人工反义寡核苷酸对人Ⅰ型胶原基因体外转录体系的抑制作用
作者：单越新 罗超权 徐 钤 利天增
单位：单越新 徐 钤 第一军医大学生化教研室，广州，510515；罗超权 中山医科大学生化教研室；利天增 中山医科大学第一附属医院烧伤科，广州，510089
关键词：Ⅰ型胶原基因；反义寡核苷酸；体外转录
人工反义寡核苷酸对人摘要：目的和方法 过量Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积是增生性瘢痕组织和瘢痕疙瘩形成的重要原因。采用两个自行构建的SP6体外转录系统，通过掺入同位素(α32PGTP)进行放射自显影，探讨不同反义寡核苷酸对Ⅰ型胶原基因体外转录的抑制作用。结果和结论 位于SP6转录起始位点区域的寡核苷酸能够有效抑制体外转录反应；而位于SP6转录起始位点下游约200 bp的寡核苷酸和作为对照的随机寡核苷酸对转录的抑制作用不明显。
中图分类号：Q78
, 百拇医药
Inhibition of human typeⅠcollagen gene in vitro transcription by artificial antisense oligodeoxynucleotide Shan Yuexin1, Luo Chaoquan2, Xu Qian1, Li Tianzheng3
1Department of Biochemistry, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2Department of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, 3 Department of Burn, The First H59ospital Guangzhou 510080 Abstract: Objective It is a very important factor that collagen typeⅠand type Ⅲ accumulates in excessive amount that causes the formation of keloids and hypertrophic scars. Method To understand the mechanism by which antisense oligodeoxynucleotide acts on in vitro transcription of α1(Ⅰ) collagen gene, isotopes(α32PGTP)was incorporated into two SP6 in vitro transcription systems. Results and conclusions Oligo-2 (at the transcription start region) could effectively inhibit in vitro transcription of pGEM3-Col13 and the control (random oligodeoxynucleotides) showed no inhibition. However, oligo-1 (at the transcription start region) obviously inhibited in the in vitro transcription of pGEM3-Col14, while olig-2, which targeted the down stream region (about 200 bp) of promoter, showed no significant inhibition effect.
, 百拇医药
Key words: α1(Ⅰ) collagen gene; antisense oligodeoxynucleotide; in vitro transcription
创伤或烧伤后瘢痕的形成是现代医学的难题之一。研究表明过量Ⅰ型和Ⅲ型胶原的沉积是瘢痕组织和瘢痕疙瘩形成的重要原因。虽然适度的胶原纤维合成对伤口修复是必须的，但当其过度堆积时，会大大影响受损组织的正常功能[1～4]。研究Ⅰ型胶原基因的表达调控，有助于进一步认识由胶原基因表达水平的改变所致的增生性疾患，探讨可能的基因治疗途径。
人工合成的寡核苷酸作为具有潜在治疗价值的新型药物，已广泛用于抑制病毒复制、肿瘤、心血管疾病及哮喘等多种疾病体内、体外基因治疗的研究，并取得了令人鼓舞的成绩。本研究根据Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)基因序列，设计、合成3条寡核苷酸，探讨反义寡核苷酸对pGEM3col13, pGEM3col14两个体外转录体系中α1(Ⅰ) 胶原基因体外转录的抑制作用。为开展利用反义核酸治疗Ⅰ型胶原蛋白过度表达而引起的纤维增生性疾病提供理论和实验依据。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1质粒及菌种 pGEM3-Col13，pGEM3-Col14的构建另文发表。两个质粒分别含人Ⅰ型胶原基因α1(Ⅰ)的不同片段。前者含α1(Ⅰ) 胶原基因的第Ⅱ内含子与第Ⅱ外显子、第Ⅲ外显子拼接处的基因片段，长195 bp；后者含α1(Ⅰ) 胶原基因的部分第Ⅰ内含子至部分第Ⅲ外显子的基因片段，长394 bp。这两个基因片段分别被直接插入到体外表达载体pGEM3zf(+)的SP6和T7两个启动子下游。在SP6和T7两个启动子作用下，可从正、反两方向对靶基因进行体外转录，而不含其它多余的序列。这两种重组质粒用EcoRⅠ(SP6启动子下游的第一个酶切位点)线性化后，在SP6启动子作用下，可作为反义寡核苷酸对α1(Ⅰ)胶原基因体外转录抑制作用的研究体系。
