5%声振人血白蛋白空气微球蛋白含量测定
作者：单友亮 金伟军 王向东 陈志良 刘伊丽
单位：单友亮 金伟军 王向东 陈志良 第一军医大学南方医院 药学部，广州，510515；刘伊丽 第一军医大学南方医院 心内科，广州，510515
关键词：声振人血白蛋白空气微球；微球蛋白；含量测定
5摘要：采用高效液相凝胶色谱法(GC-HPLC)、醋酸纤维膜电泳和半微量定氮法测定5%声振人血白蛋白空气微球制剂中球壁蛋白的含量。GC-HPLC确证了球壁蛋白主要成分为人血白蛋白；醋酸纤维膜电泳测定空气人血白蛋白微球制剂中人血白蛋白纯度>90%；半微量定氮法测出球壁蛋白含量平均值为3.56%左右，99%正常值范围为2.52%～4.60%。
中图分类号：K927.2
Determination of the protein content of air-filled microsphere from sonicated 5% human albuminShan Youliang1, Jin Weijun1, Wang Xiangdong1, Chen Zhiliang1, Liu Yili2
, http://www.100md.com
1Department of Pharmacy, 2Department of Cardiology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515Abstract: The protein content on wall of the air-filled microsphere from sonicated 5% human albumin was determined by gel column high-performance liquid chromatography, cellulose acetate membrane electrophoresis and semimicro Kjeldahl method. The purity of human albumin in this preparation was larger than 90%. The protein content on the wall was 2.52%-4.60%, and the average was about 3.56 %.
, 百拇医药
Key words: air-filled human albumin microspheres; protein content, microsphere; determination of content
5%声振人血白蛋白空气微球制剂为我院研制成功的一种新型超声造影剂，原料为5%人血白蛋白溶液，声振后形成包裹空气的人血白蛋白微球制剂，其临床效果显著且毒副反应极少。与美国Albunex(Molecular Biosystem.Inc. San Diego.CA)为同类产品。国内外未见对该制品微球蛋白含量的详细实验报道。采用GC-HPLC法检测样品中各组成成分，醋酸纤维膜电泳法测定制剂中人血白蛋白所占比重，半微量定氮法测定样品中微球蛋白含量，并分析实验结果。
1 材料与方法
1.1原料和试剂 5%声振人血白蛋白注射液(不同批号若干)；对照品Albunex (034496)。
, 百拇医药
1.2仪器 Waters510泵；Waters484紫外检测器；Waters810色谱工作站；DYYⅡ8B型稳压稳流电泳仪；DYYⅡ32B型电泳槽；光密度扫描仪；乙酸纤维膜2 cm×8 cm；微量定氮仪；微量进样器。
1.3实验方法
1.3.1高效液相凝胶色谱法(GC-HPLC) 流动相：0.2 mol/L磷酸盐缓冲液pH 7.0+1%异丙醇；高压液相色谱柱：Tsk G3000 SW(7.5 mm ID×60 cm)；流速：0.6 ml/min；室温：20～30 ℃；流速：0.6 ml/ min；柱压力限：500 psi；样品上柱浓度及体积：25μl (4 g/L)，即0.1 mg。仪器校正和检定参照中国药典1995年版二部附录第25页。样品溶液制备：样品为含空气微球，GC-HPLC不可直接加样。但本品可加压可逆破球至溶液澄清，再稀释至蛋白含量约4 g/L。分别取本品(970628)、Albunex (034496)及分离纯化微球(本品静置时为上下两层，上层为白色微球层，下层为淡黄绿色澄明液体。抽去下层液体后，再用超纯水轻柔洗涤，浓缩后即得纯化微球)。按上述测试条件进样测定。
, 百拇医药
