高效毛细管电泳测定黄连配伍阿胶中黄连生物碱的含量*
作者：乔梁 周洪雷 魏璐雪
单位：乔 梁 (北京医科大学医药卫生分析中心 北京100083)；周洪雷 魏璐雪 (北京中医药大学中药学院 北京100029)
关键词：高效毛细管电泳；黄连；药对；生物碱
北京中医药大学学报990410 摘要：应用高效毛细管电泳测定黄连及黄连配伍阿胶药对中的黄连生物碱含量，保留时间在15～25min之间，内标物是马钱子碱，缓冲液为0.05mol/L的四硼酸钠(pH=7.0)、甲醇(85∶15)，实验结果表明，药对中黄连生物碱含量下降。
Assay the Content of Coptisine in Huanglian Combined with Ejiao through High Efficiency Capillary Electrophoresis
, 百拇医药
Qiao Liang Zhou Honglei Wei Luxue
(Medicine Analysis Center of Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT: To assay the contents of coptisine respectively in Huanglian and the medicinal pair Huanglian with Ejiao through high efficiency capillary electrophoresis. Taking 15-25 minutes as reserving time, strychnine as internal labeling, and 0.05M sodium tetraborate (ph=7.0): methanol (85:15) as balanced solution. Results showed that the content of coptisine in the medicinal pair decreased.
, 百拇医药
KEY WORDS: High efficiency capillary electrophoresis; Huanglian; Medicinal pair; Coptisine
黄连(Coptis Chinensis Franch.)中含有原小檗碱型生物碱，已知结构的有小檗碱(Berberine)、巴马汀(Palmatine)、黄连碱(Coptisine)和药根碱(Jatrorrhizine)等。黄连与阿胶配伍出自《伤寒论》中的黄连阿胶汤， 临床上常以黄连∶阿胶=3∶4， 黄连∶阿胶=1∶1，黄连∶阿胶=4∶3等不同比例应用。
为了探讨中药复方不同工艺方法对有效成分的影响，我们研究了不同加工方法以及黄连与阿胶不同比例配伍前后煎液中黄连生物碱的含量变化。对于黄连中各生物碱的测定方法已有不少报道，主要有薄层扫描法[1]和高效液相色谱法[2]等，我们采用毛细管电泳技术对其含量变化进行了研究。
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1 实验条件
1.1 仪器
500TM型高效毛细管电泳仪(美国光谱物理公司)；Chronjet Integrator 4400型数据处理系统。
1.2 药品与试剂
盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱，均购于卫生部药品生物制品检定所；硫酸黄连碱、马钱子碱由北京中医药大学中药化学教研室提供。
黄连、阿胶均购于北京市药材公司，经北京中医药大学中药学院李家实教授鉴定，黄连为毛茛科植物Coptis Chinensis Franch. 的根茎，阿胶为马科动物驴Equus Asinus L.的皮经加工而成的胶块。
甲醇、乙酸、四硼酸钠均为分析纯，重蒸去离子水。
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2 方法与结果
2.1 电泳条件
75cm×75μm熔融石英毛细管柱，有效长度68cm；UV检测波长254nm；分离电压14kV，恒压；分离温度20.0℃，恒温；进样方式为真空进样；进样时间1s。缓冲液：0.05mol/L四硼酸钠溶液(pH=7.0)、甲醇(85∶15)。
2.2 标准曲线
精密称取硫酸黄连碱对照品9.62mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精密称取内标物马钱子碱20.16mg，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度。
精度吸取马钱子碱溶液100μL于5 mL容量瓶中，挥干甲醇，加入上述硫酸黄连碱对照品溶液至刻度，摇匀，精密吸取1mL于样品管中，供毛细管电泳测定。同法测定不同浓度的硫酸黄连碱对照品溶液(由母液分别稀释为1/2，1/4，1/8，1/16，1/32所得)中黄连碱的峰面积。以硫酸黄连碱浓度为横坐标，硫酸黄连碱与内标物峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。回归方程为：y=20.18x-0.038，r=0.9999，浓度在0.024～0.385g/L范围内线性良好。
, 百拇医药
精密称取对照品盐酸小檗碱20.94mg、巴马汀12.19mg、药根碱2.59mg，分别置于25mL容量瓶中，其余操作同硫酸黄连碱标准曲线的制备。
盐酸小檗碱的回归方程为：y=32.29x-0.092，r=0.9998，浓度在0.052～0.838g/L范围内线性良好。
盐酸巴马汀的回归方程为：y=27.78x+0.048，r=0.9997，浓度在0.030～0.488g/L范围内线性良好。
盐酸药根碱的回归方程为：y=33.70x+0.0034，r=0.9998，浓度在0.006～0.104g/L范围内线性良好。
2.3 样品制备
黄连粉碎，过40目筛；阿胶粉碎，分别置密闭容器中。精密称取黄连粉1.00g，置于250mL三角瓶中，加水100mL煎煮15min，煎液冷却后离心，过滤，滤液加水定容于100mL容量瓶中，用移液管量取10mL置蒸发皿中，加入内标溶液200μL，水浴蒸干，用70%甲醇溶解后转移至10mL容量瓶中，多次洗涤，洗涤液一并转入容量瓶，70%甲醇定容至刻度。测定前用0.45μm有机膜过滤，滤液作为供试液用于毛细管电泳测试。
