具有家族背景大肠癌MMR基因表达及细胞增殖活性研究
作者：吴保平 魏晓玲 张亚历 张振书 周殿元
单位：吴保平 张亚历 张振书 周殿元 第一军医大学南方医院消化病研究所，广州，510515；魏晓玲 洛阳高等医学专科学校附属医院内三科，洛阳，471003
关键词：大肠癌；家族背景；错配修复基因；突变表达；细胞增殖
第一军医大学学报990516 摘要：目的 了解具有家族背景大肠癌MMR基因(hMLH1、hMSH2)表达及细胞增殖活性特征。方法 应用免疫组化SP法和流式细胞术(FCM)，对46例大肠癌进行研究。结果 具有家族背景大肠癌组织hMLH1表达阴性率及其切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2表达阴性率明显高于无家族史的散发性大肠癌(P<0.05)。而其PCNA标记指数、DNA异倍体率则显著减低(P<0.01,P<0.05)。结论 具有家族背景大肠癌肿瘤细胞及切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2突变率的增高，其增殖指标有所降低。
, 百拇医药
中图分类号：R735.34
Study on MMR gene expression and proliferation kinetics in colorectal cancer with familial predispositionWu Baoping1，Wei Xiaoling2，Zhang Yali1，Zhang Zhenshu1，Zhou Dianyuan1
1Institute of Digestive Disease Research, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2 3th Medicine Department, Hospital of Luoyang Medical College, Luoyang, 471003Abstract: Objective To evaluate the expression of MMR gene(hMLH1、hMSH2) and proliferation kinetics in colorectal cancer(CRC) with familial predisposition. Methods Forty-six cases of CRC were studied using SP immunohistochemical method and flow cytometry. Results In CRCs with familial predisposition, the incidence of expression negative of hMLH1 in tumor tissue and hMLH1、hMSH2 in the margin mucosa resected was significantly higher than that of sporadic CRC (P<0.05). Its LI of PCNA and heteroploid rate of DNA decreased obviously (P<0.01,P<0.05). Conclusions The rate of hMLH1 and hMSH2 mutation in CRC with familial predisposition increased in tumor and the margin mucosa resected. The proliferation activity of their cancer cell was lower.
, 百拇医药
Key words: colorectal cancer; familial predisposition; mismatch repair gene (MMR gene); mutation expression; proliferation kinetics
具有家族背景大肠癌可能存在较特殊的基因异常，DNA错配修复基因(MMR)突变在遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)的发生发展中起着重要作用[1]。据报道，HNPCC具有低侵袭性表现[2]；其是否反映在细胞增殖活性的改变上，目前尚不清楚。本文对具有家族背景大肠癌MMR基因(hMLH1、hMSH2)的表达及其细胞增殖活性进行探讨。
1 材料和方法
1.1 病例材料 46例中国人大肠癌，经过病历检索、问卷及信访形式的家系调查，将其分为A、B两组。A组为具有家族背景大肠癌26例，男14例，女12例，其中根据Amsterdam标准[3]诊断为HNPCC的有4例；B组为无家族史散发性大肠癌20例，男11例，女9例。每例取存档石蜡包埋组织，分别包括大肠癌组织和“正常”切缘组织。常规病理分析。
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1.2 方法
1.2.1 免疫组化染色及观察 采用免疫组化SP法进行染色。hMLH1、hMSH2 PcAb及PCNA McAb为Santa Cruz产品。计测PCNA标记指数(LI)。
1.2.2 流式细胞术测定DNA倍体及细胞周期 将切片组织制成单细胞悬液。碘化丙啶(Sigma)避光染色后，采用EPICS ELITE型流式细胞仪(美国Coulter公司)进行检测。计算DNA指数(DI)。检测指标为异倍体率、增殖指数(PI)及S期细胞百分数(S%)。DNA倍体的判断标准为DI=0.90～1.10者为二倍体，其余均为非整倍体。
1.2.3 统计学处理 BASE统计程序χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 hMLH1、hMSH2表达阴性与有家族背景大肠癌的关系 SP法对hMLH1、hMSH2表达产物进行检测，有hMLH1、hMSH2突变者不着色，无突变者为细胞浆和(或)细胞核呈棕黄色着染。4例HNPCC中，肿瘤细胞hMLH1阴性2例、hMSH2阴性1例；而其切缘“正常”腺体，hMLH1阴性4例、hMSH2阴性3例。具有家族史大肠癌(A组)肿瘤细胞hMLH1表达阴性率为61.5%，与散发性大肠癌(B组)的30.0%相比差异显著(P<0.05)；A组切缘“正常” 腺体hMLH1和hMSH2表达阴性率为65.4%和61.5%，分别与B组的25.0%和30.0%相比差异显著(P<0.01和P<0.05)(表1)。