1.3.2醋酸纤维膜电泳法 巴比妥缓冲液pH 8.6，离子强度(μ)0.075；直线滴加蛋白含量约5%的样品2～3 μl；电流为0.6 mA/cm宽(总电流量为：每条膜宽×膜条数)；温度15～22℃。样品批号：970615，970628，970707，970812，970912。样品溶液制备：分别将五批样品混匀液(微球混悬液)；加压破坏微球至澄清，混匀取样(破球混匀液)。并取原料人血白蛋白为对照，同时，分离出纯净微球并取部分加压破坏，分别点样与样品作对照。电泳后氨基黑染色，扫描定量分析。
1.3.3半微量定氮法 分别取样品破球混悬液和下清液，按经典半微量定氮法[2]进行测定。用标准酸标定二者的含量X1和X2(以下1为破球混悬液，2为下清液)，由公式Y=0.2114X+1.0045得Y1和Y2，由V(ml)=W/Y计算出V1和V2，再由P(g/瓶)=X×V得P1和P2(Y=溶液每ml的重量，V=每瓶溶液实际体积，W=每瓶溶液净重，P=蛋白总重)。又每瓶中P微球=P1-P2=W1-W2，可推算出P微球。
, 百拇医药
2 结果
2.1 GC-HPLC法 结果如下，图1和图2中，Retaining time为保留时间，Starting time为出峰时间，Ending time为结束时间，% Area为相对面积。
Results of the peak (min)
Peak
Retaining time
Starting time
Ending time
, 百拇医药
% Area
C
8.300
7.733
10.517
7.64
B
11.367
10.533
12.250
2.49
A
13.283
, http://www.100md.com
12.250
15.117
89.87
图1 5%声振人血白蛋白空气微球GC-HPLC结果
Fig.1 GC-HPLC results of air-filled human albumin microspheres
Results of the peak (min)
Peak
, http://www.100md.com Retaining time
Starting time
Ending time
% Area
C
8.300
7.967
9.983
4.44
B
11.267
10.200
, 百拇医药 12.167
1.73
A
13.250
12.433
14.517
93.83
图2 AlbunexGC-HPLC结果
Fig.2 GC-HPLC results of Albunex
图中A为白蛋白峰，B为白蛋白二聚体峰，C为多聚体峰。样品(图 1)与Albunex(图 2)中都仅存A、B、C三峰，分离纯化的微球GC—HPLC结果中组成亦与样品一致，未见其他峰。同时，据多聚体换算公式X=(Y-1.6504)/1.6359,Y为多聚体相对百分比含量，可得样品(970628)、Albunex多聚体含量分别为3.66%、1.71%。均符合《中国药品生物制品规程》中人血白蛋白注射液项下多聚体含量≤5%的规定[1]。
, http://www.100md.com
2.2醋酸纤维膜电泳法(图3、表1) 据单侧检验X95%>X均–1.645S，X99%>X均–2.326S，可得X95%>90.26%，X99%>89.62%。
图3 实验中部分样品醋酸纤维膜电泳图
Fig.3 Cellulose acetate membrane electrophore togram results of partial of samples
A：Raw material，B：the clear amber liquid， C：Microspheres broken by pressure，D：Resuspended microspheres，E：Purificated microspheres
, 百拇医药
表 1 白蛋白纯度(%)
Tab.1 Purity of human albumin(%)
Sample
970615
970628
970707
970812
970912
Mean
Resuspended microspheres
, 百拇医药
90.6
92.9
91.2
92.5
91.8
91.8
0.94
Raw material
97.6
97.6
97.5
97.6
97.7
, 百拇医药
97.6
0.07
Microspheres broken for pressure
96.8
97.1
97.2
97.0
97.2
97.1
0.17
2.3半微量定氮法 实验结果如下(表2)，双侧检验99%范围为P均-2.576S均+2.576S即2.52%
表2 样品蛋白质含量
Tab.2 The portein content of samples
Result
971226
980112
970812
980217
971010
P均
Mean
X1%
, 百拇医药
4.90
4.94
4.91
5.08
