尼莫通对脑缺血后迟发性神经元损伤保护作用的实验研究1
作者：胡国华 陈学奎 陈秋惠 许二赫 赵步云 张丽学
单位：胡国华 陈学奎 陈秋惠 许二赫 白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041；赵步云 白求恩医科大学第一临床学院；张丽学 吉林省劳改中心医院
关键词：尼莫通；迟发性神经元损伤；缺血再灌注
中国老年学杂志990524 摘 要 目的 研究脑缺血再灌注后迟发性神经元坏死(DND)的病理学改变及测定病灶区Ca2+含量的变化，并观察尼莫通对DND的保护作用。方法 制作大鼠一侧大脑中动脉缺血再灌注模型。结果 当脑缺血6 h以上再灌流时DND现象明显。结论 早期应用尼莫通治疗可使DND减轻，起到神经元保护作用。
The experimental study of Nimoton's protective effect on delayed neuronal damage of cerebral ischemia
, http://www.100md.com
Hu Guohua, Zhao Buyun, Zhang Lixue et al
Department of Neurology, Second Clinical College, Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130041
The pathological change of delayed neuronal damage(DND) in focal ischemic-reperfussion of cat cerebrum, and the regional distribution of tissure Ca2+ contents were measured after the occlusion of middle cerebral artery(MCAO). Then Nimoton were used to alleviate the DND of the ischemic-reperfussion. The results revealed that Nimoton is a better protector of ischemic brain damage.
, 百拇医药
Key words Nimoton Delayed neuronal damage Ischemic-reperfussion
近年来，在缺血性脑血管病的治疗观念发生一些重要改变，其中钙离子超载内流损伤引起迟发性神经坏死的观点日益受到重视。本文应用钙通道阻滞剂对脑缺血后迟发性神经元损害的保护作用进行研究。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 健康Wistar大鼠70只，体重250±50 g，雌雄不限，由本校实验动物部提供。随机分为：①单纯缺血组：其中缺血30、60 min及3、6、12、24、48 h，共35只大鼠。②缺血再灌注组：其中又分为缺血3 h再灌3 h、缺血6 h再灌3 h、缺血12 h再灌3 h，共15只大鼠。③尼莫通治疗组：分别于缺血3 h、6 h和12 h再灌前30 min给尼莫通腹腔注射(1 mg/100 g体重)，共15只大鼠。④正常对照组：共5只大鼠。
, 百拇医药
1.2 大鼠局灶性缺血及再灌注模型的制作 参考Longa法〔1〕并加以改进。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(按35 mg/100 g体重)，将鼠固定手术台板上，于颈正中切开，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，分别结扎ECA的分支并切断，结扎前游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉(PPA)，并在其起始部放一动脉夹。ECA上剪一小口约0.2 mm，将3～0号单股尼龙线作为栓塞材料，顶端烫圆，插入栓线，轻推尼龙线尾端经ECA、CCA向ICA内渐进，至ICA颅内分叉部时可将大脑中动脉(MCA)的血液阻断。尼龙线插入深度应固定18 mm，过深则穿破血管因出血鼠立即死亡，此由预实验时完成。将尼龙线结扎固定于颈外动脉近端，插线口处皮肤用丝线缝之。再灌注时，外拉尼龙线使其球端回到ECA处即可恢复MCA供血。对照组仅分离血管而不插尼龙线。
