皮肤鳞状细胞癌细胞周期调节因子的研究
作者：陆前进 文海泉 颜兰香 陈森林 刘保安 卢放根 杨竹林
单位：陆前进 文海泉 颜兰香 陈森林 刘保安 第二附属医院皮肤科 长沙 410011；卢放根 第二附属医院消化内科 长沙 410011；杨竹林 第二附属医院肝胆研究室 长沙 410011
关键词：皮肤肿瘤；癌；细胞周期；调节因子*；免疫组织化学
湖南医科大学学报990511 提要 采用免疫组化染色检测30例皮肤鳞癌组织细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)，p16及Rb的表达，阳性率依次为66.7%，53.3%，33.3%和36.7%；cyclin D1及CDK4于癌巢边缘细胞表达强于中央癌细胞，且其分化程度越低，阳性着色细胞越多，着色越深。提示细胞周期尤其G1期的正向调节因子的过度表达及负向调节因子的低表达在皮肤鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R730.261
Study on regulators of the cell cycle in cutaneous
squamous cell carcinoma
Lu Qianjin Lu Fanggen Yang Zhulin Wen Haiquan Yan Lanxiang Chen Shenlin Liu Bao-an
(Department of Dermatology, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
In order to investigate the relationship between the regulators of cell cycle and cutaneous squamous cell carcinoma(SCC), we used an immunohistochemical staining technique to examine the expression of cyclin D1, p16 and Rb in the paraffin embeded skin cancer tissues of 30 patients with SCC. The positive percentage of cyclin D1, CDK4, p16 and Rb was 66.7%, 53.3%, 33.3%, and 36.7%, respectively. The overexpression of cyclin D1 and CDK4 could be observed frequently in low grade of differentiated cells, especially in marginal cells of the cancer nest. The results indicate that the aberrant expression of positive and negative regulators of the cell cycle may be involved in the carcinogenesis and evolution of SCC.
, 百拇医药
Key words skin neoplasms; carcinoma; cell cycle; regulator*; immunohistochemistry
细胞周期与细胞癌变的关系是近年来生命科学研究中的热门课题之一。研究表明，二者已不再是人们所认为的两个分割的事物。在细胞发生恶性转化过程中，除癌基因/抑癌基因的正负调节失控外，细胞周期中的一些调控因子参与这一过程，特别是G1期相关的各种因子，包括正向调节作用的细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)以及负向调节作用的细胞周期蛋白依赖性抑制因子(cyclin-dependent inhibitor, CDI)如p16和p21等，抑癌基因产物，如p53及Rb等。为探索皮肤鳞状细胞癌(SCC)中某些细胞周期调节因子的状态，本文应用免疫组织化学(组化)方法检测30例SCC组织cyclin D1,CDK4,p16及Rb的表达。
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1 材料与方法
1.1 标本
30例SCC组织取自湖南省肿瘤医院病理科1994年1月～1996年10月的活检标本，其中高分化23例，中分化4例，低分化3例。标本经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。
1.2 试剂
cyclin D1鼠抗人单抗，CDK4兔抗人多抗，p16兔抗人多抗，Rb兔抗人多抗，生物素化羊抗兔IgG，生物素化羊抗鼠IgG，SABC及DAB等试剂均为北京中山生物制剂公司产品。
1.3 方法
采用免疫组化ABC法。石蜡标本切成厚4μm的薄片，用二甲苯脱蜡，不同浓度的酒精水化，3% H2O2甲醇清除内源性过氧化物酶，自来水彻底清洗后再用PBS缓冲液清洗，分别加入一抗cyclin D1，CDK4，p16，Rb(1∶100)及正常羊血清(1∶50)，于4℃过夜；PBS洗片；加生物素化羊抗兔、羊抗鼠IgG,37℃ 30min，PBS洗片；加SABC 37℃ 30min，PBS洗片；加DAB显色剂显色5～10min，自来水冲洗，乙醇固定，凉干；封片，于光学显微镜下观察结果。观察10个高倍视野并计数阳性细胞。以阳性细胞率≥10%定为阳性，<10%为阴性。根据阳性细胞所占面积分为4个等级，“-”无明显阳性细胞；“+”阳性细胞的面积小于25%；“++”阳性细胞面积在25%～75%；“+++”阳性细胞的面 积大于75%。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。
