人腹膜间皮细胞的分离培养
作者：刘宏发 臧 燕 侯凡凡 王 力
单位：第一军医大学南方医院肾内科，广州，510515
关键词：大网膜；人腹膜间皮细胞；分离；培养
第一军医大学学报990515 摘要：目的 体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC)是研究腹膜功能的有用模型，我们为此建立了一种改良消化法，以从人大网膜分离腹膜间皮细胞。方法 用0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2 消化人大网膜组织碎片，细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养；瑞士姬姆萨染色观察细胞形态，计算细胞纯度；免疫组化(ABC法)鉴定细胞。结果 分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状，纯度达95%以上。细胞表面标志鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原阴性，证实分离培养的确是HPMC。结论 胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离HPMC的方法。
, http://www.100md.com
中图分类号：R329.25
Isolation and culture of human peritoneal mesothelial cells
Liu Hongfa , Zang Yan , Hou Fanfan , Wang Li
Department of Nephrology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective In vitro cultured human peritoneal mesothelial cell is a useful model for studying the peritoneal function. A modified digestive method was developed to separate human peritoneal mesothelial cells (HPMC) from human greater omenta (HGO). Methods HGO obtained at surgery were cut into small pieces and digested with 0.2% trypsin-0.02%EDTANa2 for 25 minutes. Cell suspension was passed through a 100 mesh and cultured in RPMI-1640 containing 10% fetal calf serum. Isolated cells were characterized by White-Giemsa staining and immunohistochemical analysis. Results The confluent cells showed a uniform cobblestone-like appearance, with a purity ≥ 95%. Immunohistochemical studies showed positive staining for cytokeratin and vimentin, but negative staining for factor Ⅷ associated antigen and CD45, indicating a pure population of HPMC. Conclusion Trypsin digestion method is a simple and useful protocol for isolation of HPMC.
, 百拇医药
Key words: greater omenta；human peritoneal mesothelial cells；isolation；culture
持续不卧床腹膜透析(CAPD)作为终末期肾功能不全的替代疗法已在世界范围广泛采用。尽管目前技术设备已有很大改进，但CAPD相关性腹膜炎及腹膜纤维化导致超滤功能丧失，仍是多数患者退出CAPD的主要原因[1]。人腹膜间皮细胞(HPMC〕是构成人腹膜最大的细胞群体，具有分泌细胞因子、主动参与腹膜抗菌防御、合成细胞外基质等多种功能，且直接与透析液长时间接触，因此探讨其生理功能及其在CAPD时的改变，对改进透析液生物相容性，预防和减少CAPD相关性腹膜炎及腹膜纤维化的发生，延长腹膜这一生物透析膜的使用寿命有重要的意义。我们实验室自1990年以来率先在国内成功地建立了HPMC培养体系，为体外研究CAPD时腹膜间皮细胞功能改变提供了细胞模型，现将这一分离培养方法介绍如下。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 取材 来源于脑死亡肾移植供者或腹部手术时切除的大网膜。