1.3 单纯缺血组、缺血再灌注组和尼莫通治疗组的神经病理学观察 将动物断头，迅速取出脑标本，将尾状核、海马、大脑感觉运动区皮质的组织，立即放入3%戊二醛内固定12 h，再经酒精、丙酮脱水和环氧树脂618包埋，超薄切片用硝酸铅醋酸铀染色。在H600透射电镜下观察。光镜标本系在10%福尔马林溶液中固定、石腊包埋、HE染色。
, 百拇医药
1.4 病灶区组织内Ca2+含量测定 参考赵卫国等〔2〕方法进行病灶区Ca2+含量测定。
2 结果
2.1 缺血组织的形态学观察
2.1.1 单纯缺血组 缺血30 min和60 min鼠脑海马、尾状核、感觉运动区皮质神经元形态均未见异常。缺血3 h光镜下亦属正常，电镜下则可见的线粒体嵴紊乱，髓鞘可见分层。缺血6 h则光镜下即见到神经元周围间隙扩大，胞浆内染色质浓度不均匀，胞核缩小；电镜下见线粒体肿胀，嵴 消失呈空化，基质内有絮状致密物沉积，核染色质聚集。缺血12 h、24 h、48 h，可见不同程度神经元变性、坏死性改变，均较缺血6 h明显加重，神经元数目减少，胞体固缩呈三角形或多角形，核仁不清或消失，细胞结构不清，核质深染固缩。电镜下见神经细胞固缩、核膜破裂、线粒体肿大明显、嵴消失后空化现象突出、细胞器结构紊乱不清。上述改变以海马改变最重，尾核次之，皮质较轻。缺血48 h神经元坏死现象突出。
, 百拇医药
2.1.2 缺血再灌组 缺血3 h再灌3 h鼠脑镜下改变较单纯缺血3 h改变明显些，其中在海马CA1和H1段为主，其他部位神经元亦有相似的病理改变。缺血6 h和12 h再灌3 h鼠脑神经元有不同程度的脱失，病灶中央组织结构崩解消失。光镜及电镜下改变较单纯缺血组明显加重，胞体、胞核、胞质均有严重受损改变。而缺血时间越长再灌后病理改变越重，表现神经细胞核固缩，胞体缩小变形、胞浆尼氏小体消失，可见到鬼影细胞，正常神经元数目明显减少。
2.1.3 尼莫通治疗组 应用德国Bayer公司产尼莫通(Nimoton)，每100 g体重大鼠按1 mg腹腔注射，均于各组缺血3 h、6 h、12 h再灌注前30 min给药。用药后海马区神经元损失明显减轻。CA1段仍有较多正常神经元，电镜下线粒体轻度空化，粗面内质网轻度扩张，且无脱颗粒现象。而缺血12 h再灌注时应用尼莫通时保护作用差。与盐水对照观察显示，无论是单纯缺血还是缺血再灌注，应用尼莫通后脑组织病理变化较未治疗组明显减轻。
, 百拇医药
2.2 缺血对照组鼠脑含水量和Ca2+含量 正常对照组鼠脑各区含水量和缺血对侧相应脑区含水量百分比均无显著差异(76.61±0.50，77.16±0.52)。上述脑组织Ca2+含量亦无明显差异(分别为2.20±0.58，2.21±0.61)。
2.3 缺血梗塞区和周围水肿区Ca2+含量的变化 见表1。
表1 鼠脑缺血梗塞区和周围水肿区
Ca2+含量的时相变化(
±s)
n
3 h
6 h
, 百拇医药
12 h
24 h
缺血梗塞区
6
3.22±0.55
4.81±2.12
5.81±0.92
6.38±2.29
周围水肿区
6
2.51±0.81
2.71±1.18
, 百拇医药
3.82±1.28
4.31±0.77
3 讨论
神经元缺血后导致死亡的病理代谢变化机制是一个亟待解决的课题。近年来，一些学者的研究发现Ca2+在细胞缺血后的一系列病理生理过程中起重要作用，甚至认为Ca2+的损害是导致细胞死亡的“最后途径”。Siesjo等将Ca2+损伤假说引入人脑缺血的病理机制。Deshpanda的研究发现脑缺血后梗塞区内有过量的Ca2+积聚，而且测得神经元线粒内有Ca2+的过量沉积。Siesjo等进一步研究发现，当脑缺血再开通(缺血再灌流)时，原已缺血的神经元当重新恢复供血后会引起迟发性神经元损伤(Delayed neuronal damage，DND)，其中Ca2+超载内流是重要原因之一。当缺血再灌流后，细胞外的大量Ca2+向细胞内流动，造成细胞的致命性损害甚至死亡。