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2 结 果
cyclin D1，CDK4，p16及Rb阳性染色均为棕黄色。cyclin D1和CDK4主要定位于细胞核，少数定位于细胞浆；p16和Rb主要定位于细胞浆，少数定位于细胞核(图1～4)。cyclin D1,CDK4,p16及Rb的阳性病例率依次为66.7%(20/30)，53.3%(16/30)，33.3%(10/30)和36.7%(11/30)。11例呈现Rb阳性表达的肿瘤，其中9例p16为阴性。cyclin D1和CDK4表达于癌巢边缘细胞(++～+++)强于中央癌细胞(+～++)；且癌细胞分化程度越低，cyclin D1及CDK4阳性着色细胞越多，着色越深。在不同分化状态的皮肤鳞状细胞癌中cyclin D1,CDK4,p16及Rb的表达见附表。
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附表 cyclin D1,CDK4,p16及Rb在不同分化的SCC中的表达 SCC分化程度
总例数
阳性例数
cyclin D1
CDK4
p16
Rb
高分化
23
16
11
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8
9
中分化
4
2
3
1
2
低分化
3
2
2
1
0
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3 讨 论
真核细胞的细胞周期包括S，M两个主要周期和G1，G2两个间隔期。G1期为DNA复制准备期，S期为DNA复制期，G2期为细胞有丝分裂准备期，M期为有丝分裂期。这一细胞周期的完成又依赖于细胞周期中的一系列正/负调节因子的相互作用，使细胞顺利地渡过G1/S，G2/M两个转折点。目前的研究表明，细胞周期中的多种调节因子参与细胞癌变，特别是G1期的D型细胞周期蛋白的过度表达，细胞周期蛋白依赖性抑制因子p16,p15,p21,p27及参与G1期负向调节的抑癌基因产物p53及Rb的表达，皆可导致恶性肿瘤的发生。人类恶性肿瘤中常出现cyclin的异常表达，尤其cyclin D1的过表达[1～4]。体外实验表明，cyclin D1能刺激CDK4介导的Rb磷酸化，使Rb对细胞生长的抑制效应失活[5]。cyclin D1的过度表达，将使CDK4对Rb的调节失常，从而导致细胞失控性生长。CDK4激酶活性同时还受p16的特异性抑制[6]。p16是新近分离出的抑癌基因；在许多肿瘤中发现有该基因的缺失或突变[7，8]。p16机能丧失，同时会导致CDK4对Rb的调节障碍，使Rb处于持久的磷酸化状态。正常的细胞周期活动中，Rb在G1期的失活依赖于p16的表达增高，从而抑制CDK4的活性。故认为Rb阴性肿瘤可能会有较高水平的p16表达，而Rb阳性肿瘤则可能存在p16的表达低下。
, 百拇医药
本资料显示皮肤鳞状细胞癌中cyclin D1和CDK4阳性病例率高于p16及Rb阳性病例率，且cyclin D1及CDK4于癌巢边缘细胞表达(++～+++)强于中央癌细胞(+～++)，低分化癌组织表达强于高分化癌组织。此结果说明cyclin D1和CDK4表达与肿瘤本身生物学行为相关。皮肤鳞状细胞癌中p16和Rb阳性病例率低，分析其原因可能由于p16,Rb基因失活或突变，或由于其他因素抑制了p16和Rb的表达。p16,Rb蛋白表达受抑，肿瘤细胞进入生长分裂周期及脱离细胞周期而进入分化状态过程失控，导致细胞恶性转化。本文还发现，在Rb阳性的皮肤鳞癌中，81.8%不表达p16，而在p16阳性的皮肤鳞癌中，90%不表达Rb。这与人们在肺癌和膀胱癌细胞系中所检测到的结果一致。Rb与p16的表达之间的负相关提示二者中任何一个异常都足以使G1期细胞失控性增殖[9，10]。本研究结果表明，cyclin D1与CDK4的过度表达，p16的丢失及p16的失活均系通过共同途径参与皮肤鳞癌的形成；皮肤 鳞癌发生的分子机制可能涉及该调节通路的障碍。 参考文献
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1 Zhou P, Jiang W, Weghorst CM, et al. Overexpression of cyclin D1 enhances gene amplification. Cancer Res, 1996,56:36～39
2 Sherr CJ. Mammalian G1 cyclins. Cell, 1993,73:1059～1065
3 Gillett C, Fantl V, Bartek J, et al. Amplification and overexpression of cyclin D1 in breast cancer detected by immunohistochemical staining. Cancer Res, 1994,54:1812～1816
4 Motokura T, Bloom T, Kin HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl-linded candidate oncogene. Nature, 1991,350:512～518
