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编号:10212043
血清ApoAI和ApoB的测定方法进展及其临床意义
http://www.100md.com 《右江民族医学院学报》 1999年第5期
     作者:黄忠仕

    单位:黄忠仕 右江民族医学院生物化学教研室 百色 533000

    关键词:

    右江民族医学院学报9905117 载脂蛋白(Apolpoprotein,Apo)是指脂蛋白(Lp)中的蛋白质。ApoAI及ApoB是其中的两个亚型。ApoAI是HDL的主要蛋白质,占HDL蛋白的60%~70%,ApoB是LDL 的主要蛋白质,占LDL蛋白质的95%以上。近年来,随着分子生物学的发展及检测方法的进步,证实Apo(特别是ApoAI和ApoB)的含量变化较HDL、LDL及VLDL更易区别正常与异常,因而是监测心血管疾病以及其他许多疾病较血脂更重要的指标,倍受临床重视,应用愈来愈广泛。现就此作一概述。

    1 ApoAI及ApoB测定方法的进展
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    Apo测定在国际上仅有十多年历史,而国内应用的时间更短。Apo不同于血清其他蛋白质,因为它与脂类物质复合成脂蛋白颗粒,因此比测定血清中其他少量蛋白质困难得多,而且也不可能根据其特有的功能而进行测定。目前Apo的测定方法大致有三类[1],均适用于ApoAI和ApoB的测定。

    1.1 利用超速离心法和各种层析技术相结合分离和纯化Apo,然后以一般蛋白质定量法测定。此类方法的特点是先要经过分离提纯,不易准确定量,操作也太复杂,不易于临床推广,只作为研究手段。

    1.2 利用电泳分离后染色及光密度计扫描定量 该法特点是灵敏度高,但不同的Apo的染色性能不一定相同,染色的重复性及光度法的线性要经常监视,实验条件要严格控制。此法一般只在不能进行免疫分析法测定时采用。

    1.3 免疫分析法 此法有较高的灵敏度和特异性,而且不需要预先分离脂蛋白,操作也相当简便,适用于临床应用,但需要特异抗血清。目前常用的免疫方法有:单向免疫扩散法(RID)、火箭免疫电泳法(EIA)、免疫比浊法、化学发光免疫分析法(CLIA)等。在免疫定量测定Apo时,必须考虑以下几个问题:①标本的适当处理使标本中的Apo抗原位点充分暴露;②满意的参考标准;③均一的抗血清;④方法的标准化等。只有解决好以上四个问题,得出的结果才有可靠性和可比性。下述的方法大都在其他蛋白质的免疫测定法中广泛应用,基本方法和原理可参阅各种免疫分析法书刊。现只综述用于测定ApoAI和ApoB测定时的特殊问题。
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    1.3.1 单向免疫扩散法(RID)[2] 此法简单易行,但要消耗较多的抗血清,扩散时间长。用此法测定时,琼脂糖凝胶的厚度要均匀,抗血清在琼脂糖中要混匀,打孔距离不可过近,血清标本的稀释及加入小孔中的量(一般4~5ml)要十分准确。使血清中的抗原分子能自由扩散入凝胶中,与标准液中的抗原有相同的免疫反应。在测定ApoB时,由于VLDL和LDL的颗粒大小不一,在琼脂糖浓度为1.5%~2%时,可能只有LDL中的ApoB被测出,而VLDL中的ApoB未被测定。但此法适用于ApoAI的测定,正常浓度时的批间变异系数为5%~15%。据报道,脱脂RID法比不脱脂RID、EIA、ITA法测定血清ApoAI更灵敏,结果更反映病情的改变。