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表1 大肠癌hMLH1、hMSH2表达阴性例数
Tab.1 Expression of hMLH1- and hMSH2- in colorectal cancer
HNPCC (n=4)
GroupA (n=26)
GroupB (n=20)
tumor
normal
tumor
normal
tumor
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normal
hMLH1-
2(50.0%)
4
16(61.5%)*
17(65.4%)**
6(30.0%)
5(25.0%)
hMSH2-
1(25.0%)
3(75.0%)
14(53.9%)
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16(61.5%)**
9(45.0%)
6(30.0%)
* P<0.05 vs tumor of Group B; ** P<0.05 vs normal tissue of Group B
2.2 家族背景大肠癌PCNA标记指数检测 对PCNA进行免疫组化染色。HNPCC和具有家族背景大肠癌(A组)PCNA标记指数分别为(0.49±0.09)和(0.54±0.10)，与散发性大肠癌(B组)相比(0.62±0.07)有显著差异(P<0.005)。PCNA标记指数比较见表2。
表2 PCNA标记指数与大肠癌的关系
Tab.2 LI of PCNA in colorectal cancer
, 百拇医药
Group
n
LI (
±s)
HNPCC
4
0.49±0.09*
A
26
0.54±0.10*
B
20
, http://www.100md.com 0.62±0.07
* P<0.005 vs Group B
2.3 DNA倍体及细胞周期与具有家族背景大肠癌的关系 表3所示，HNPCC的异倍体率为25%。具有家族背景大肠癌的异倍体率为23.1%，与散发性大肠癌(55.6%)相比具有显著差异(P<0.05)。
表3 DNA倍体和细胞周期比较
Tab.3 DNA analysis and proliferation kinetics in colorectal cancer
Group
n
heteroploid DNA(%)
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PI (±s)
S% (±s)
HNPCC
4
1(25.0)
14.58±3.12
8.70±1.18
A
26
6(23.1)*
, 百拇医药
17.57±6.51
9.47±2.85
B
18
10(55.6)
17.94±7.51
10.38±3.89
* P<0.05 vs Group B
3 讨论
九十年代初，以Vogelstein为主的研究小组在对HNPCC家族的基因连锁分析中，用PCR克隆出MMR基因hMSH2。之后又发现了与酵母的mutL基因的5'末端相似的hMLH1基因[4]。据报道，HNPCC有36%存在hMLH1的突变，而33%存在hMSH2的突变[2]。DNA错配修复基因家族的作用机制在于：它们可识别DNA序列的错配位点，指导酶系统进行修复，以维持DNA复制的精确性。当它们发生突变失去功能时，引起DNA复制错误(RER)，细胞分裂产生错配位点逐渐增多，表现为遗传的不稳定性，进而导致肿瘤的发生。这些基因的发现具有重要意义：(1)可直接确定家系内的高危人群，即突变基因携带者；(2)由于是胚系突变[5]，检测外周血白细胞的DNA即可发现基因异常，可成为对高危人群诊断的有用工具，具有临床应用前景。Leach等应用抗hMSH2单克隆抗体，发现在结肠肿瘤，整个肿瘤腺体均有hMSH2弥漫性表达[6]。目前认为，hMLH1和hMSH2基因突变，启动子甲基化，使产生一种羧基末端截断突变产物，从而造成hMLH1和hMSH2突变的肿瘤及正常组织表达阴性，无突变的表达阳性[7]。
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本研究发现具有家族背景大肠癌肿瘤细胞hMLH1表达阴性率为61.5%，与散发性大肠癌组的30.0%相比显著增高；具有家族背景大肠癌切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2表达阴性率为65.4%和61.5%，分别与散发性大肠癌切缘“正常”腺体的25.0%和30.0%相比显著增高。结果表明，具有家族背景大肠癌细胞hMLH1突变率及切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2突变率增高。应用石蜡包埋组织进行免疫组化分析错配修复基因改变，在临床上具有实用意义。
研究表明PCNA、DNA异倍体率、增殖指数和S期细胞百分数是评价细胞增殖活性的可靠指标，且对大肠癌患者有预后价值。本研究检测具有家族背景大肠癌的细胞增殖活性，发现在HNPCC和家族背景大肠癌，其DNA异倍体率减低，与散发性大肠癌相比具有统计学意义；其PCNA的LI与散发性大肠癌相比显著降低。提示，具有家族背景大肠癌的细胞增殖指标与散发性大肠癌相比有所减低。国外文献报道，RER阳性肿瘤的转移复发的发生率较散发性大肠癌为低，临床预后较好。对此种低侵袭性，一种解释为基因突变频发，使肿瘤转移复发表型受阻[8]。本研究结果提示，这种预后较好的表型还可能与该组大肠癌的低增殖活性有关。
, 百拇医药
注：军队大肠癌九五指令课题(96Z028)及广东省自然科学基金(980120)
作者简介：吴保平，男，1963年出生；1998年毕业于第一军医大学；硕士副主任医师；电话85141544
参考文献
1 Aaltonen LA, Peltom?ki P, Leach FS et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 1993,260(6):812