, http://www.100md.com
5 Ewen ME, Sluss HK, Hherr CJ, et al. Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins. Cell, 1993,73:487～497
6 Serrano M, Hannon GJ, Beach DA. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D-CDK4. Nature, 1993,366:704～707
7 Kamb A, Gruis NA, Weaver FT, et al. A cell cycle regulator potentially in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436～439
, 百拇医药
8 Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. A deletion of the cyclin-depenldent kinase 4 inhibitor gene in multiple human cancer. Nature, 1994,368:753～756
9 Mori T, Miura K, Aoki T, et al. Frequent somatic muration of the MTS1/CDK4I(multiple tumor suppressor/cyclin-dependent kinase 4 inhibitor) gene in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1994,54:3396～3397
10 Lukas J, Parry D, Aagaard L, et al. Retinoblastoma-protein dependent cell-cycle inhibition by the tumor suppressor p16. Nature, 1995,375:503～506, 百拇医药
单位：陆前进 文海泉 颜兰香 陈森林 刘保安 第二附属医院皮肤科 长沙 410011；卢放根 第二附属医院消化内科 长沙 410011；杨竹林 第二附属医院肝胆研究室 长沙 410011
关键词：皮肤肿瘤；癌；细胞周期；调节因子*；免疫组织化学
湖南医科大学学报990511 提要 采用免疫组化染色检测30例皮肤鳞癌组织细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)，p16及Rb的表达，阳性率依次为66.7%，53.3%，33.3%和36.7%；cyclin D1及CDK4于癌巢边缘细胞表达强于中央癌细胞，且其分化程度越低，阳性着色细胞越多，着色越深。提示细胞周期尤其G1期的正向调节因子的过度表达及负向调节因子的低表达在皮肤鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用。
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中国图书分类号 R730.261
Study on regulators of the cell cycle in cutaneous
squamous cell carcinoma
Lu Qianjin Lu Fanggen Yang Zhulin Wen Haiquan Yan Lanxiang Chen Shenlin Liu Bao-an
(Department of Dermatology, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
In order to investigate the relationship between the regulators of cell cycle and cutaneous squamous cell carcinoma(SCC), we used an immunohistochemical staining technique to examine the expression of cyclin D1, p16 and Rb in the paraffin embeded skin cancer tissues of 30 patients with SCC. The positive percentage of cyclin D1, CDK4, p16 and Rb was 66.7%, 53.3%, 33.3%, and 36.7%, respectively. The overexpression of cyclin D1 and CDK4 could be observed frequently in low grade of differentiated cells, especially in marginal cells of the cancer nest. The results indicate that the aberrant expression of positive and negative regulators of the cell cycle may be involved in the carcinogenesis and evolution of SCC.
