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编号:10215515
胰高糖素样肽GLP-1(7-36)NH2对体外培养的新生大鼠胰岛细胞作用的研究
http://www.100md.com 《第一军医大学学报》 1999年第5期
     作者:王毅飞 汪吉仪

    单位:王毅飞 广州军区广州总医院内分泌科,广州,510010;汪吉仪 第一军医大学南方医院内分泌科,广州,510515)

    关键词:GLP-1(7-36)NH2;胰岛细胞;培养;胰岛素;胰高糖素;细胞内游离Ca2+

    胰高糖素样肽GLP摘要:目的与方法 探讨GLP-1(7-36)NH2对培养的新生大鼠胰岛细胞胰岛素和胰高糖素释放的影响,并以Fluo-3为探针,用570型粘附式细胞仪研究GLP-1(7-36)NH2对β细胞内Ca2+的作用。结果 在含11.2 mmol/L葡萄糖的KRBB液中孵育1 h,GLP-1(7-36)NH2在10-11~10-8 mol/L使胰岛细胞胰岛素分泌增加和胰高糖素分泌减少;在10-9 mol/L时,促胰岛素释放作用最大。在含2.8 mmol/L葡萄糖时,GLP-1(7-36)NH2使胰岛素分泌无明显增加,但在含葡萄糖5.6、11.2和16.7 mmol/L时,胰岛素分泌明显增加;在含葡萄糖16.7 mmol/L时,GLP-1(7-36)NH2使胰岛b 细胞内Ca2+升高明显。结论 GLP-1(7-36)NH2具有葡萄糖浓度依赖的促胰岛素释放作用和抑制胰高糖素分泌作用。
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    中图分类号:R335.6

     Effect of glucagon-like peptide-1(7-36)NH2 on cultured neonatal rat pancreatic islet cells Wang Yifei1, Wang Jieyi2

    1Department of Endocrinology, Guangzhou General Hospital of PLA, Guangzhou, 510010; 2Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515 Abstract: Objective and methods To explore the effect of GLP-1(7-36)NH2 on insulin and glucagon release in monolayer cultures of neonatal rat pancreatic islet cells and investigate its action on the cytoplasmic Ca2+ concentration in rat pancreatic b cells using ACAS-570 cytometer with Fluo-3 as a probe. Results GLP-1(7-36)NH2 at 10-11~10-8 mol/L increased insulin secretion and decreased glucagon release in KRBB medium containing 11.2 mmol/L glucose after one hour's culture,and at 10-9 mol/L, the insulin secretion reached peak. In 2.8 mmol/L glucose-KRBB solution, GLP-1(7-36)NH2 had no effect on insulin secretion, but in 5.6 `11.2 and 16.7 mmol/L glucose-KRBB solution, it evoked greater insulin secretion. In the presence of 16.7 mmol/L glucose, GLP-1(7-36)NH2 produced a marked increase in cytoplasmic Ca2+ in b cells. Conclusion GLP-1(7-36)NH2 has an action of stimulating insulin release in a glucose concentration-dependent manner and suppressing glucagon release.
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    Key words: GLP-1(7-36)NH2; pancreatic islet cell; culture;insulin;glucagon; cytoplasmic Ca2+

    GLP-1( Glucagon-like peptide-1)是胰高糖素前体中的一段37肽,由肠道L细胞合成并加工,酶解去掉N端6肽和C端酰胺化后,即生成具有高度活性的GLP-1(7-36)NH2。GLP-1(7-36)NH2在进餐后由肠道释放入血循环,是“肠-胰岛轴”中最重要的调节胰岛素释放的激素。我们采用新生大鼠胰岛细胞单层培养的方法,探讨了GLP-1(7-36)NH2促胰岛素分泌的特点,并以Fluo-3为探针,用570型粘附细胞仪,研究了它对胰岛β细胞内Ca2+的作用。