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脑缺血后再灌流是恢复脑缺血期损伤的必需条件，但重新供血又不可避免引起再灌注损伤。许多脑缺血再灌注的实验发现，再灌注的初期，表现为充血反应，但随后由于血管阻力的大大增加，脑就转入迟发性低灌注期，此时原已缺血的神经元又遭受到第二次缺血损伤而死亡，而这种迟发性神经元的死亡又与Ca2+过量内流造成的多方面的作用有关〔3〕。因此，在脑缺血损伤的防治中，适时采取综合治疗措施，包括使用Ca2+阻滞剂抑制Ca2+细胞内流等对减轻脑缺血损伤有重要意义。
3.1 局灶性脑缺血模型的设计 本实验选用大鼠制做一侧大脑中动脉缺血(MCAO)及再灌注模型，模拟人类脑缺血的特点，较全脑缺血(四血管法)模型更接近于人类。大鼠的脑血管的解剖特点接近于人类，血管损伤部位较恒定，重复性好，而且已有大量有关大鼠的生理、药理和生化方面的实验资料可供比较分析。大鼠成本低、可提供较大数量，具有极强的抗感染能力和生命力，常规操作一般不会引起伤口继发性感染。到目前为止，大鼠仍是脑缺血研究的常用实验动物，而且MCAO模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型。血管内直接线栓闭塞法(线栓法)MCAO模型，因具有不开颅、效果肯定且可准确控制缺血及再灌注时间的优点，因此用其研究神经元对缺血的敏感性、耐受性及再灌注损伤和治疗时间窗较为理想，同时该模型对动物全身的生理功能影响较小，动物存活时间长，也适用慢性脑损伤的研究。我们在实验中体会到，单股尼龙线的顶端一定要烫圆，否则易穿破血管出血，而且插入深度在18 mm左右较为合适，过深亦易穿透血管出血。
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3.2 缺血再灌流的神经元损伤较单纯缺血损伤明显 本组单纯缺血3 h的大鼠脑组织形态学改变不甚明显，说明脑组织对缺血尚有一定的耐受性。但缺血6 h的改变已经很突出，且随着缺血时间的延长越来越重，提示在缺血6 h以内，甚至3 h内尽早改善血液供应，对挽救缺血神经元是极有价值的，其“时间窗”应在3～6 h以内。缺血再灌注的脑组织损伤确比单纯缺血组严重，提示再灌注损伤现象的存在，说明缺血再灌注可引起DND。本研究也显示缺血早期再灌注损伤较轻，缺血6 h以后再灌注损伤加重，其中缺血区脑水肿和Ca2+浓度升高，而正常对照组、健侧对照组，脑水肿和Ca2+升高现象均不明显。
3.3 钙离子通道阻滞剂的应用 近年来很多研究资料证实，钙离子通道阻滞剂用于缺血性血管病的治疗有效，其中以尼莫地平和氟桂利嗪效果较好，优于其他同类药物。我们的实验应用德国产尼莫通，考虑到该药有高亲脂性，易透过血脑屏障。实验结果也显示，尼莫通对脑缺血DND有较好的保护作用，可作为一种神经保护剂用于脑血栓治疗。
, 百拇医药
1 吉林省科委科研基金课题
作者简介：胡国华，男，49岁，教授
4 参考文献
1 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S et al.Reversible middle cerebral artery occusion without craniectomy in rats.Stroke，1989；20：84
2 赵卫国，张天锡，施爱芳 et al.脑缺血脑水肿的实验研究——钙在脑缺血损伤中的作用.中华神经精神科杂志，1991；24(1)：27
3 Cheung JY, Bonventre JV, Malis CD.Calcium and ischemic injury.N Engl J Med，1986；314：167
1998-12-06收稿
1999-04-11修回, 百拇医药
单位：胡国华 陈学奎 陈秋惠 许二赫 白求恩医科大学第二临床学院，长春 130041；赵步云 白求恩医科大学第一临床学院；张丽学 吉林省劳改中心医院
关键词：尼莫通；迟发性神经元损伤；缺血再灌注
