途径，对赤芍提取物的抗HSV-Ⅱ作用进行了较细致的实验研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞 原代兔肾细胞取自 5 日龄内乳兔，剪碎加胰蛋白酶 4 ℃ 消化过夜。去胰酶后加含 10 %胎牛血清的杜布可改良的伊格尔培养基(DMEM)，37 ℃、5%CO2培养 2 d，再滴 96 孔细胞板，长成单层后备用。乳兔由广东省卫生厅实验动物中心提供。
1.2 病毒 HSV-Ⅱ株由湖北医科大学病毒研究所提供。实验一般用每 0.1 mL 中含 100 个组织培养半数感染病毒量(100 TCID50)攻击。
1.3 药物
1.3.1 赤芍提取物提取方法 称一定量赤芍，加蒸馏水煮沸 1/2 h ，除渣过滤，煮 2 次，将 2 次溶液合并，隔水浓缩至 100%浓度，4 ℃保存，用前 8 000 r/min 离心20 min，将上清用 0.45 μm醋酸纤维膜过滤除菌。
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1.3.2 无环鸟苷(ACV) 为湖北医工所提供，用 2%胎牛DMEM配成 1 g/L，4 ℃ 保存备用。
1.4 细胞毒性实验 细胞长成单层后，加入不同浓度的药物；37 ℃ 培养 4 d，每天观察细胞形态变化。
1.5 药物抗病毒实验
1.5.1 对病毒所致细胞病变(CPE)的抑制作用 细胞长成单层时加入不同浓度的药物，每浓度 4 孔，同时接种 100 TCID50 HSV-Ⅱ病毒，37 ℃、5%CO2培养 4 d。当病毒对照CPE达++(25%～75%)时，判断结果。
1.5.2 对病毒感染的预防作用 细胞长成单层后加入不同浓度药物，于 37 ℃ 培养过夜，弃掉含药物的维持液，用Hanks缓冲液洗涤 2 次，加入 100 TCID50病毒攻击，37 ℃培养 4 d。
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1.5.3 对病毒治疗作用 细胞长成单层后用 100 TCID50病毒攻击，37 ℃ 作用 1 h，弃掉含病毒的维持液，用Hanks缓冲液洗涤 2 次，加不同浓度药物 37 ℃ 培养 4 d。观察CPE产生情况。
1.5.4 对病毒的直接杀伤作用 将 1.25 g/L赤芍与病毒液等量混合；同时设对照 2%胎牛DMEM与病毒液等量混合于 37 ℃ 处理 12 h 后。稀释成 10-1～10-5感染细胞，37 ℃、5%CO2培养 4 d，观察CPE产生情况。
1.5.5 药物阻止病毒复制的动力学测定 用1.56 g/L浓度的赤芍液加等量含 TCID50 10-5/mL HSV-Ⅱ为实验组，病毒对照组不加药物仅加等量维持液，每组均放于 37 ℃、5%CO2孵箱中培养，分别于 24 h、48 h、72 h、96 h 后取出，稀释为 10-1～10-8不同浓度，每一浓度接种 4 孔，每孔 0.1 mL分别接种于 96 孔已长好的兔肾细胞中。放于 37℃、5%CO2孵箱中培养，96 h 后判定结果。以横坐标为不同感染持续时间(h)和纵坐标为病毒滴度 lgx(lgx=n，n个滴度即 TCID50 病毒含量为 10n/mL)制成病毒复制曲线。
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实验均设病毒对照组、药物对照、细胞对照ACV作为药物阳性对照，实验重复 2 次。
2 结果
2.1 药物对细胞最大无毒性浓度测定 赤芍的最大无毒浓度为 12.5 g/L，ACV最大无毒浓度为 100 mg/L。在此浓度范围以上时，细胞萎缩、空泡或脱落。
2.2 药物对病毒所致细胞病变(CPE)的抑制作用 在赤芍浓度为 1.56 g/L 时，能完全抑制病毒所致病变(见图 1～3)。阳性药ACV 6.25 mg/L 时能完全抑制病毒所致病变(见表 1)。
图1 正常兔肾细胞
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图2 赤芍提物抗HSV-Ⅱ实验
图3 HSV-Ⅱ所致CPE
表 1 赤芍提取物对HSV-Ⅱ的作用 HSV-Ⅱ病毒病变程度
病毒对照
ρACV=12.5 mg。L-1
抑制作用
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治疗作用
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预防作用
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细胞病变程度表示：“-”<10%，“+”25%，“
”50%，“”75%，“”>90%2.3 药物对病毒感染的预防作用 药物对病毒感染的预防作用表明赤芍与病毒作用 24 h无明显阻断病毒侵入细胞的作用(见表 1)。2.4 赤芍对病毒治疗作用 病毒对照组在第 4 天细胞全部出现CPE，而赤芍浓度在 12.5 g/L 时能完全阻止病毒复制，浓度为 6.25 g/L 时阻止 75%细胞出现CPE(见表 1)。
2.5 药物对病毒的直接杀伤作用 结果表明，赤芍与病毒混合液作用 12 h 后使HSV的感染力明显减弱，其病毒感染滴度为 1.00，未加药物的病毒对照组细胞全部出现CPE，其病毒感染滴度为 2.50。
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2.6 赤芍阻止病毒复制的动力学测定 HSV对照组于 72 h 达高峰，TCID50病毒滴度为106.67/mL，此时实验组已下降 2.67 个对数值(即TCID50滴度为104/mL)(如图 4)。从图中可以看出，HSV在加入赤芍后，病毒复制动力学明显改变，48 h 后与对照组比较下降 2 个对数值，说明药物有效地抑制了病毒的增殖。
图 4 赤芍对HSV-Ⅱ滴度的影响
3 讨论
HSV是人类重要致病病毒，能引起生殖器疱疹，通过性行为传播复发性疾病。在过去 20 年中美国生殖器疱疹增加了 16 倍，世界卫生组织估计全球每年新发生殖器疱疹病例达 2 千万。我国生殖器疱疹病毒感染患病人数近年急剧上升，而妇女除了局部感染以外，也是造成宫颈癌的重要病因之一[2]。
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西医主要用无环鸟苷、更昔洛韦等核苷类抗病毒药物治疗，也有采用干扰素与聚肌胞等干扰素诱生剂治疗，由于这些药物有一定毒副作用与耐药性产生，从而限制了它们的临床应用。而祖国的中草药资源非常丰富，有化学药物无法比拟的优点。赤芍是毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，作为一种清热凉血药，广泛用于临床，其镇静消炎与促进免疫作用已见于书籍介绍[3]。但其对疱疹病毒-Ⅱ之体外抑制作用，尚缺乏深入细致的研究。本研究证实赤芍的提取物确有在体外治疗与中和HSV-Ⅱ之作用。这为中药赤芍抗病毒作用提供了科学依据，其开发前景非常乐观。
作者简介：刘妮，女，技师
参考文献：
[1] 杜平，朱关福，刘湘之.现代临床病毒学[M].北京：北京人民军医出版社，1991.176～183，432～435
[2] Catalano L W,Johnson L D.Herpesvirus antibody and carcinoma in situ of the cervix[J].J Am Med Assoc,1971,217:447
[3] 骆和生.清热凉血药.见：骆和生，王建华主编.中药方剂的药理与临床研究进展[M].广州:广州华南理工大学出版社，1991.102
收稿日期：1999-04-21, 百拇医药