1.2寡核苷酸 寡核苷酸作用位点如图1所示。寡核苷酸序列如下：寡核苷酸1 (5’ATAGAAGCTT-CCGCCTGTCCCAGT3’)；寡核苷酸2 (5’ATAT-AAGCTTCGGCTCAGGTGCGCTGC3’)；对照寡核苷酸3 (5’ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’)。
, http://www.100md.com
图 1 寡核苷酸作用位点示意图
Fig.1 Schematic diagram of the functionary site of Oligo
1.3试剂 各类工具酶除特殊说明均购自宝灵曼公司，同位素α32PGTP购自北京福瑞公司。DEPC(焦碳酸二乙酯)购自Sigma公司。γNTP， RNasin和SP6RNA聚合酶购自Promega公司。实验中所有溶液均用高压灭菌水和RNA研究专用试剂配制。
1.4 器材 实验中所有塑料制品均用0.1%DEPC水浸泡，并高压灭菌。玻璃制品高压灭菌后，于180℃烤箱干烤8 h以上。
1.5 转录模板的线性化及体外转录体系 将质粒pGEM3-Col13，pGEM3-Col14分别用EcoRⅠ线性化后，依下述体外转录系统，将不同的线性化转录模板及相应寡核苷酸加入体外转录反应体系。体外转录反应：线性化模板DNA(100 ng) 2 .0μl，寡核苷酸(10 μmol) 2.0μl ，10×转录缓冲液1.5μl，ATP、CTP、UTP(5 mmol/L)1.5 μl，0.5 mmol/L GTP1.5 μl，RNasin(10 unit)0.5 μl，[α-32P]-GTP1.0 μl，SP6 RNA聚合酶(10 U) 1.0μl，三蒸水(无RNA酶)4.0 μl，总体积15μl，37℃保温20 min。体外转录产物经含7mol/L尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，经放射自显影，观察实验结果。
, 百拇医药
2 结果
图2所示：寡核苷酸2能够有效抑制以pGEM3-Col13为模板的体外转录反应；而作为对照的随机寡核苷酸3则无明显效应。在以pGEM3-Col14为模板的体外转录体系中，寡核苷酸1能够有效抑制转录的进行；而寡核苷酸2和作为对照的随机寡核苷酸3对转录的抑制作用不明显，如图3所示。
图2 反义寡核苷酸对pGEM3-Col13体外转录体系的抑制作用
Fig. 2 Inhibition of in vitro transcription of pGEM3-Col13 by antisense oligodeoxynucleotide
, 百拇医药
1.No Oligo; 2. Control Oligo 3; 3. Oligo2
图3 反义寡核苷酸对pGEM3-Col14体外转录体系的抑制作用
Fig. 3 Inhibition of in vitro transcription of pGEM3-Col14 by antisense oligodeoxynucleotide
1.No Oligo; 2. Control Oligo 3; 3. Oligo 2; 4. Oligo1
3 讨论
, 百拇医药
反义寡核苷酸通过包括干扰DNA复制、转录和转录后的修饰、与mRNA结合阻止翻译等多种作用机制调控靶基因的表达[5]。国外研究表明，培养细胞中Ⅰ型胶原蛋白的生物合成可用反义寡核苷酸特异抑制，但抑制效果差异很大。有研究表明：在体外转录抑制实验中，抑制效率具有浓度依赖性[6]。本研究的两个体外转录系统，反义寡核苷酸均采用10 m mol这一常规有效剂量(我们亦曾采用不同剂量如：2 m mol、5 m mol、10 m mol进行实验，但10 m mol的抑制效果最佳)。在SP6启动子作用下，寡核苷酸2(位于pGEM3-Col13 SP6转录起始点)对 pGEM3-Col13体外转录系统有明显抑制，而对pGEM3-Col14体外转录系统无明显抑制(寡核苷酸2位于pGEM3-Col14 SP6转录起始点下游约200 bp)；寡核苷酸1(位于pGEM3-Col14 SP6转录起始点)对pGEM3-Col14体外转录系统有明显抑制。这一现象可能是由于RNA聚合酶结合于启动子并开始转录后，在下游与转录模板结合的寡核苷酸将不能或很少起到阻止转录的作用。Jamal等[6]1994年在利用寡核苷酸对HIV体外转录抑制作用的研究中曾有类似报道。有关利用反义寡核苷酸调控来源于人胚肺成纤维细胞(HLF细胞)α1(Ⅰ)胶原基因表达的工作另文发表。
, 百拇医药
致谢：本文实验工作在第一军医大学生物化学教研室完成，杨光彩主任及教研室老师给予了诸多帮助，深表谢忱。
作者简介：单越新，女，1965年出生；1998年毕业于中山医科大学；博士，讲师；电话85148356
参考文献
1 Brenner DA. TypeⅠcollagen gene regulation and the molecular pathogenesis of cirrhosis. Am J Physiol,1993,264(3):G589