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分别精密称取黄连配伍阿胶样品A：黄连0.75g、阿胶1.00g(3∶4)；样品B：黄连1.00g、阿胶1.00g(1∶1)；样品C：黄连1.00g、阿胶0.75g(4∶3)；样品D：黄连1.00g、阿胶0.75g(4∶3)。在A、B、C样品中，将黄连与阿胶混合后按上述黄连方法制备供试液，D样品中阿胶烊化后冲兑入黄连煎液，离心，过滤，其余制备操作同上。以上各样品供试液，均平行制备3份。
2.4 样品测定
每份供试液测3次，将样品中黄连碱、小檗碱、巴马汀、药根碱与内标物峰面积之比代入标准曲线，求得各生物碱的浓度，并换算成每克黄连样品溶出生物碱的含量。结果见表1。
表1 黄连与阿胶配伍前后各生物碱的溶出量(mg/g；n=3)
黄连碱
小檗碱
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巴马汀
药根碱
样 品
峰面积比
溶出量
峰面积比
溶出量
峰面积比
溶出量
峰面积比
溶出量
黄 连
4.68
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23.39
16.06
50.03
6.26
22.30
1.81
5.36
黄连配伍阿胶
A
3.97
19.90
13.78
42.98
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5.28
18.85
1.45
4.30
B
4.09
20.47
14.10
43.96
5.14
19.40
1.62
4.79
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C
4.43
22.15
15.47
48.22
5.62
21.69
1.77
5.26
D
4.21
21.05
14.70
, 百拇医药
45.78
5.60
20.22
1.55
4.59
2.5 回收率
精密称取黄连药粉1.0g，照样品供试液制备方法制备，共3份，分别求出每份样品中各生物碱的含量。
精密移取3份制备液各10mL，分别加入高、中、低不同重量的4种生物碱，其余照样品制备项下操作，测得加标后各生物碱的含量，计算加标回收率。黄连碱、小檗碱、巴马汀和药根碱的回收率分别为98.28%、98.38%、97.78%和98.89%，相对标准偏差分别为0.86%、1.12%、1.06%和1.11%。
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2.6 重现性
取黄连样品供试液，连续5次重复进样，测得黄连碱、小檗碱、巴马汀和药根碱含量，相对标准偏差分别为0.45%、0.53%、0.56%和0.48%。
3 讨论
通过试验可以看出，黄连与阿胶配伍后，随着黄连在样品中的比例增加，煎液中黄连生物碱含量在增加，但都比单味黄连中生物碱低，这可能是由于黄连中生物碱与阿胶中蛋白质结合[3]形成沉淀析出使煎液中有效成分下降所致。
由样品C、D生物碱含量的比较可以看出，煎煮方法不同，影响黄连生物碱的溶出量，提示我们在中药复方制剂的生产中，不同工艺可能造成有效成分含量变化，在生产中应采用适当的工艺，以提高有效成分含量。
我们曾用高效液相色谱测试黄连中的生物碱，试用几种不同的溶剂系统，但四种生物碱没有完全分离开，试改用毛细管电泳方法，四种生物碱得到很好的分离效果。用高效毛细管电泳法测定黄连及其药对中黄连生物碱的含量，结果表明方法简便、快捷、重现性好，且准确可靠。
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*国家中医药管理局科研课题(95A3611)
作者简介：乔梁，男，49岁，工程师
参考文献
1 李信炯，胡晓株，杨世华，等.黄连薄层鉴别及其生物碱扫描测定.中成药研究，1987，(1)：12
2 史 林，于烘建，聂万达.小儿牛黄散有效成分的HPCE定量.中成药，1992，14(2)：18～19
3 谭毓治，谢金山.盐酸小檗碱与白蛋白结合的研究.中国中药杂志，1996，21(3)：175～177
(收稿日期：1999-01-30), 百拇医药
单位：乔 梁 (北京医科大学医药卫生分析中心 北京100083)；周洪雷 魏璐雪 (北京中医药大学中药学院 北京100029)
关键词：高效毛细管电泳；黄连；药对；生物碱
北京中医药大学学报990410 摘要：应用高效毛细管电泳测定黄连及黄连配伍阿胶药对中的黄连生物碱含量，保留时间在15～25min之间，内标物是马钱子碱，缓冲液为0.05mol/L的四硼酸钠(pH=7.0)、甲醇(85∶15)，实验结果表明，药对中黄连生物碱含量下降。
Assay the Content of Coptisine in Huanglian Combined with Ejiao through High Efficiency Capillary Electrophoresis
, 百拇医药
Qiao Liang Zhou Honglei Wei Luxue
(Medicine Analysis Center of Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT: To assay the contents of coptisine respectively in Huanglian and the medicinal pair Huanglian with Ejiao through high efficiency capillary electrophoresis. Taking 15-25 minutes as reserving time, strychnine as internal labeling, and 0.05M sodium tetraborate (ph=7.0): methanol (85:15) as balanced solution. Results showed that the content of coptisine in the medicinal pair decreased.