    1 材料和方法
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    1.1 胰岛细胞培养 按Lambert等[1]和胡远峰等[2]的方法略加改良,出生2~3 d的Wistar大鼠,无菌取出胰腺,Hanks液漂洗,剪碎,加入0.2%胰蛋白酶和2 g/L V型胶原酶(Sigma公司产品),置38℃水浴中反复振荡消化5~8 min,用冰冷的Hanks液终止消化,及时分离消化物,离心收集细胞,加入含15%小牛血清的RPMI-1640培养基(内加丙酮酸纳1 mmol/L、L-谷氨酰胺5 mmol/L、Hepes 2 mmol/L、碳酸氢钠24 mmol/L、青霉素10万U/L、链霉素100 mg/L)。调整细胞浓度,接种于75 mm3细胞培养瓶,置37℃、5%CO2和95%空气的培养箱中培养16 h后,转入24孔培养板中,细胞浓度为1×109个/L,同时取一定量的细胞悬液接种于改良的Petri皿中(记为0 d),培养48 h后,用新配制的碘乙酸2.5 mg/L处理3~5 h,再换不含碘乙酸的培养液继续培养,每两天换培养液1次,培养7 d后,选生长良好的细胞用于实验。
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    1.2 GLP-1(7-36)NH2在不同浓度时作用特点 取培养7 d的同批培养细胞(1×106cells/孔),随机分组,每组6孔;用Hanks液洗涤3次后,加入KRBB液预孵1 h,吸取预孵液,加入含GLP-1(7-36)NH2(Sigma公司产品,浓度分别为10-12、10-11、10-10、10-9 和10-8 mol/L)的KRBB液(含糖11.2 mmol/L)。同时设置对照组。37℃恒温下孵育1 h,留取孵育液,-20℃冻存,待测胰岛素含量和胰高糖素含量(放免试剂盒为海科瑞产品),KRB液含氯化钠129 mmol/L、磷酸二氢钾1.2 mmol/L、氯化钾4.7 mmol/L、氯化钙1.0 mmol/L、硫酸镁1.2 mmol/L、碳酸氢钠24.0 mmol/L、Hepes10.0 mmol/L。在KRB液中加入牛血清白蛋白2 g/L即成为KRBB液。
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    1.3 GLP-1(7-36)NH2在不同葡萄糖浓度时作用特点 将用于实验的细胞随机分组,每组6孔,处理组为含GLP-1(7-36)NH210-10 mol/L的KRBB液,含葡萄糖分别为2.8、5.6、11.2和 16.7 mmol/L,同时设置对照组,孵育及保存方法同上,待测胰岛素含量。

    1.4 胰岛b 细胞内游离Ca2+测定 将接种于Petri皿中培养7 d的胰岛细胞,用KRB液洗涤两次后,加入10 μmol/L Fluo-3-AM(Molecular Prober公司),37℃避光恒温孵育50 min,用KRBB液洗涤3次,再加入800 μl KRBB液,最后用粘附式细胞仪(Adherent Cell Analysis and Sorting Cytometer,ACAS)进行测定。细胞选择根据Yoshimas等[3]和Yada等[4]的方法,直径大于12 μm的细胞多为胰岛细胞, 每次选1~2个细胞[5]。激发光波长为488 nm。确定扫描参数后,开始动态扫描。静息状态下细胞荧光变化稳定后,立即加入终浓度为10-10 mol/L GLP-1(7-36)NH2和16.7 mmol/L葡萄糖的KRBB液,观察GLP-1(7-36)NH2引起的细胞内荧光值 (即荧光强度)的变化。对照组加入终浓度为16.7 mmol/L葡萄糖。
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    1.5 统计学处理 统计分析采用t检验,数据以± s表示。

    2 结果

    2.1 在11.2 mmol/L糖时,不同浓度GLP-1(7-36)NH2对胰岛素和胰高糖素释放的影响(表1) GLP-1(7-36)NH2在10-12 mol/L时,其促胰岛素作用不明显,与对照组相比无显著差异(P>0.05);在10-11-10-8 mol/L时使胰岛素分泌明显增加(P<0.01),同时使胰高糖素分泌减少(P<0.01)。GLP-1(7-36)NH2在10-9 mol/L时促进胰岛素释放作用已最大,继续增加剂量,胰岛素释放并无明显增加,其最佳作用浓度在10-10~10-9 mol/L。
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    表1 在含11.2 mmol/L糖时,GLP-1 ( 7-36 )NH2对胰岛素和胰高糖素释放的影响

    Tab.1 In 11.2 mmol/Lglucose-KRBB solution,effect of GLP-1 ( 7-36 )NH2 on insulin and glucagon release (Mean±SD,n=6)

    GLP-1(7-36)NH2

    (mol/L)

    Insulin

    (μU/106cells)

    Glucagon
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    (pg/106cells)

    Control

    144.44±10.04

    119.35±11.58

    10-12

    152.75±12.91*

    105.8±10.77*

    10-11

    270.62±17.27**

    85.35±9.01**

    10-10
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    572.50±29.86**

    73.6±11.28**

    10-9

    584.52±31.12**

    71.65±9.66**

    10-8

    546.15±27.22**

    67.1±12.21**

    *P>0.05 vs control, **P<0.01 vs control

    2.2 GLP-1(7-36)NH2在不同糖浓度促胰岛素释放作用(表2) 在2.8 mmol/L葡萄糖时,GLP-1(7-36)NH2无明显促胰岛素释放作用(与对照组相比,P>0.05);在5.6、11.2和16.7 mmol/L葡萄糖组,其促进胰岛素释放作用明显加强,并且随着葡萄糖浓度增高,胰岛素释放量也明显增加(与对照组相比,P<0.01)。
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    表2 GLP-1(7-36)NH2在不同糖浓度对胰岛素释放的作用