2 Lynch HT, Smyrk T. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome). Cancer,1996,78(4):1149
, 百拇医药 3 Vasen HFA, Mecklin JP, Khan PM et al. The international collaborative group on hereditary nonpolyposis colorectal cancer (ICG-HNPCC). Dis Colon Rectum,1991,34(3):424
4 Wijnen J, Khan PM, Vasen H et al. Majority of hMLH1 mutations responsible for hereditary nonpolyposis colorectal cancer at the exonic region 15-16. Am J Hum Genet,1996,58(2):300
5 Leach FS, Nicolaides NC, Papadopoulos N et al. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cell,1993, 75(6):1215
, 百拇医药
6 Leach FS, Polyak K, Burrell M et al. Expression of the human mismatch repair gene hMSH2 in normal and neoplastic tissues. Cancer Res,1996, 56(2):235
7 Kane MF, Loda M, Gaida GM et al. Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 mutation tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines. Cancer Res,1997, 57(5):808
8 Shibata D, Peinado MA, Ionov Y et al. Genomic instability in repeated sequences is an early somatic event in colorectal tumorigenesis that persists after transformation. Nat Genet,1994,6(1):273
(收稿日期：1998-10-29), 百拇医药
单位：吴保平 张亚历 张振书 周殿元 第一军医大学南方医院消化病研究所，广州，510515；魏晓玲 洛阳高等医学专科学校附属医院内三科，洛阳，471003
关键词：大肠癌；家族背景；错配修复基因；突变表达；细胞增殖
第一军医大学学报990516 摘要：目的 了解具有家族背景大肠癌MMR基因(hMLH1、hMSH2)表达及细胞增殖活性特征。方法 应用免疫组化SP法和流式细胞术(FCM)，对46例大肠癌进行研究。结果 具有家族背景大肠癌组织hMLH1表达阴性率及其切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2表达阴性率明显高于无家族史的散发性大肠癌(P<0.05)。而其PCNA标记指数、DNA异倍体率则显著减低(P<0.01,P<0.05)。结论 具有家族背景大肠癌肿瘤细胞及切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2突变率的增高，其增殖指标有所降低。
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中图分类号：R735.34
Study on MMR gene expression and proliferation kinetics in colorectal cancer with familial predispositionWu Baoping1，Wei Xiaoling2，Zhang Yali1，Zhang Zhenshu1，Zhou Dianyuan1
1Institute of Digestive Disease Research, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2 3th Medicine Department, Hospital of Luoyang Medical College, Luoyang, 471003Abstract: Objective To evaluate the expression of MMR gene(hMLH1、hMSH2) and proliferation kinetics in colorectal cancer(CRC) with familial predisposition. Methods Forty-six cases of CRC were studied using SP immunohistochemical method and flow cytometry. Results In CRCs with familial predisposition, the incidence of expression negative of hMLH1 in tumor tissue and hMLH1、hMSH2 in the margin mucosa resected was significantly higher than that of sporadic CRC (P<0.05). Its LI of PCNA and heteroploid rate of DNA decreased obviously (P<0.01,P<0.05). Conclusions The rate of hMLH1 and hMSH2 mutation in CRC with familial predisposition increased in tumor and the margin mucosa resected. The proliferation activity of their cancer cell was lower.