2 Varga J. Modulation of collagen gene expression and its relation to fibrosis in systemic sclerosis and other fibrotic disorders. Ann Intern Med, 1995, 122(1):60
, 百拇医药
3 Vitto J. Altered steady state ratio of type Ⅰ/Ⅲ procollagen mRNAs collates with selectively increased typeⅠprocollagen biosynthesis incultured keloid fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1985,82(13): 5935
4 Bornstein P. Regulation of collagen gene expression. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1989, 37: 67
5 赵利淦, Leo M.Lee, 周世宁等编著. 反义RNA和DNA. 武汉：武汉大学出版社, 1993. 145～161
6 Jamal T. Inhibition of in vitro transcription by oligodeoxynucleotides. Antisense Res Dev, 1994,4(4): 279
(收稿日期：1998-12-17), 百拇医药
单位：单越新 徐 钤 第一军医大学生化教研室，广州，510515；罗超权 中山医科大学生化教研室；利天增 中山医科大学第一附属医院烧伤科，广州，510089
关键词：Ⅰ型胶原基因；反义寡核苷酸；体外转录
人工反义寡核苷酸对人摘要：目的和方法 过量Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积是增生性瘢痕组织和瘢痕疙瘩形成的重要原因。采用两个自行构建的SP6体外转录系统，通过掺入同位素(α32PGTP)进行放射自显影，探讨不同反义寡核苷酸对Ⅰ型胶原基因体外转录的抑制作用。结果和结论 位于SP6转录起始位点区域的寡核苷酸能够有效抑制体外转录反应；而位于SP6转录起始位点下游约200 bp的寡核苷酸和作为对照的随机寡核苷酸对转录的抑制作用不明显。
中图分类号：Q78
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Inhibition of human typeⅠcollagen gene in vitro transcription by artificial antisense oligodeoxynucleotide Shan Yuexin1, Luo Chaoquan2, Xu Qian1, Li Tianzheng3
1Department of Biochemistry, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2Department of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, 3 Department of Burn, The First H59ospital Guangzhou 510080 Abstract: Objective It is a very important factor that collagen typeⅠand type Ⅲ accumulates in excessive amount that causes the formation of keloids and hypertrophic scars. Method To understand the mechanism by which antisense oligodeoxynucleotide acts on in vitro transcription of α1(Ⅰ) collagen gene, isotopes(α32PGTP)was incorporated into two SP6 in vitro transcription systems. Results and conclusions Oligo-2 (at the transcription start region) could effectively inhibit in vitro transcription of pGEM3-Col13 and the control (random oligodeoxynucleotides) showed no inhibition. However, oligo-1 (at the transcription start region) obviously inhibited in the in vitro transcription of pGEM3-Col14, while olig-2, which targeted the down stream region (about 200 bp) of promoter, showed no significant inhibition effect.