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KEY WORDS: High efficiency capillary electrophoresis; Huanglian; Medicinal pair; Coptisine
黄连(Coptis Chinensis Franch.)中含有原小檗碱型生物碱，已知结构的有小檗碱(Berberine)、巴马汀(Palmatine)、黄连碱(Coptisine)和药根碱(Jatrorrhizine)等。黄连与阿胶配伍出自《伤寒论》中的黄连阿胶汤， 临床上常以黄连∶阿胶=3∶4， 黄连∶阿胶=1∶1，黄连∶阿胶=4∶3等不同比例应用。
为了探讨中药复方不同工艺方法对有效成分的影响，我们研究了不同加工方法以及黄连与阿胶不同比例配伍前后煎液中黄连生物碱的含量变化。对于黄连中各生物碱的测定方法已有不少报道，主要有薄层扫描法[1]和高效液相色谱法[2]等，我们采用毛细管电泳技术对其含量变化进行了研究。
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1 实验条件
1.1 仪器
500TM型高效毛细管电泳仪(美国光谱物理公司)；Chronjet Integrator 4400型数据处理系统。
1.2 药品与试剂
盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱，均购于卫生部药品生物制品检定所；硫酸黄连碱、马钱子碱由北京中医药大学中药化学教研室提供。
黄连、阿胶均购于北京市药材公司，经北京中医药大学中药学院李家实教授鉴定，黄连为毛茛科植物Coptis Chinensis Franch. 的根茎，阿胶为马科动物驴Equus Asinus L.的皮经加工而成的胶块。
甲醇、乙酸、四硼酸钠均为分析纯，重蒸去离子水。
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2 方法与结果
2.1 电泳条件
75cm×75μm熔融石英毛细管柱，有效长度68cm；UV检测波长254nm；分离电压14kV，恒压；分离温度20.0℃，恒温；进样方式为真空进样；进样时间1s。缓冲液：0.05mol/L四硼酸钠溶液(pH=7.0)、甲醇(85∶15)。
2.2 标准曲线
精密称取硫酸黄连碱对照品9.62mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精密称取内标物马钱子碱20.16mg，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度。
精度吸取马钱子碱溶液100μL于5 mL容量瓶中，挥干甲醇，加入上述硫酸黄连碱对照品溶液至刻度，摇匀，精密吸取1mL于样品管中，供毛细管电泳测定。同法测定不同浓度的硫酸黄连碱对照品溶液(由母液分别稀释为1/2，1/4，1/8，1/16，1/32所得)中黄连碱的峰面积。以硫酸黄连碱浓度为横坐标，硫酸黄连碱与内标物峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。回归方程为：y=20.18x-0.038，r=0.9999，浓度在0.024～0.385g/L范围内线性良好。
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精密称取对照品盐酸小檗碱20.94mg、巴马汀12.19mg、药根碱2.59mg，分别置于25mL容量瓶中，其余操作同硫酸黄连碱标准曲线的制备。
盐酸小檗碱的回归方程为：y=32.29x-0.092，r=0.9998，浓度在0.052～0.838g/L范围内线性良好。
盐酸巴马汀的回归方程为：y=27.78x+0.048，r=0.9997，浓度在0.030～0.488g/L范围内线性良好。
盐酸药根碱的回归方程为：y=33.70x+0.0034，r=0.9998，浓度在0.006～0.104g/L范围内线性良好。
2.3 样品制备
黄连粉碎，过40目筛；阿胶粉碎，分别置密闭容器中。精密称取黄连粉1.00g，置于250mL三角瓶中，加水100mL煎煮15min，煎液冷却后离心，过滤，滤液加水定容于100mL容量瓶中，用移液管量取10mL置蒸发皿中，加入内标溶液200μL，水浴蒸干，用70%甲醇溶解后转移至10mL容量瓶中，多次洗涤，洗涤液一并转入容量瓶，70%甲醇定容至刻度。测定前用0.45μm有机膜过滤，滤液作为供试液用于毛细管电泳测试。