    1.3.2 火箭免疫电泳法[3] 此法较RID法快速、灵敏,抗血清用量很少。操作时最好能通流水冷却,使琼脂糖凝胶保持15℃恒温。此法适用于ApoAI和ApoB的测定,火箭的面积与峰高一般成比例关系,可以只测峰来代替面积。此法的批内CV1.5%~8%,批间CV 3%~10%。
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    1.3.3 免疫比浊法[4] 此法简便快速,能用于自动分析仪,可以大批量测定。但由于此法测定抗原抗体复合物形成而产生的混浊,而脂蛋白颗粒的不均一性,使免疫复合物的大小也不一致,脂蛋白颗粒本身也有明显的光散射,会影响测定结果。免疫比浊法分两种:一是测定光散射,需特殊仪器;另一种方法是利用一般光度计测定通过混浊液后的透射光强度,称为透射比浊法。此法测定ApoAI和ApoB时,标本的预处理很重要。有人主张移除标本中的VLDL及LDL后测HDL-ApoAI,这样可避免大颗粒脂蛋白引起光散射的干扰。至于ApoB测定中,如果VLDL很高而使血清混浊时,一般作脱脂处理,较好的办法是加入脂蛋白脂酶后在37℃孵育6~18h,然后离心,取上清液稀释后测定。孙明洪[5]在透射比浊法的基础上,用考马斯亮蓝(CBB)显色检测Apo抗原-抗体免疫复合物中蛋白质含量,从而建立了一种比色测定ApoAI和B的方法,克服了比浊法易受高CM和高VLDL致标本混浊及抗血清用量大等不足。这类方法测定ApoAI时,批内CV<5%,批间<6%,测ApoB时,批内CV3%~5%,批间CV<6%。
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    1.3.4 酶联免疫测定法[6] 此法需制备酶与ApoLP或其抗体的交联物及酶标光度计,可测大量标本,抗血清用量较小,测定时间也较短,亦适用于自动操作。这类方法很多:有用ApoLP包被聚苯乙烯板小孔的竞争法;有用抗体包被的夹心法;有MAB竞争法,此法测ApoB时,将LDL-ApoB包被在小孔中,加入稀释的标本或标准液后,再加入MAB,放置18h后洗涤,然后以HRP标记的抗体(羊抗小鼠IgG)检测结合在固相上的MAB。酶联免疫法测ApoB的灵敏度在不同的报道中为20~100ng,批内CV8%,批间10%。

    1.3.5 放射免疫法[7] 此法是Apo测定的传统方法,最灵敏,最节省抗血清,但需要的设备条件比其他方法都多,均适用于ApoAI和ApoB的测定。本法一般用125I标记抗原作为示踪物,灵敏度为51 μg/L,检测范围0.1~12.8mg/L,批内CV6.2%,批间7.0%。
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    此外,测定ApoAI及ApoB的方法还有荧光免疫分析法,化学发光免疫法等。但因需要特殊仪器及操作复杂等原因,现已少用。

    2 ApoAI和ApoB测定的临床意义

    Apo具有结合转运脂质,稳定脂蛋白结构,激活或调节脂蛋白的关键酶,如脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂肪酶(HTGL)及卵磷脂胆固醇酰基转移(LCAT)的活性以及识别LP受体等重要功能。ApoAI是LCAT的激活剂,参与LP代谢的LCAT催化新生HDL中卵磷脂2位脂肪酸转移至胆固醇上,从而生成胆固醇酯,这与HDL的成熟及胆固醇的逆向运转密切相关。ApoB参与LDL受体的识别,与LDL的运转和代谢密切相关。因此ApoAI及ApoB是临床许多疾病诊断和疗效判断的主要指标之一。

    2.1 与动脉硬化及冠心病的关系[8~10] 动脉硬化(AS)及冠心病(CHD)是脂质代谢紊乱性疾病之一,具有很高的发病率和死亡率。临床上常用的除TG、TC外,近年来又增加了HDL-C、LDL-C、VLDL-C三项指标,但由于胆固醇受饮食、运动等影响较大,况且在冠心病中,临床症状可能很明显,但TG和TC等指标可能不出现异常结果。一般情况下,当TG、TC增高时,ApoAI下降,ApoB升高,ApoAI/ApoB升高,这些指标与正常对照组差异有显著性。在TG、TC正常的冠心病中,ApoAI、ApoB及ApoAI/ApoB均发生变化,因此ApoAI、ApoB及ApoAI/ApoB是诊断动脉硬化和冠心病不可缺少的生化指标。
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    2.2 与高血压症的关系[11] 高血压发病的机理很多,其中脂质代谢紊乱是其病因之一。高血压时,ApoAI下降,ApoB明显升高,ApoAI/ApoB比值明显下降,此三项指标均与正常对照组差异有显著性。相关分析结果表明与ApoAI与HDL,ApoB与LDL具有显著相关性,ApoAI/ApoB与TC、HDL、LDL相关性也较显著。