中国老年学杂志990524 摘 要 目的 研究脑缺血再灌注后迟发性神经元坏死(DND)的病理学改变及测定病灶区Ca2+含量的变化，并观察尼莫通对DND的保护作用。方法 制作大鼠一侧大脑中动脉缺血再灌注模型。结果 当脑缺血6 h以上再灌流时DND现象明显。结论 早期应用尼莫通治疗可使DND减轻，起到神经元保护作用。
The experimental study of Nimoton's protective effect on delayed neuronal damage of cerebral ischemia
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Hu Guohua, Zhao Buyun, Zhang Lixue et al
Department of Neurology, Second Clinical College, Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130041
The pathological change of delayed neuronal damage(DND) in focal ischemic-reperfussion of cat cerebrum, and the regional distribution of tissure Ca2+ contents were measured after the occlusion of middle cerebral artery(MCAO). Then Nimoton were used to alleviate the DND of the ischemic-reperfussion. The results revealed that Nimoton is a better protector of ischemic brain damage.
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Key words Nimoton Delayed neuronal damage Ischemic-reperfussion
近年来，在缺血性脑血管病的治疗观念发生一些重要改变，其中钙离子超载内流损伤引起迟发性神经坏死的观点日益受到重视。本文应用钙通道阻滞剂对脑缺血后迟发性神经元损害的保护作用进行研究。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 健康Wistar大鼠70只，体重250±50 g，雌雄不限，由本校实验动物部提供。随机分为：①单纯缺血组：其中缺血30、60 min及3、6、12、24、48 h，共35只大鼠。②缺血再灌注组：其中又分为缺血3 h再灌3 h、缺血6 h再灌3 h、缺血12 h再灌3 h，共15只大鼠。③尼莫通治疗组：分别于缺血3 h、6 h和12 h再灌前30 min给尼莫通腹腔注射(1 mg/100 g体重)，共15只大鼠。④正常对照组：共5只大鼠。
, 百拇医药
1.2 大鼠局灶性缺血及再灌注模型的制作 参考Longa法〔1〕并加以改进。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(按35 mg/100 g体重)，将鼠固定手术台板上，于颈正中切开，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，分别结扎ECA的分支并切断，结扎前游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉(PPA)，并在其起始部放一动脉夹。ECA上剪一小口约0.2 mm，将3～0号单股尼龙线作为栓塞材料，顶端烫圆，插入栓线，轻推尼龙线尾端经ECA、CCA向ICA内渐进，至ICA颅内分叉部时可将大脑中动脉(MCA)的血液阻断。尼龙线插入深度应固定18 mm，过深则穿破血管因出血鼠立即死亡，此由预实验时完成。将尼龙线结扎固定于颈外动脉近端，插线口处皮肤用丝线缝之。再灌注时，外拉尼龙线使其球端回到ECA处即可恢复MCA供血。对照组仅分离血管而不插尼龙线。