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Key words: α1(Ⅰ) collagen gene; antisense oligodeoxynucleotide; in vitro transcription
创伤或烧伤后瘢痕的形成是现代医学的难题之一。研究表明过量Ⅰ型和Ⅲ型胶原的沉积是瘢痕组织和瘢痕疙瘩形成的重要原因。虽然适度的胶原纤维合成对伤口修复是必须的，但当其过度堆积时，会大大影响受损组织的正常功能[1～4]。研究Ⅰ型胶原基因的表达调控，有助于进一步认识由胶原基因表达水平的改变所致的增生性疾患，探讨可能的基因治疗途径。
人工合成的寡核苷酸作为具有潜在治疗价值的新型药物，已广泛用于抑制病毒复制、肿瘤、心血管疾病及哮喘等多种疾病体内、体外基因治疗的研究，并取得了令人鼓舞的成绩。本研究根据Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)基因序列，设计、合成3条寡核苷酸，探讨反义寡核苷酸对pGEM3col13, pGEM3col14两个体外转录体系中α1(Ⅰ) 胶原基因体外转录的抑制作用。为开展利用反义核酸治疗Ⅰ型胶原蛋白过度表达而引起的纤维增生性疾病提供理论和实验依据。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1质粒及菌种 pGEM3-Col13，pGEM3-Col14的构建另文发表。两个质粒分别含人Ⅰ型胶原基因α1(Ⅰ)的不同片段。前者含α1(Ⅰ) 胶原基因的第Ⅱ内含子与第Ⅱ外显子、第Ⅲ外显子拼接处的基因片段，长195 bp；后者含α1(Ⅰ) 胶原基因的部分第Ⅰ内含子至部分第Ⅲ外显子的基因片段，长394 bp。这两个基因片段分别被直接插入到体外表达载体pGEM3zf(+)的SP6和T7两个启动子下游。在SP6和T7两个启动子作用下，可从正、反两方向对靶基因进行体外转录，而不含其它多余的序列。这两种重组质粒用EcoRⅠ(SP6启动子下游的第一个酶切位点)线性化后，在SP6启动子作用下，可作为反义寡核苷酸对α1(Ⅰ)胶原基因体外转录抑制作用的研究体系。
1.2寡核苷酸 寡核苷酸作用位点如图1所示。寡核苷酸序列如下：寡核苷酸1 (5’ATAGAAGCTT-CCGCCTGTCCCAGT3’)；寡核苷酸2 (5’ATAT-AAGCTTCGGCTCAGGTGCGCTGC3’)；对照寡核苷酸3 (5’ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’)。
, http://www.100md.com
图 1 寡核苷酸作用位点示意图
Fig.1 Schematic diagram of the functionary site of Oligo
1.3试剂 各类工具酶除特殊说明均购自宝灵曼公司，同位素α32PGTP购自北京福瑞公司。DEPC(焦碳酸二乙酯)购自Sigma公司。γNTP， RNasin和SP6RNA聚合酶购自Promega公司。实验中所有溶液均用高压灭菌水和RNA研究专用试剂配制。
1.4 器材 实验中所有塑料制品均用0.1%DEPC水浸泡，并高压灭菌。玻璃制品高压灭菌后，于180℃烤箱干烤8 h以上。
1.5 转录模板的线性化及体外转录体系 将质粒pGEM3-Col13，pGEM3-Col14分别用EcoRⅠ线性化后，依下述体外转录系统，将不同的线性化转录模板及相应寡核苷酸加入体外转录反应体系。体外转录反应：线性化模板DNA(100 ng) 2 .0μl，寡核苷酸(10 μmol) 2.0μl ，10×转录缓冲液1.5μl，ATP、CTP、UTP(5 mmol/L)1.5 μl，0.5 mmol/L GTP1.5 μl，RNasin(10 unit)0.5 μl，[α-32P]-GTP1.0 μl，SP6 RNA聚合酶(10 U) 1.0μl，三蒸水(无RNA酶)4.0 μl，总体积15μl，37℃保温20 min。体外转录产物经含7mol/L尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，经放射自显影，观察实验结果。
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2 结果
图2所示：寡核苷酸2能够有效抑制以pGEM3-Col13为模板的体外转录反应；而作为对照的随机寡核苷酸3则无明显效应。在以pGEM3-Col14为模板的体外转录体系中，寡核苷酸1能够有效抑制转录的进行；而寡核苷酸2和作为对照的随机寡核苷酸3对转录的抑制作用不明显，如图3所示。