1.1.2 主要仪器设备 普通离心机、手术剪、镊、培养皿、 50 ml培养瓶、吸管、CO2培养箱、100目不锈钢筛网、50 ml及10 ml尖底离心管、0.22μm滤膜过滤器、倒置相差显微镜、水浴箱、超净台、酒精灯等。
1.1.3 主要试剂 RPMI-1640培养液(按使用说明配制，加入青、链霉素各10万U/L，氢化可的松0.4 mg/L)、新生小牛血清 (FCS)、完全培养液(含10%FCS的RPMI-1640培养液)、磷酸盐缓冲液(PBS)、Hanks液 、细胞消化液(0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2)、免疫组化染色抗体(抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗白细胞CD45抗体、抗第Ⅷ因子相关抗原抗体)。
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1.2 方法
1.2.1 HPMC的分离培养 无菌摘取肾移植供者大网膜，取适量组织置培养皿内，用Hanks液洗涤3次，同时剪除多余脂肪组织，将剩下的透明膜状组织剪成2 mm3大小的块，加入约3倍体积的细胞消化液，吸管吹打混匀后，移入50 ml培养瓶中，置37℃培养箱中消化。消化过程中每5 min振摇数次，共消化25 min，最后5 min停止吹打。在超净台上将100目不锈钢筛网置于培养皿中，小心吸取培养瓶底部较清亮的HPMC细胞溶液，经筛网滤过后，收集于筛网下的培养皿内，同时在培养皿中加入等体积的完全培养液终止消化作用。将滤过的细胞悬液吸入50 ml尖底离心管中，1000 r/min离心10 min。小心自液面从上到下吸弃离心管中的上清液，少量RPMI-1640洗涤离心管底白色的细胞沉淀1次，加入约2 ml完全培养液，吹打溶解细胞沉淀后，吸入另一50 ml培养瓶中，再添加3 ml完全培养液，将培养瓶置37℃ 、5%CO2、湿度饱和的培养箱中培养。在上述离心步骤开始后，立即同时消化瓶内剩余的组织块，方法同上，注意振摇吹打。一般消化3次，每次25 min，可获3瓶HPMC。
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1.2.2 HPMC 的传代培养 消化下的HPMC置37℃、5%CO2、湿度饱和条件下培养24 h后，以等体积的新鲜完全培养液置换瓶内一半体积的陈旧培养液，此后每3天全换液一次。约培养5～8 d后细胞生长融合，开始传代培养。
1.2.3 培养细胞的纯度及鉴定 取次代培养的HPMC涂片，瑞士姬姆萨染色后，置光镜下观察细胞形态，并计算纯度。细胞涂片4℃下经冷丙酮固定5 min后，分别用抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗白细胞CD45抗体、抗第Ⅷ因子相关抗原抗体，行ABC法[2]细胞免疫组化染色。
2 结果与讨论
从大网膜消化下的原代HPMC细胞光镜下呈成串葡萄样，在培养瓶内初呈拉网状生长。融合后的细胞呈多边形，边缘不齐，形成铺路鹅卵石样外观(图1)。瑞士姬姆萨染色后胞浆为淡粉色，中央为深蓝色扁圆形核，细胞计数纯度可达95%以上(图2)。ABC法细胞免疫组化染色分析发现，细胞角蛋白、波形蛋白抗原阳性(图3、4)，第Ⅷ因子相关抗原和白细胞CD45抗原阴性。根据细胞表面抗原标志分析染色结果，可排除成纤维细胞(细胞角蛋白阴性、波形蛋白抗原阳性)、内皮细胞(第Ⅷ因子相关抗原阳性)或白细胞(白细胞CD45抗原阳性)的可能，证实分离培养的是腹膜间皮细胞。
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图1 光镜下细胞呈多边形，形成鹅卵石样外观
Fig.1 Cobblestone-like appearance of the confluent cells under microscope. ×125
图2 瑞士姬姆萨染色后，计算细胞纯度达95%以上
Fig.2 After White Giemsa staining, a cell purification up to 95% was obtained. ×250
图3 细胞免疫组化染色结果，示细胞表面角蛋白抗原阳性
, 百拇医药
Fig.3 Cytoimmunohistochemistry analysis showed a positive staining of cytokeratin. ×400
图4 细胞免疫组化染色结果，示细胞表面波形蛋白抗原阳性
Fig.4 Cytoimmunohistochemistry analysis showed a positive staining of vimentin. ×400
HPMC的分离培养方法较多，可以直接从病人的腹水或腹膜透出液中获取[3]，或采用网膜碎片直接种植法[4]，胶原酶消化组织法[5]等培养。前两种方法费时费力、取材需要量较大但产量及纯度不高，如腹水法需收集大量腹水或腹膜透出液；种植法则尤为费时，细胞融合周期往往长达20 d左右；胶原酶消化法则费用昂贵。本法仅需培养5～8 d即可达细胞融合，且重复性好，取材少，产量高，费用相对低廉，纯度可达95%以上，足够一般的细胞及分子生物学方面的研究之用，因此不失为一种实用性较好的分离培养方法。