1.3 单纯缺血组、缺血再灌注组和尼莫通治疗组的神经病理学观察 将动物断头，迅速取出脑标本，将尾状核、海马、大脑感觉运动区皮质的组织，立即放入3%戊二醛内固定12 h，再经酒精、丙酮脱水和环氧树脂618包埋，超薄切片用硝酸铅醋酸铀染色。在H600透射电镜下观察。光镜标本系在10%福尔马林溶液中固定、石腊包埋、HE染色。
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1.4 病灶区组织内Ca2+含量测定 参考赵卫国等〔2〕方法进行病灶区Ca2+含量测定。
2 结果
2.1 缺血组织的形态学观察
2.1.1 单纯缺血组 缺血30 min和60 min鼠脑海马、尾状核、感觉运动区皮质神经元形态均未见异常。缺血3 h光镜下亦属正常，电镜下则可见的线粒体嵴紊乱，髓鞘可见分层。缺血6 h则光镜下即见到神经元周围间隙扩大，胞浆内染色质浓度不均匀，胞核缩小；电镜下见线粒体肿胀，嵴 消失呈空化，基质内有絮状致密物沉积，核染色质聚集。缺血12 h、24 h、48 h，可见不同程度神经元变性、坏死性改变，均较缺血6 h明显加重，神经元数目减少，胞体固缩呈三角形或多角形，核仁不清或消失，细胞结构不清，核质深染固缩。电镜下见神经细胞固缩、核膜破裂、线粒体肿大明显、嵴消失后空化现象突出、细胞器结构紊乱不清。上述改变以海马改变最重，尾核次之，皮质较轻。缺血48 h神经元坏死现象突出。
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2.1.2 缺血再灌组 缺血3 h再灌3 h鼠脑镜下改变较单纯缺血3 h改变明显些，其中在海马CA1和H1段为主，其他部位神经元亦有相似的病理改变。缺血6 h和12 h再灌3 h鼠脑神经元有不同程度的脱失，病灶中央组织结构崩解消失。光镜及电镜下改变较单纯缺血组明显加重，胞体、胞核、胞质均有严重受损改变。而缺血时间越长再灌后病理改变越重，表现神经细胞核固缩，胞体缩小变形、胞浆尼氏小体消失，可见到鬼影细胞，正常神经元数目明显减少。
2.1.3 尼莫通治疗组 应用德国Bayer公司产尼莫通(Nimoton)，每100 g体重大鼠按1 mg腹腔注射，均于各组缺血3 h、6 h、12 h再灌注前30 min给药。用药后海马区神经元损失明显减轻。CA1段仍有较多正常神经元，电镜下线粒体轻度空化，粗面内质网轻度扩张，且无脱颗粒现象。而缺血12 h再灌注时应用尼莫通时保护作用差。与盐水对照观察显示，无论是单纯缺血还是缺血再灌注，应用尼莫通后脑组织病理变化较未治疗组明显减轻。
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2.2 缺血对照组鼠脑含水量和Ca2+含量 正常对照组鼠脑各区含水量和缺血对侧相应脑区含水量百分比均无显著差异(76.61±0.50，77.16±0.52)。上述脑组织Ca2+含量亦无明显差异(分别为2.20±0.58，2.21±0.61)。
2.3 缺血梗塞区和周围水肿区Ca2+含量的变化 见表1。
表1 鼠脑缺血梗塞区和周围水肿区
Ca2+含量的时相变化(
±s)n
3 h
6 h
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12 h
24 h
缺血梗塞区
6
3.22±0.55
4.81±2.12
5.81±0.92
6.38±2.29
周围水肿区
6
2.51±0.81
2.71±1.18
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3.82±1.28
4.31±0.77
3 讨论
神经元缺血后导致死亡的病理代谢变化机制是一个亟待解决的课题。近年来，一些学者的研究发现Ca2+在细胞缺血后的一系列病理生理过程中起重要作用，甚至认为Ca2+的损害是导致细胞死亡的“最后途径”。Siesjo等将Ca2+损伤假说引入人脑缺血的病理机制。Deshpanda的研究发现脑缺血后梗塞区内有过量的Ca2+积聚，而且测得神经元线粒内有Ca2+的过量沉积。Siesjo等进一步研究发现，当脑缺血再开通(缺血再灌流)时，原已缺血的神经元当重新恢复供血后会引起迟发性神经元损伤(Delayed neuronal damage，DND)，其中Ca2+超载内流是重要原因之一。当缺血再灌流后，细胞外的大量Ca2+向细胞内流动，造成细胞的致命性损害甚至死亡。