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Key words: colorectal cancer; familial predisposition; mismatch repair gene (MMR gene); mutation expression; proliferation kinetics
具有家族背景大肠癌可能存在较特殊的基因异常，DNA错配修复基因(MMR)突变在遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)的发生发展中起着重要作用[1]。据报道，HNPCC具有低侵袭性表现[2]；其是否反映在细胞增殖活性的改变上，目前尚不清楚。本文对具有家族背景大肠癌MMR基因(hMLH1、hMSH2)的表达及其细胞增殖活性进行探讨。
1 材料和方法
1.1 病例材料 46例中国人大肠癌，经过病历检索、问卷及信访形式的家系调查，将其分为A、B两组。A组为具有家族背景大肠癌26例，男14例，女12例，其中根据Amsterdam标准[3]诊断为HNPCC的有4例；B组为无家族史散发性大肠癌20例，男11例，女9例。每例取存档石蜡包埋组织，分别包括大肠癌组织和“正常”切缘组织。常规病理分析。
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1.2 方法
1.2.1 免疫组化染色及观察 采用免疫组化SP法进行染色。hMLH1、hMSH2 PcAb及PCNA McAb为Santa Cruz产品。计测PCNA标记指数(LI)。
1.2.2 流式细胞术测定DNA倍体及细胞周期 将切片组织制成单细胞悬液。碘化丙啶(Sigma)避光染色后，采用EPICS ELITE型流式细胞仪(美国Coulter公司)进行检测。计算DNA指数(DI)。检测指标为异倍体率、增殖指数(PI)及S期细胞百分数(S%)。DNA倍体的判断标准为DI=0.90～1.10者为二倍体，其余均为非整倍体。
1.2.3 统计学处理 BASE统计程序χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 hMLH1、hMSH2表达阴性与有家族背景大肠癌的关系 SP法对hMLH1、hMSH2表达产物进行检测，有hMLH1、hMSH2突变者不着色，无突变者为细胞浆和(或)细胞核呈棕黄色着染。4例HNPCC中，肿瘤细胞hMLH1阴性2例、hMSH2阴性1例；而其切缘“正常”腺体，hMLH1阴性4例、hMSH2阴性3例。具有家族史大肠癌(A组)肿瘤细胞hMLH1表达阴性率为61.5%，与散发性大肠癌(B组)的30.0%相比差异显著(P<0.05)；A组切缘“正常” 腺体hMLH1和hMSH2表达阴性率为65.4%和61.5%，分别与B组的25.0%和30.0%相比差异显著(P<0.01和P<0.05)(表1)。
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表1 大肠癌hMLH1、hMSH2表达阴性例数
Tab.1 Expression of hMLH1- and hMSH2- in colorectal cancer
HNPCC (n=4)
GroupA (n=26)
GroupB (n=20)
tumor
normal
tumor
normal
tumor
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normal
hMLH1-
2(50.0%)
4
16(61.5%)*
17(65.4%)**
6(30.0%)
5(25.0%)
hMSH2-
1(25.0%)
3(75.0%)
14(53.9%)
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16(61.5%)**
9(45.0%)
6(30.0%)
* P<0.05 vs tumor of Group B; ** P<0.05 vs normal tissue of Group B
2.2 家族背景大肠癌PCNA标记指数检测 对PCNA进行免疫组化染色。HNPCC和具有家族背景大肠癌(A组)PCNA标记指数分别为(0.49±0.09)和(0.54±0.10)，与散发性大肠癌(B组)相比(0.62±0.07)有显著差异(P<0.005)。PCNA标记指数比较见表2。
表2 PCNA标记指数与大肠癌的关系
Tab.2 LI of PCNA in colorectal cancer
, 百拇医药
Group
n
LI (
±s)HNPCC
4
0.49±0.09*
A
26
0.54±0.10*
B
20
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* P<0.005 vs Group B
2.3 DNA倍体及细胞周期与具有家族背景大肠癌的关系 表3所示，HNPCC的异倍体率为25%。具有家族背景大肠癌的异倍体率为23.1%，与散发性大肠癌(55.6%)相比具有显著差异(P<0.05)。
表3 DNA倍体和细胞周期比较
Tab.3 DNA analysis and proliferation kinetics in colorectal cancer
Group
n
heteroploid DNA(%)
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PI (
±s)S% (
±s)HNPCC
4
1(25.0)
14.58±3.12
8.70±1.18
A
26
6(23.1)*
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17.57±6.51
9.47±2.85
B
18
10(55.6)
17.94±7.51
10.38±3.89
* P<0.05 vs Group B