    2.3 与肝脏疾病的关系[12,13] 肝病是Apo代谢的中心器官,ApoAI、B100由肝脏合成。当肝脏损害时,其合成功能降低,因而血清中ApoAI、ApoB含量下降,其下降程度与肝细胞损害程度成正相关。一般情况下患急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、胆道梗阻时ApoAI明显下降(P<0.05),患胆道梗阻、肝硬化时ApoB明显下降(P<0.05),而患急、慢性肝炎时ApoB下降,但与正常对照组比较差异无显著性。
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    2.4 与糖尿病的关系[14,15] 糖尿病患者不仅空腹血糖明显增高,而且存在并发心血管疾病的危险因素。一般情况下,糖尿病患者ApoB升高(与正常对照组差异有显著性),ApoAI及ApoAI/ApoB下降,并且随着病史的延长而有逐渐加重的趋势。糖尿病患者常伴有心脑并发症及视网膜病变,因此ApoAI和ApoB测定对并发症的诊断、预后有一定的参考价值。

    2.5 与甲状腺疾病的关系[16] 甲状腺机能障碍时,血脂发生明显变化,ApoAI和ApoB亦发生变化。甲亢时ApoAI和ApoB(特别是ApoB100)显著下降,ApoB/ApoAI比值显著下降;甲减时ApoAI和ApoB(特别是ApoB100)显著升高。修玲玲[16]报告,ApoAI和ApoB还可用于甲亢和甲减药疗效的观察及评价。甲亢治疗后,ApoAI及ApoB均上升,与治疗前比较差异有高度显著性,甲减治疗后,ApoAI及ApoB均下降,与治疗前差异亦有显著性。
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    2.6 与肾病的关系[17] 在肾病患者中,ApoAI、ApoAI/ApoB均明显低于健康人(P<0.05),ApoB在男性患者有明显增高(P<0.05),在女性患者中升高不显著,但女性患者的ApoAI/ApoB较正常对照组差异有显著性。说明肾脏疾病患者中抗动脉粥样硬化因子降低,而致病因子升高,因此对肾脏疾病的诊治进程中,应早期观察Apo的变化,在治疗原发病的同时,及时采取相应预防措施,消除或降低引起心血管合并症的危险因素,延长患者的生存时间。

    2.7 与恶性血液病的关系[18] 在恶性血液病如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、恶性组织细胞白血病(mH)中,血清ApoAI水平明显低于正常对照组,血清ApoB明显高于正常对照组,ApoAI/ApoB的比值与正常对照组相比差异有高度显著性。随着病情的变化发展,ApoAI和ApoB也发生变化,因此监测ApoAI和ApoB水平尤其ApoAI/ApoB的比值是对恶性血液病的疗效判断,病情监测的重要辅助指标。
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    2.8 与恶性肿瘤关系[19] 恶性肿瘤患者血清ApoAI、ApoB均明显下降(P<0.01)。恶性肿瘤患者ApoB下降,是因为肿瘤的增殖需要大量的胆固醇作为细胞膜的原料,而ApoB与胆固醇构成LDL复合体,LDL通过其内的ApoB与肿瘤表面的LDL受体结合,并被降解。分化程度越低的细胞,其表面的LDL受体数量越多,对胆固醇及ApoB的消耗也较多。而ApoAI主要存在于HDL中,恶性肿瘤患者血浆中ApoAI的降低是否与患者Lp(a)的合成增加有关,尚有待进一步研究。

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    (1999-03-12收稿), 百拇医药