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脑缺血后再灌流是恢复脑缺血期损伤的必需条件，但重新供血又不可避免引起再灌注损伤。许多脑缺血再灌注的实验发现，再灌注的初期，表现为充血反应，但随后由于血管阻力的大大增加，脑就转入迟发性低灌注期，此时原已缺血的神经元又遭受到第二次缺血损伤而死亡，而这种迟发性神经元的死亡又与Ca2+过量内流造成的多方面的作用有关〔3〕。因此，在脑缺血损伤的防治中，适时采取综合治疗措施，包括使用Ca2+阻滞剂抑制Ca2+细胞内流等对减轻脑缺血损伤有重要意义。
3.1 局灶性脑缺血模型的设计 本实验选用大鼠制做一侧大脑中动脉缺血(MCAO)及再灌注模型，模拟人类脑缺血的特点，较全脑缺血(四血管法)模型更接近于人类。大鼠的脑血管的解剖特点接近于人类，血管损伤部位较恒定，重复性好，而且已有大量有关大鼠的生理、药理和生化方面的实验资料可供比较分析。大鼠成本低、可提供较大数量，具有极强的抗感染能力和生命力，常规操作一般不会引起伤口继发性感染。到目前为止，大鼠仍是脑缺血研究的常用实验动物，而且MCAO模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型。血管内直接线栓闭塞法(线栓法)MCAO模型，因具有不开颅、效果肯定且可准确控制缺血及再灌注时间的优点，因此用其研究神经元对缺血的敏感性、耐受性及再灌注损伤和治疗时间窗较为理想，同时该模型对动物全身的生理功能影响较小，动物存活时间长，也适用慢性脑损伤的研究。我们在实验中体会到，单股尼龙线的顶端一定要烫圆，否则易穿破血管出血，而且插入深度在18 mm左右较为合适，过深亦易穿透血管出血。
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3.2 缺血再灌流的神经元损伤较单纯缺血损伤明显 本组单纯缺血3 h的大鼠脑组织形态学改变不甚明显，说明脑组织对缺血尚有一定的耐受性。但缺血6 h的改变已经很突出，且随着缺血时间的延长越来越重，提示在缺血6 h以内，甚至3 h内尽早改善血液供应，对挽救缺血神经元是极有价值的，其“时间窗”应在3～6 h以内。缺血再灌注的脑组织损伤确比单纯缺血组严重，提示再灌注损伤现象的存在，说明缺血再灌注可引起DND。本研究也显示缺血早期再灌注损伤较轻，缺血6 h以后再灌注损伤加重，其中缺血区脑水肿和Ca2+浓度升高，而正常对照组、健侧对照组，脑水肿和Ca2+升高现象均不明显。
3.3 钙离子通道阻滞剂的应用 近年来很多研究资料证实，钙离子通道阻滞剂用于缺血性血管病的治疗有效，其中以尼莫地平和氟桂利嗪效果较好，优于其他同类药物。我们的实验应用德国产尼莫通，考虑到该药有高亲脂性，易透过血脑屏障。实验结果也显示，尼莫通对脑缺血DND有较好的保护作用，可作为一种神经保护剂用于脑血栓治疗。
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1 吉林省科委科研基金课题
作者简介：胡国华，男，49岁，教授
4 参考文献
1 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S et al.Reversible middle cerebral artery occusion without craniectomy in rats.Stroke，1989；20：84
2 赵卫国，张天锡，施爱芳 et al.脑缺血脑水肿的实验研究——钙在脑缺血损伤中的作用.中华神经精神科杂志，1991；24(1)：27
3 Cheung JY, Bonventre JV, Malis CD.Calcium and ischemic injury.N Engl J Med，1986；314：167
1998-12-06收稿
1999-04-11修回, 百拇医药