4.95
X2%
4.73
4.77
4.74
4.88
4.81
P Microspheres
0.0189
, http://www.100md.com
0.0187
0.018
0.0254
0.0175
P Microspheres %
3.60
3.58
3.60
4.08
2.95
3.56
0.402
, 百拇医药 3 讨论
图1、2可见GC-HPLC法检测样品组成为白蛋白及其多聚体，未见其它峰，说明微球球壁蛋白组成亦为白蛋白与其多聚体，与国外文献报道一致[3]。
醋酸纤维膜电泳法将样品分为白蛋白带和原点样点，又单独将微球电泳后仍驻留于原点样点，提示原点样点即为微球。(初步认为，微球球壁为白蛋白分子及其多聚合体的聚积物——显微镜下可见为微粒状，难以电泳。过0.45 μm超滤膜，可见膜上附着白色微粉样物。)同时，由半微量定氮法测定微球蛋白占整瓶蛋白的2.52%～4.64%，与国外文献报道的2%～5%[4]相符。
由此可知，醋酸纤维膜电泳法中微球混悬液白蛋白纯度较原料降低即因为微球蛋白驻留于原点之故，而加压破坏微球后白蛋白纯度又接近原料水平，可见该微球产生过程为一可逆过程。
注：11463.广东省：“五个一科教兴医工程”重点项目
, 百拇医药
作者简介：单友亮，男，1973年出生；1996年毕业于第二军医大学；药师
参考文献
1 中华人民共和国卫生部生物制品标准化委员会.《中国生物制品规程》一部. 北京：中国人口出版社,1995.220～221
2 中华人民共和国卫生部生物制品标准化委员会.《中国生物制品规程》一部. 北京：中国人口出版社,1995.32～34
3 Barnhart J，Levene H，Villapando E et al. Characteristics of Albunex :Air-filled albumin micropheres for echocardiography contrast enhancement. Inveat Radial, 1990,25(Suppl1):S162
4 Walday P，Tolleshaug H，Gjoen T et al. Biodistributions of air-filled albunex microspheres in rats and pigs. Biochem J,1994,299:437
(收稿日期：1998-11-02), http://www.100md.com
单位：单友亮 金伟军 王向东 陈志良 第一军医大学南方医院 药学部，广州，510515；刘伊丽 第一军医大学南方医院 心内科，广州，510515
关键词：声振人血白蛋白空气微球；微球蛋白；含量测定
5摘要：采用高效液相凝胶色谱法(GC-HPLC)、醋酸纤维膜电泳和半微量定氮法测定5%声振人血白蛋白空气微球制剂中球壁蛋白的含量。GC-HPLC确证了球壁蛋白主要成分为人血白蛋白；醋酸纤维膜电泳测定空气人血白蛋白微球制剂中人血白蛋白纯度>90%；半微量定氮法测出球壁蛋白含量平均值为3.56%左右，99%正常值范围为2.52%～4.60%。
中图分类号：K927.2
Determination of the protein content of air-filled microsphere from sonicated 5% human albuminShan Youliang1, Jin Weijun1, Wang Xiangdong1, Chen Zhiliang1, Liu Yili2
, http://www.100md.com
1Department of Pharmacy, 2Department of Cardiology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515Abstract: The protein content on wall of the air-filled microsphere from sonicated 5% human albumin was determined by gel column high-performance liquid chromatography, cellulose acetate membrane electrophoresis and semimicro Kjeldahl method. The purity of human albumin in this preparation was larger than 90%. The protein content on the wall was 2.52%-4.60%, and the average was about 3.56 %.