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Key words skin neoplasms; carcinoma; cell cycle; regulator*; immunohistochemistry
细胞周期与细胞癌变的关系是近年来生命科学研究中的热门课题之一。研究表明，二者已不再是人们所认为的两个分割的事物。在细胞发生恶性转化过程中，除癌基因/抑癌基因的正负调节失控外，细胞周期中的一些调控因子参与这一过程，特别是G1期相关的各种因子，包括正向调节作用的细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)以及负向调节作用的细胞周期蛋白依赖性抑制因子(cyclin-dependent inhibitor, CDI)如p16和p21等，抑癌基因产物，如p53及Rb等。为探索皮肤鳞状细胞癌(SCC)中某些细胞周期调节因子的状态，本文应用免疫组织化学(组化)方法检测30例SCC组织cyclin D1,CDK4,p16及Rb的表达。
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1 材料与方法
1.1 标本
30例SCC组织取自湖南省肿瘤医院病理科1994年1月～1996年10月的活检标本，其中高分化23例，中分化4例，低分化3例。标本经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。
1.2 试剂
cyclin D1鼠抗人单抗，CDK4兔抗人多抗，p16兔抗人多抗，Rb兔抗人多抗，生物素化羊抗兔IgG，生物素化羊抗鼠IgG，SABC及DAB等试剂均为北京中山生物制剂公司产品。
1.3 方法
采用免疫组化ABC法。石蜡标本切成厚4μm的薄片，用二甲苯脱蜡，不同浓度的酒精水化，3% H2O2甲醇清除内源性过氧化物酶，自来水彻底清洗后再用PBS缓冲液清洗，分别加入一抗cyclin D1，CDK4，p16，Rb(1∶100)及正常羊血清(1∶50)，于4℃过夜；PBS洗片；加生物素化羊抗兔、羊抗鼠IgG,37℃ 30min，PBS洗片；加SABC 37℃ 30min，PBS洗片；加DAB显色剂显色5～10min，自来水冲洗，乙醇固定，凉干；封片，于光学显微镜下观察结果。观察10个高倍视野并计数阳性细胞。以阳性细胞率≥10%定为阳性，<10%为阴性。根据阳性细胞所占面积分为4个等级，“-”无明显阳性细胞；“+”阳性细胞的面积小于25%；“++”阳性细胞面积在25%～75%；“+++”阳性细胞的面 积大于75%。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。
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2 结 果
cyclin D1，CDK4，p16及Rb阳性染色均为棕黄色。cyclin D1和CDK4主要定位于细胞核，少数定位于细胞浆；p16和Rb主要定位于细胞浆，少数定位于细胞核(图1～4)。cyclin D1,CDK4,p16及Rb的阳性病例率依次为66.7%(20/30)，53.3%(16/30)，33.3%(10/30)和36.7%(11/30)。11例呈现Rb阳性表达的肿瘤，其中9例p16为阴性。cyclin D1和CDK4表达于癌巢边缘细胞(++～+++)强于中央癌细胞(+～++)；且癌细胞分化程度越低，cyclin D1及CDK4阳性着色细胞越多，着色越深。在不同分化状态的皮肤鳞状细胞癌中cyclin D1,CDK4,p16及Rb的表达见附表。
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附表 cyclin D1,CDK4,p16及Rb在不同分化的SCC中的表达 SCC分化程度
总例数
阳性例数
cyclin D1
CDK4
p16
Rb
高分化
23
16
11
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8
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中分化
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低分化
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3 讨 论
真核细胞的细胞周期包括S，M两个主要周期和G1，G2两个间隔期。G1期为DNA复制准备期，S期为DNA复制期，G2期为细胞有丝分裂准备期，M期为有丝分裂期。这一细胞周期的完成又依赖于细胞周期中的一系列正/负调节因子的相互作用，使细胞顺利地渡过G1/S，G2/M两个转折点。目前的研究表明，细胞周期中的多种调节因子参与细胞癌变，特别是G1期的D型细胞周期蛋白的过度表达，细胞周期蛋白依赖性抑制因子p16,p15,p21,p27及参与G1期负向调节的抑癌基因产物p53及Rb的表达，皆可导致恶性肿瘤的发生。人类恶性肿瘤中常出现cyclin的异常表达，尤其cyclin D1的过表达[1～4]。体外实验表明，cyclin D1能刺激CDK4介导的Rb磷酸化，使Rb对细胞生长的抑制效应失活[5]。cyclin D1的过度表达，将使CDK4对Rb的调节失常，从而导致细胞失控性生长。CDK4激酶活性同时还受p16的特异性抑制[6]。p16是新近分离出的抑癌基因；在许多肿瘤中发现有该基因的缺失或突变[7，8]。p16机能丧失，同时会导致CDK4对Rb的调节障碍，使Rb处于持久的磷酸化状态。正常的细胞周期活动中，Rb在G1期的失活依赖于p16的表达增高，从而抑制CDK4的活性。故认为Rb阴性肿瘤可能会有较高水平的p16表达，而Rb阳性肿瘤则可能存在p16的表达低下。