, 百拇医药
采用本法分离培养HPMC，需注意以下几点。一是取材要保证新鲜无菌，网膜组织损伤小，取材后最好立即进行消化处理，如一时来不及处理，可将组织浸泡于完全培养液内，置4℃冰箱保存，组织细胞活性可保持约24 h。二是剪切不宜过碎，一般2 mm3左右即可，否则会加重细胞损伤，降低纯度。三是消化时间若超过30 min，细胞活性及纯度都会下降，为保证消化充分同时又尽可能缩短消化时间，需不时振摇、吹打组织碎片。消化完毕后，终止消化应彻底，并注意洗涤所获细胞沉淀。四是为促进原代细胞尽快贴壁生长，预先以一薄层明胶或鼠尾胶溶液处理培养瓶底，效果较好。第一次换液时须加倍小心，动作需轻柔稳妥，忌振摇，以防止刚刚贴壁不久的细胞脱落。间皮细胞需贴壁后才能生长，因此首次换液以半量为宜，以利更多的细胞贴壁生长繁殖。细胞经传代培养后贴壁性能会大大增强。五是实验以取第2～3代细胞为好，传代不宜超过2次，超过3次后会出现细胞老化、形态异常现象，第4～5代增殖活性明显降低，第6代以后细胞则完全失去增殖活力。
我们实验室采用这种方法已成功地完成了多项人类腹膜间皮细胞的功能研究[6～13]，效果良好。
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注：*国家自然科学基金资助课题(39470337)
**侯凡凡 课题负责人
作者简介：刘宏发，男，1967年出生；1992年毕业于第一军医大学；硕士；电话85141888-87120
参考文献
1 Dobbie JW. Pathogenesis of peritoneal fibrotic syndromes (Sclerosing peritonitis) in peritoneal dialysis. Perit Dial Int,1992, 12:14
2 蔡俊杰，朱梅刚，黄新宇.真空负压在免疫组织化学ABC法中的应用.中华病理杂志,1994,23：53
3 Wu YJ, Parker LM, Binder NE et al. The mesothelial keratins:A new family of cytoskeletal protein identified in cultured mesothelial cells and non-keratinizing epithelia. Cell , 1982,31:693
, 百拇医药
4 Stylianou E, Jenner LA ,Davies M. Isolation, culture and charactorization of human peritoneal mesothelial cells. Kidney Int,1990,37:1563
5 Kern PA, Knedler A, Eckel RH. Isolation and culture of microvascular endothelium from human adipose tissue. J Clin Invest,1983,71:1822
6 臧 燕, 侯凡凡, 刘志强等. 细菌毒素对腹膜间皮细胞分泌IL-1的影响. 临床免疫学杂志，1994,4(1):8
7 侯凡凡, 臧 燕, 张 训等. 高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞生长和基质合成的影响.中华内科杂志,1995, 34(5):326
, http://www.100md.com
8 臧 燕 ,侯凡凡, 杨铁城等. 高浓度葡萄糖对人腹膜间皮的损伤及对其增殖的影响.中华肾脏病杂志,1995,11(4):230
9 臧 燕,侯凡凡,张 训等. 细菌毒素和肿瘤坏死因子诱导人腹膜间皮细胞产生白介素-1的实验研究.中华肾脏病杂志,1995, 11(5):258
10 臧 燕,侯凡凡,张 训等. 表皮生长因子对腹膜间皮细胞增殖的影响.中华内科杂志,1996,35(2):92
11 臧 燕, 张 薇, 张 训等. 间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用.中华内科杂志,1998,37(3):158
12 臧 燕, 刘宏发, 侯凡凡等. 表皮生子因子和维生素A对高浓度葡萄糖抑制腹膜间皮细胞增殖和分化的影响. 中华肾脏病杂志,1999, 15(4):214
13 臧 燕, 刘宏发, 侯凡凡等. 细菌毒素对人腹膜间皮细胞受体整合素α3β1分布及细胞骨架的影响.中华肾脏病杂志,1999,15(1):14
(收稿日期：1998-12-11), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院肾内科，广州，510515
关键词：大网膜；人腹膜间皮细胞；分离；培养