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Key words: air-filled human albumin microspheres; protein content, microsphere; determination of content
5%声振人血白蛋白空气微球制剂为我院研制成功的一种新型超声造影剂，原料为5%人血白蛋白溶液，声振后形成包裹空气的人血白蛋白微球制剂，其临床效果显著且毒副反应极少。与美国Albunex(Molecular Biosystem.Inc. San Diego.CA)为同类产品。国内外未见对该制品微球蛋白含量的详细实验报道。采用GC-HPLC法检测样品中各组成成分，醋酸纤维膜电泳法测定制剂中人血白蛋白所占比重，半微量定氮法测定样品中微球蛋白含量，并分析实验结果。
1 材料与方法
1.1原料和试剂 5%声振人血白蛋白注射液(不同批号若干)；对照品Albunex (034496)。
, 百拇医药
1.2仪器 Waters510泵；Waters484紫外检测器；Waters810色谱工作站；DYYⅡ8B型稳压稳流电泳仪；DYYⅡ32B型电泳槽；光密度扫描仪；乙酸纤维膜2 cm×8 cm；微量定氮仪；微量进样器。
1.3实验方法
1.3.1高效液相凝胶色谱法(GC-HPLC) 流动相：0.2 mol/L磷酸盐缓冲液pH 7.0+1%异丙醇；高压液相色谱柱：Tsk G3000 SW(7.5 mm ID×60 cm)；流速：0.6 ml/min；室温：20～30 ℃；流速：0.6 ml/ min；柱压力限：500 psi；样品上柱浓度及体积：25μl (4 g/L)，即0.1 mg。仪器校正和检定参照中国药典1995年版二部附录第25页。样品溶液制备：样品为含空气微球，GC-HPLC不可直接加样。但本品可加压可逆破球至溶液澄清，再稀释至蛋白含量约4 g/L。分别取本品(970628)、Albunex (034496)及分离纯化微球(本品静置时为上下两层，上层为白色微球层，下层为淡黄绿色澄明液体。抽去下层液体后，再用超纯水轻柔洗涤，浓缩后即得纯化微球)。按上述测试条件进样测定。
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1.3.2醋酸纤维膜电泳法 巴比妥缓冲液pH 8.6，离子强度(μ)0.075；直线滴加蛋白含量约5%的样品2～3 μl；电流为0.6 mA/cm宽(总电流量为：每条膜宽×膜条数)；温度15～22℃。样品批号：970615，970628，970707，970812，970912。样品溶液制备：分别将五批样品混匀液(微球混悬液)；加压破坏微球至澄清，混匀取样(破球混匀液)。并取原料人血白蛋白为对照，同时，分离出纯净微球并取部分加压破坏，分别点样与样品作对照。电泳后氨基黑染色，扫描定量分析。
1.3.3半微量定氮法 分别取样品破球混悬液和下清液，按经典半微量定氮法[2]进行测定。用标准酸标定二者的含量X1和X2(以下1为破球混悬液，2为下清液)，由公式Y=0.2114X+1.0045得Y1和Y2，由V(ml)=W/Y计算出V1和V2，再由P(g/瓶)=X×V得P1和P2(Y=溶液每ml的重量，V=每瓶溶液实际体积，W=每瓶溶液净重，P=蛋白总重)。又每瓶中P微球=P1-P2=W1-W2，可推算出P微球。
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2 结果
2.1 GC-HPLC法 结果如下，图1和图2中，Retaining time为保留时间，Starting time为出峰时间，Ending time为结束时间，% Area为相对面积。
Results of the peak (min)
Peak
Retaining time
Starting time
Ending time
, 百拇医药
% Area
C
8.300
7.733
10.517
7.64
B
11.367
10.533
12.250
2.49
A
13.283
, http://www.100md.com
12.250
15.117
89.87
图1 5%声振人血白蛋白空气微球GC-HPLC结果
Fig.1 GC-HPLC results of air-filled human albumin microspheres
Results of the peak (min)
Peak
, http://www.100md.com Retaining time
Starting time
Ending time
% Area
C
8.300
7.967
9.983
4.44
B
11.267
10.200
, 百拇医药 12.167
1.73
A
13.250
12.433
14.517
93.83
图2 AlbunexGC-HPLC结果
Fig.2 GC-HPLC results of Albunex