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本资料显示皮肤鳞状细胞癌中cyclin D1和CDK4阳性病例率高于p16及Rb阳性病例率，且cyclin D1及CDK4于癌巢边缘细胞表达(++～+++)强于中央癌细胞(+～++)，低分化癌组织表达强于高分化癌组织。此结果说明cyclin D1和CDK4表达与肿瘤本身生物学行为相关。皮肤鳞状细胞癌中p16和Rb阳性病例率低，分析其原因可能由于p16,Rb基因失活或突变，或由于其他因素抑制了p16和Rb的表达。p16,Rb蛋白表达受抑，肿瘤细胞进入生长分裂周期及脱离细胞周期而进入分化状态过程失控，导致细胞恶性转化。本文还发现，在Rb阳性的皮肤鳞癌中，81.8%不表达p16，而在p16阳性的皮肤鳞癌中，90%不表达Rb。这与人们在肺癌和膀胱癌细胞系中所检测到的结果一致。Rb与p16的表达之间的负相关提示二者中任何一个异常都足以使G1期细胞失控性增殖[9，10]。本研究结果表明，cyclin D1与CDK4的过度表达，p16的丢失及p16的失活均系通过共同途径参与皮肤鳞癌的形成；皮肤 鳞癌发生的分子机制可能涉及该调节通路的障碍。 参考文献
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1 Zhou P, Jiang W, Weghorst CM, et al. Overexpression of cyclin D1 enhances gene amplification. Cancer Res, 1996,56:36～39
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3 Gillett C, Fantl V, Bartek J, et al. Amplification and overexpression of cyclin D1 in breast cancer detected by immunohistochemical staining. Cancer Res, 1994,54:1812～1816
4 Motokura T, Bloom T, Kin HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl-linded candidate oncogene. Nature, 1991,350:512～518
, http://www.100md.com
5 Ewen ME, Sluss HK, Hherr CJ, et al. Functional interactions of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins. Cell, 1993,73:487～497
6 Serrano M, Hannon GJ, Beach DA. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D-CDK4. Nature, 1993,366:704～707
7 Kamb A, Gruis NA, Weaver FT, et al. A cell cycle regulator potentially in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436～439
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8 Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. A deletion of the cyclin-depenldent kinase 4 inhibitor gene in multiple human cancer. Nature, 1994,368:753～756
9 Mori T, Miura K, Aoki T, et al. Frequent somatic muration of the MTS1/CDK4I(multiple tumor suppressor/cyclin-dependent kinase 4 inhibitor) gene in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1994,54:3396～3397
10 Lukas J, Parry D, Aagaard L, et al. Retinoblastoma-protein dependent cell-cycle inhibition by the tumor suppressor p16. Nature, 1995,375:503～506, 百拇医药