第一军医大学学报990515 摘要：目的 体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC)是研究腹膜功能的有用模型，我们为此建立了一种改良消化法，以从人大网膜分离腹膜间皮细胞。方法 用0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2 消化人大网膜组织碎片，细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养；瑞士姬姆萨染色观察细胞形态，计算细胞纯度；免疫组化(ABC法)鉴定细胞。结果 分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状，纯度达95%以上。细胞表面标志鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原阴性，证实分离培养的确是HPMC。结论 胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离HPMC的方法。
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中图分类号：R329.25
Isolation and culture of human peritoneal mesothelial cells
Liu Hongfa , Zang Yan , Hou Fanfan , Wang Li
Department of Nephrology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective In vitro cultured human peritoneal mesothelial cell is a useful model for studying the peritoneal function. A modified digestive method was developed to separate human peritoneal mesothelial cells (HPMC) from human greater omenta (HGO). Methods HGO obtained at surgery were cut into small pieces and digested with 0.2% trypsin-0.02%EDTANa2 for 25 minutes. Cell suspension was passed through a 100 mesh and cultured in RPMI-1640 containing 10% fetal calf serum. Isolated cells were characterized by White-Giemsa staining and immunohistochemical analysis. Results The confluent cells showed a uniform cobblestone-like appearance, with a purity ≥ 95%. Immunohistochemical studies showed positive staining for cytokeratin and vimentin, but negative staining for factor Ⅷ associated antigen and CD45, indicating a pure population of HPMC. Conclusion Trypsin digestion method is a simple and useful protocol for isolation of HPMC.
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Key words: greater omenta；human peritoneal mesothelial cells；isolation；culture
持续不卧床腹膜透析(CAPD)作为终末期肾功能不全的替代疗法已在世界范围广泛采用。尽管目前技术设备已有很大改进，但CAPD相关性腹膜炎及腹膜纤维化导致超滤功能丧失，仍是多数患者退出CAPD的主要原因[1]。人腹膜间皮细胞(HPMC〕是构成人腹膜最大的细胞群体，具有分泌细胞因子、主动参与腹膜抗菌防御、合成细胞外基质等多种功能，且直接与透析液长时间接触，因此探讨其生理功能及其在CAPD时的改变，对改进透析液生物相容性，预防和减少CAPD相关性腹膜炎及腹膜纤维化的发生，延长腹膜这一生物透析膜的使用寿命有重要的意义。我们实验室自1990年以来率先在国内成功地建立了HPMC培养体系，为体外研究CAPD时腹膜间皮细胞功能改变提供了细胞模型，现将这一分离培养方法介绍如下。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 取材 来源于脑死亡肾移植供者或腹部手术时切除的大网膜。