图2 反义寡核苷酸对pGEM3-Col13体外转录体系的抑制作用
Fig. 2 Inhibition of in vitro transcription of pGEM3-Col13 by antisense oligodeoxynucleotide
, 百拇医药
1.No Oligo; 2. Control Oligo 3; 3. Oligo2
图3 反义寡核苷酸对pGEM3-Col14体外转录体系的抑制作用
Fig. 3 Inhibition of in vitro transcription of pGEM3-Col14 by antisense oligodeoxynucleotide
1.No Oligo; 2. Control Oligo 3; 3. Oligo 2; 4. Oligo1
3 讨论
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反义寡核苷酸通过包括干扰DNA复制、转录和转录后的修饰、与mRNA结合阻止翻译等多种作用机制调控靶基因的表达[5]。国外研究表明，培养细胞中Ⅰ型胶原蛋白的生物合成可用反义寡核苷酸特异抑制，但抑制效果差异很大。有研究表明：在体外转录抑制实验中，抑制效率具有浓度依赖性[6]。本研究的两个体外转录系统，反义寡核苷酸均采用10 m mol这一常规有效剂量(我们亦曾采用不同剂量如：2 m mol、5 m mol、10 m mol进行实验，但10 m mol的抑制效果最佳)。在SP6启动子作用下，寡核苷酸2(位于pGEM3-Col13 SP6转录起始点)对 pGEM3-Col13体外转录系统有明显抑制，而对pGEM3-Col14体外转录系统无明显抑制(寡核苷酸2位于pGEM3-Col14 SP6转录起始点下游约200 bp)；寡核苷酸1(位于pGEM3-Col14 SP6转录起始点)对pGEM3-Col14体外转录系统有明显抑制。这一现象可能是由于RNA聚合酶结合于启动子并开始转录后，在下游与转录模板结合的寡核苷酸将不能或很少起到阻止转录的作用。Jamal等[6]1994年在利用寡核苷酸对HIV体外转录抑制作用的研究中曾有类似报道。有关利用反义寡核苷酸调控来源于人胚肺成纤维细胞(HLF细胞)α1(Ⅰ)胶原基因表达的工作另文发表。
, 百拇医药
致谢：本文实验工作在第一军医大学生物化学教研室完成，杨光彩主任及教研室老师给予了诸多帮助，深表谢忱。
作者简介：单越新，女，1965年出生；1998年毕业于中山医科大学；博士，讲师；电话85148356
参考文献
1 Brenner DA. TypeⅠcollagen gene regulation and the molecular pathogenesis of cirrhosis. Am J Physiol,1993,264(3):G589
2 Varga J. Modulation of collagen gene expression and its relation to fibrosis in systemic sclerosis and other fibrotic disorders. Ann Intern Med, 1995, 122(1):60
, 百拇医药
3 Vitto J. Altered steady state ratio of type Ⅰ/Ⅲ procollagen mRNAs collates with selectively increased typeⅠprocollagen biosynthesis incultured keloid fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1985,82(13): 5935
4 Bornstein P. Regulation of collagen gene expression. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1989, 37: 67
5 赵利淦, Leo M.Lee, 周世宁等编著. 反义RNA和DNA. 武汉：武汉大学出版社, 1993. 145～161
6 Jamal T. Inhibition of in vitro transcription by oligodeoxynucleotides. Antisense Res Dev, 1994,4(4): 279
(收稿日期：1998-12-17), 百拇医药