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分别精密称取黄连配伍阿胶样品A：黄连0.75g、阿胶1.00g(3∶4)；样品B：黄连1.00g、阿胶1.00g(1∶1)；样品C：黄连1.00g、阿胶0.75g(4∶3)；样品D：黄连1.00g、阿胶0.75g(4∶3)。在A、B、C样品中，将黄连与阿胶混合后按上述黄连方法制备供试液，D样品中阿胶烊化后冲兑入黄连煎液，离心，过滤，其余制备操作同上。以上各样品供试液，均平行制备3份。
2.4 样品测定
每份供试液测3次，将样品中黄连碱、小檗碱、巴马汀、药根碱与内标物峰面积之比代入标准曲线，求得各生物碱的浓度，并换算成每克黄连样品溶出生物碱的含量。结果见表1。
表1 黄连与阿胶配伍前后各生物碱的溶出量(mg/g；n=3)
黄连碱
小檗碱
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巴马汀
药根碱
样 品
峰面积比
溶出量
峰面积比
溶出量
峰面积比
溶出量
峰面积比
溶出量
黄 连
4.68
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23.39
16.06
50.03
6.26
22.30
1.81
5.36
黄连配伍阿胶
A
3.97
19.90
13.78
42.98
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5.28
18.85
1.45
4.30
B
4.09
20.47
14.10
43.96
5.14
19.40
1.62
4.79
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C
4.43
22.15
15.47
48.22
5.62
21.69
1.77
5.26
D
4.21
21.05
14.70
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45.78
5.60
20.22
1.55
4.59
2.5 回收率
精密称取黄连药粉1.0g，照样品供试液制备方法制备，共3份，分别求出每份样品中各生物碱的含量。
精密移取3份制备液各10mL，分别加入高、中、低不同重量的4种生物碱，其余照样品制备项下操作，测得加标后各生物碱的含量，计算加标回收率。黄连碱、小檗碱、巴马汀和药根碱的回收率分别为98.28%、98.38%、97.78%和98.89%，相对标准偏差分别为0.86%、1.12%、1.06%和1.11%。
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2.6 重现性
取黄连样品供试液，连续5次重复进样，测得黄连碱、小檗碱、巴马汀和药根碱含量，相对标准偏差分别为0.45%、0.53%、0.56%和0.48%。
3 讨论
通过试验可以看出，黄连与阿胶配伍后，随着黄连在样品中的比例增加，煎液中黄连生物碱含量在增加，但都比单味黄连中生物碱低，这可能是由于黄连中生物碱与阿胶中蛋白质结合[3]形成沉淀析出使煎液中有效成分下降所致。
由样品C、D生物碱含量的比较可以看出，煎煮方法不同，影响黄连生物碱的溶出量，提示我们在中药复方制剂的生产中，不同工艺可能造成有效成分含量变化，在生产中应采用适当的工艺，以提高有效成分含量。
我们曾用高效液相色谱测试黄连中的生物碱，试用几种不同的溶剂系统，但四种生物碱没有完全分离开，试改用毛细管电泳方法，四种生物碱得到很好的分离效果。用高效毛细管电泳法测定黄连及其药对中黄连生物碱的含量，结果表明方法简便、快捷、重现性好，且准确可靠。
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作者简介：乔梁，男，49岁，工程师
参考文献
1 李信炯，胡晓株，杨世华，等.黄连薄层鉴别及其生物碱扫描测定.中成药研究，1987，(1)：12
2 史 林，于烘建，聂万达.小儿牛黄散有效成分的HPCE定量.中成药，1992，14(2)：18～19
3 谭毓治，谢金山.盐酸小檗碱与白蛋白结合的研究.中国中药杂志，1996，21(3)：175～177
(收稿日期：1999-01-30), 百拇医药