1.1.2 主要仪器设备 普通离心机、手术剪、镊、培养皿、 50 ml培养瓶、吸管、CO2培养箱、100目不锈钢筛网、50 ml及10 ml尖底离心管、0.22μm滤膜过滤器、倒置相差显微镜、水浴箱、超净台、酒精灯等。
1.1.3 主要试剂 RPMI-1640培养液(按使用说明配制，加入青、链霉素各10万U/L，氢化可的松0.4 mg/L)、新生小牛血清 (FCS)、完全培养液(含10%FCS的RPMI-1640培养液)、磷酸盐缓冲液(PBS)、Hanks液 、细胞消化液(0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2)、免疫组化染色抗体(抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗白细胞CD45抗体、抗第Ⅷ因子相关抗原抗体)。
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1.2 方法
1.2.1 HPMC的分离培养 无菌摘取肾移植供者大网膜，取适量组织置培养皿内，用Hanks液洗涤3次，同时剪除多余脂肪组织，将剩下的透明膜状组织剪成2 mm3大小的块，加入约3倍体积的细胞消化液，吸管吹打混匀后，移入50 ml培养瓶中，置37℃培养箱中消化。消化过程中每5 min振摇数次，共消化25 min，最后5 min停止吹打。在超净台上将100目不锈钢筛网置于培养皿中，小心吸取培养瓶底部较清亮的HPMC细胞溶液，经筛网滤过后，收集于筛网下的培养皿内，同时在培养皿中加入等体积的完全培养液终止消化作用。将滤过的细胞悬液吸入50 ml尖底离心管中，1000 r/min离心10 min。小心自液面从上到下吸弃离心管中的上清液，少量RPMI-1640洗涤离心管底白色的细胞沉淀1次，加入约2 ml完全培养液，吹打溶解细胞沉淀后，吸入另一50 ml培养瓶中，再添加3 ml完全培养液，将培养瓶置37℃ 、5%CO2、湿度饱和的培养箱中培养。在上述离心步骤开始后，立即同时消化瓶内剩余的组织块，方法同上，注意振摇吹打。一般消化3次，每次25 min，可获3瓶HPMC。
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1.2.2 HPMC 的传代培养 消化下的HPMC置37℃、5%CO2、湿度饱和条件下培养24 h后，以等体积的新鲜完全培养液置换瓶内一半体积的陈旧培养液，此后每3天全换液一次。约培养5～8 d后细胞生长融合，开始传代培养。
1.2.3 培养细胞的纯度及鉴定 取次代培养的HPMC涂片，瑞士姬姆萨染色后，置光镜下观察细胞形态，并计算纯度。细胞涂片4℃下经冷丙酮固定5 min后，分别用抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗白细胞CD45抗体、抗第Ⅷ因子相关抗原抗体，行ABC法[2]细胞免疫组化染色。
2 结果与讨论
从大网膜消化下的原代HPMC细胞光镜下呈成串葡萄样，在培养瓶内初呈拉网状生长。融合后的细胞呈多边形，边缘不齐，形成铺路鹅卵石样外观(图1)。瑞士姬姆萨染色后胞浆为淡粉色，中央为深蓝色扁圆形核，细胞计数纯度可达95%以上(图2)。ABC法细胞免疫组化染色分析发现，细胞角蛋白、波形蛋白抗原阳性(图3、4)，第Ⅷ因子相关抗原和白细胞CD45抗原阴性。根据细胞表面抗原标志分析染色结果，可排除成纤维细胞(细胞角蛋白阴性、波形蛋白抗原阳性)、内皮细胞(第Ⅷ因子相关抗原阳性)或白细胞(白细胞CD45抗原阳性)的可能，证实分离培养的是腹膜间皮细胞。
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图1 光镜下细胞呈多边形，形成鹅卵石样外观
Fig.1 Cobblestone-like appearance of the confluent cells under microscope. ×125
图2 瑞士姬姆萨染色后，计算细胞纯度达95%以上
Fig.2 After White Giemsa staining, a cell purification up to 95% was obtained. ×250
图3 细胞免疫组化染色结果，示细胞表面角蛋白抗原阳性
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Fig.3 Cytoimmunohistochemistry analysis showed a positive staining of cytokeratin. ×400
图4 细胞免疫组化染色结果，示细胞表面波形蛋白抗原阳性
Fig.4 Cytoimmunohistochemistry analysis showed a positive staining of vimentin. ×400
HPMC的分离培养方法较多，可以直接从病人的腹水或腹膜透出液中获取[3]，或采用网膜碎片直接种植法[4]，胶原酶消化组织法[5]等培养。前两种方法费时费力、取材需要量较大但产量及纯度不高，如腹水法需收集大量腹水或腹膜透出液；种植法则尤为费时，细胞融合周期往往长达20 d左右；胶原酶消化法则费用昂贵。本法仅需培养5～8 d即可达细胞融合，且重复性好，取材少，产量高，费用相对低廉，纯度可达95%以上，足够一般的细胞及分子生物学方面的研究之用，因此不失为一种实用性较好的分离培养方法。