3 讨论
九十年代初，以Vogelstein为主的研究小组在对HNPCC家族的基因连锁分析中，用PCR克隆出MMR基因hMSH2。之后又发现了与酵母的mutL基因的5'末端相似的hMLH1基因[4]。据报道，HNPCC有36%存在hMLH1的突变，而33%存在hMSH2的突变[2]。DNA错配修复基因家族的作用机制在于：它们可识别DNA序列的错配位点，指导酶系统进行修复，以维持DNA复制的精确性。当它们发生突变失去功能时，引起DNA复制错误(RER)，细胞分裂产生错配位点逐渐增多，表现为遗传的不稳定性，进而导致肿瘤的发生。这些基因的发现具有重要意义：(1)可直接确定家系内的高危人群，即突变基因携带者；(2)由于是胚系突变[5]，检测外周血白细胞的DNA即可发现基因异常，可成为对高危人群诊断的有用工具，具有临床应用前景。Leach等应用抗hMSH2单克隆抗体，发现在结肠肿瘤，整个肿瘤腺体均有hMSH2弥漫性表达[6]。目前认为，hMLH1和hMSH2基因突变，启动子甲基化，使产生一种羧基末端截断突变产物，从而造成hMLH1和hMSH2突变的肿瘤及正常组织表达阴性，无突变的表达阳性[7]。
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本研究发现具有家族背景大肠癌肿瘤细胞hMLH1表达阴性率为61.5%，与散发性大肠癌组的30.0%相比显著增高；具有家族背景大肠癌切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2表达阴性率为65.4%和61.5%，分别与散发性大肠癌切缘“正常”腺体的25.0%和30.0%相比显著增高。结果表明，具有家族背景大肠癌细胞hMLH1突变率及切缘“正常”腺体hMLH1和hMSH2突变率增高。应用石蜡包埋组织进行免疫组化分析错配修复基因改变，在临床上具有实用意义。
研究表明PCNA、DNA异倍体率、增殖指数和S期细胞百分数是评价细胞增殖活性的可靠指标，且对大肠癌患者有预后价值。本研究检测具有家族背景大肠癌的细胞增殖活性，发现在HNPCC和家族背景大肠癌，其DNA异倍体率减低，与散发性大肠癌相比具有统计学意义；其PCNA的LI与散发性大肠癌相比显著降低。提示，具有家族背景大肠癌的细胞增殖指标与散发性大肠癌相比有所减低。国外文献报道，RER阳性肿瘤的转移复发的发生率较散发性大肠癌为低，临床预后较好。对此种低侵袭性，一种解释为基因突变频发，使肿瘤转移复发表型受阻[8]。本研究结果提示，这种预后较好的表型还可能与该组大肠癌的低增殖活性有关。
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注：军队大肠癌九五指令课题(96Z028)及广东省自然科学基金(980120)
作者简介：吴保平，男，1963年出生；1998年毕业于第一军医大学；硕士副主任医师；电话85141544
参考文献
1 Aaltonen LA, Peltom?ki P, Leach FS et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science, 1993,260(6):812
2 Lynch HT, Smyrk T. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome). Cancer,1996,78(4):1149
, 百拇医药 3 Vasen HFA, Mecklin JP, Khan PM et al. The international collaborative group on hereditary nonpolyposis colorectal cancer (ICG-HNPCC). Dis Colon Rectum,1991,34(3):424
4 Wijnen J, Khan PM, Vasen H et al. Majority of hMLH1 mutations responsible for hereditary nonpolyposis colorectal cancer at the exonic region 15-16. Am J Hum Genet,1996,58(2):300
5 Leach FS, Nicolaides NC, Papadopoulos N et al. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cell,1993, 75(6):1215
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6 Leach FS, Polyak K, Burrell M et al. Expression of the human mismatch repair gene hMSH2 in normal and neoplastic tissues. Cancer Res,1996, 56(2):235
7 Kane MF, Loda M, Gaida GM et al. Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 mutation tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines. Cancer Res,1997, 57(5):808
8 Shibata D, Peinado MA, Ionov Y et al. Genomic instability in repeated sequences is an early somatic event in colorectal tumorigenesis that persists after transformation. Nat Genet,1994,6(1):273
(收稿日期：1998-10-29), 百拇医药