图中A为白蛋白峰，B为白蛋白二聚体峰，C为多聚体峰。样品(图 1)与Albunex(图 2)中都仅存A、B、C三峰，分离纯化的微球GC—HPLC结果中组成亦与样品一致，未见其他峰。同时，据多聚体换算公式X=(Y-1.6504)/1.6359,Y为多聚体相对百分比含量，可得样品(970628)、Albunex多聚体含量分别为3.66%、1.71%。均符合《中国药品生物制品规程》中人血白蛋白注射液项下多聚体含量≤5%的规定[1]。
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2.2醋酸纤维膜电泳法(图3、表1) 据单侧检验X95%>X均–1.645S，X99%>X均–2.326S，可得X95%>90.26%，X99%>89.62%。
图3 实验中部分样品醋酸纤维膜电泳图
Fig.3 Cellulose acetate membrane electrophore togram results of partial of samples
A：Raw material，B：the clear amber liquid， C：Microspheres broken by pressure，D：Resuspended microspheres，E：Purificated microspheres
, 百拇医药
表 1 白蛋白纯度(%)
Tab.1 Purity of human albumin(%)
Sample
970615
970628
970707
970812
970912
Mean
Resuspended microspheres
, 百拇医药
90.6
92.9
91.2
92.5
91.8
91.8
0.94
Raw material
97.6
97.6
97.5
97.6
97.7
, 百拇医药
97.6
0.07
Microspheres broken for pressure
96.8
97.1
97.2
97.0
97.2
97.1
0.17
2.3半微量定氮法 实验结果如下(表2)，双侧检验99%范围为P均-2.576S
表2 样品蛋白质含量
Tab.2 The portein content of samples
Result
971226
980112
970812
980217
971010
P均
Mean
X1%
, 百拇医药
4.90
4.94
4.91
5.08
4.95
X2%
4.73
4.77
4.74
4.88
4.81
P Microspheres
0.0189
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0.0187
0.018
0.0254
0.0175
P Microspheres %
3.60
3.58
3.60
4.08
2.95
3.56
0.402
, 百拇医药 3 讨论
图1、2可见GC-HPLC法检测样品组成为白蛋白及其多聚体，未见其它峰，说明微球球壁蛋白组成亦为白蛋白与其多聚体，与国外文献报道一致[3]。
醋酸纤维膜电泳法将样品分为白蛋白带和原点样点，又单独将微球电泳后仍驻留于原点样点，提示原点样点即为微球。(初步认为，微球球壁为白蛋白分子及其多聚合体的聚积物——显微镜下可见为微粒状，难以电泳。过0.45 μm超滤膜，可见膜上附着白色微粉样物。)同时，由半微量定氮法测定微球蛋白占整瓶蛋白的2.52%～4.64%，与国外文献报道的2%～5%[4]相符。
由此可知，醋酸纤维膜电泳法中微球混悬液白蛋白纯度较原料降低即因为微球蛋白驻留于原点之故，而加压破坏微球后白蛋白纯度又接近原料水平，可见该微球产生过程为一可逆过程。
注：11463.广东省：“五个一科教兴医工程”重点项目
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作者简介：单友亮，男，1973年出生；1996年毕业于第二军医大学；药师
参考文献
1 中华人民共和国卫生部生物制品标准化委员会.《中国生物制品规程》一部. 北京：中国人口出版社,1995.220～221
2 中华人民共和国卫生部生物制品标准化委员会.《中国生物制品规程》一部. 北京：中国人口出版社,1995.32～34
3 Barnhart J，Levene H，Villapando E et al. Characteristics of Albunex :Air-filled albumin micropheres for echocardiography contrast enhancement. Inveat Radial, 1990,25(Suppl1):S162
4 Walday P，Tolleshaug H，Gjoen T et al. Biodistributions of air-filled albunex microspheres in rats and pigs. Biochem J,1994,299:437
(收稿日期：1998-11-02), http://www.100md.com