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采用本法分离培养HPMC，需注意以下几点。一是取材要保证新鲜无菌，网膜组织损伤小，取材后最好立即进行消化处理，如一时来不及处理，可将组织浸泡于完全培养液内，置4℃冰箱保存，组织细胞活性可保持约24 h。二是剪切不宜过碎，一般2 mm3左右即可，否则会加重细胞损伤，降低纯度。三是消化时间若超过30 min，细胞活性及纯度都会下降，为保证消化充分同时又尽可能缩短消化时间，需不时振摇、吹打组织碎片。消化完毕后，终止消化应彻底，并注意洗涤所获细胞沉淀。四是为促进原代细胞尽快贴壁生长，预先以一薄层明胶或鼠尾胶溶液处理培养瓶底，效果较好。第一次换液时须加倍小心，动作需轻柔稳妥，忌振摇，以防止刚刚贴壁不久的细胞脱落。间皮细胞需贴壁后才能生长，因此首次换液以半量为宜，以利更多的细胞贴壁生长繁殖。细胞经传代培养后贴壁性能会大大增强。五是实验以取第2～3代细胞为好，传代不宜超过2次，超过3次后会出现细胞老化、形态异常现象，第4～5代增殖活性明显降低，第6代以后细胞则完全失去增殖活力。
我们实验室采用这种方法已成功地完成了多项人类腹膜间皮细胞的功能研究[6～13]，效果良好。
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注：*国家自然科学基金资助课题(39470337)
**侯凡凡 课题负责人
作者简介：刘宏发，男，1967年出生；1992年毕业于第一军医大学；硕士；电话85141888-87120
参考文献
1 Dobbie JW. Pathogenesis of peritoneal fibrotic syndromes (Sclerosing peritonitis) in peritoneal dialysis. Perit Dial Int,1992, 12:14
2 蔡俊杰，朱梅刚，黄新宇.真空负压在免疫组织化学ABC法中的应用.中华病理杂志,1994,23：53
3 Wu YJ, Parker LM, Binder NE et al. The mesothelial keratins:A new family of cytoskeletal protein identified in cultured mesothelial cells and non-keratinizing epithelia. Cell , 1982,31:693
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4 Stylianou E, Jenner LA ,Davies M. Isolation, culture and charactorization of human peritoneal mesothelial cells. Kidney Int,1990,37:1563
5 Kern PA, Knedler A, Eckel RH. Isolation and culture of microvascular endothelium from human adipose tissue. J Clin Invest,1983,71:1822
6 臧 燕, 侯凡凡, 刘志强等. 细菌毒素对腹膜间皮细胞分泌IL-1的影响. 临床免疫学杂志，1994,4(1):8
7 侯凡凡, 臧 燕, 张 训等. 高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞生长和基质合成的影响.中华内科杂志,1995, 34(5):326
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8 臧 燕 ,侯凡凡, 杨铁城等. 高浓度葡萄糖对人腹膜间皮的损伤及对其增殖的影响.中华肾脏病杂志,1995,11(4):230
9 臧 燕,侯凡凡,张 训等. 细菌毒素和肿瘤坏死因子诱导人腹膜间皮细胞产生白介素-1的实验研究.中华肾脏病杂志,1995, 11(5):258
10 臧 燕,侯凡凡,张 训等. 表皮生长因子对腹膜间皮细胞增殖的影响.中华内科杂志,1996,35(2):92
11 臧 燕, 张 薇, 张 训等. 间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用.中华内科杂志,1998,37(3):158
12 臧 燕, 刘宏发, 侯凡凡等. 表皮生子因子和维生素A对高浓度葡萄糖抑制腹膜间皮细胞增殖和分化的影响. 中华肾脏病杂志,1999, 15(4):214
13 臧 燕, 刘宏发, 侯凡凡等. 细菌毒素对人腹膜间皮细胞受体整合素α3β1分布及细胞骨架的影响.中华肾脏病杂志,1999,15(1):14
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