    Tab.2 At different glucose concentrations, effect of GLP-1(7-36)NH2 on insulin release (Mean±SD, n=6)

    Group

    Insulin(μU/106cells)

    2.8 mmol/L G

    26.80±3.22

    2.8 mmol/L G+GLP-1

    29.51±4.75*
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    5.6 mmol/L G

    59.01±8.52

    5.6 mmol/L G+GLP-1

    96.34±10.48**

    11.2 mmol/L G

    147.25±11.62

    11.2 mmol/L G+GLP-1

    564.53±25.71**

    16.7 mmol/L G

    207.13±12.91

    16.7 mmol/L G+GLP-1
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    772.73±27.89**

    *P>0.05 vs control, **P<0.01 vs control

    2.3 GLP-1(7-36)NH2对胰岛β细胞内Ca2+作用(表3) 与对照组相比,在16.7 mmol/L葡萄糖时,GLP-1(7-36)NH2使β细胞内Ca2+升高明显,细胞内Ca2+荧光强度迅速增高,到达峰值时间明显缩短(P<0.01);最大荧光强度,即峰值明显升高(P<0.01);平均荧光强度明显增强(P<0.01)。

    表3 GLP-1(7-36)NH2对胰岛β细胞内Ca2+作用 (±s)
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     Tab.3 Effect of GLP-1(7-36)NH2 on cytoplasmic Ca2+ in βcells (Mean±SD)

    Cell

    Peak time (sec)

    Peak value(U)

    Average flurecent values(U)

    16.7mmol/L G 10

    260.410±20.112

    2019.62±143.18

, 百拇医药     1674.1±232.3

    16.7mmol/L G+GLP-1 12

    74.152±9.745*

    3158.47±211.49*

    2204.6±335.7*

    *P<0.01 vs control

    3 讨论

    本研究表明,GLP-1(7-36)NH2具有明显促进胰岛素释放作用,在11.2 mmol/L葡萄糖时,10-9 mol/L使胰岛素释放增加最显著,约为对照组的4倍,此剂量在人体也相当于生理剂量[6],继续增加剂量,胰岛素分泌不增加,反而有所减少。这主要是因为GLP-1(7-36)NH2通过胰岛b 细胞膜上特异性受体起作用,浓度过高,其受体已达到饱和,受体数量不能增加,因而其促胰岛素释放作用也不能增强;同时随GLP-1(7-36)NH2浓度增加,也可能出现其受体内移,使细胞膜受体数量减少[7]。在低糖时(2.8 mmol/L),GLP-1(7-36)NH2使胰岛素分泌增加不明显,而在糖浓度较高时,随着葡萄糖浓度增加,其促胰岛素分泌作用增强,说明GLP-1(7-36)NH2的作用依赖于葡萄糖的浓度。目前研究认为GLP-1(7-36)NH2作用于胰岛β细胞上受体之后,使β细胞内cAMP增加[4,8],cAMP作为细胞内信使引起细胞内一系列反应,导致胰岛素释放。而低糖浓度时,β细胞不能产生足量的ATP,ATP/ADP比率降低,导致cAMP生成不足,故GLP-1(7-36)NH2不能使胰岛素分泌增加。
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    因为胰岛α细胞上没有GLP-1(7-36)NH2作用的受体[8],其抑制胰高糖素释放作用可能是通过旁分泌作用实现的,即GLP-1(7-36)NH2使β细胞胰岛素分泌增加,而胰岛素量增加显然会抑制α细胞分泌胰高糖素。同时有作者发现GLP-1(7-36)NH2也能使生长抑素分泌增加[9],这也可能抑制了胰高糖素的释放。

    大量实验已表明,胰岛β细胞内Ca2+浓度升高不仅是胰岛素分泌的启动信号,也反映胰岛素分泌的强度。胰岛β细胞在一定糖浓度时,细胞代谢产生足量的ATP,使细胞内ATP和ATP/ADP比率升高,引起β细胞膜上敏感K+通道关闭,使细胞内K+逐渐升高,导致膜去极化。此时膜上Ca2+通道开放,细胞外Ca2+流入细胞内,引起细胞内Ca2+浓度迅速升高,从而激活胰岛素分泌的效应器,使胰岛素分泌启动。我们的实验表明,在16.7 mmol/L葡萄糖时,GLP-1(7-36)NH2引起β细胞内Ca2+萤光强度明显升高,达峰值时间明显缩短,说明其促胰岛素分泌作用也是通过促进细胞内Ca2+ 浓度升高实现的[10],但它通过何种方式促进细胞内Ca2+ 浓度升高,尚有待于进一步研究。
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    以上结果表明,GLP-1(7-36)NH2是一种具有高度生物活性的多肽,可能对2型糖尿病的发生和治疗具有重要的作用。

    作者简介:王毅飞,男,1967年出生;1997年第一军医大学硕士毕业;电话86662205-53558

    参考文献

    1.Lambert AE, Blondel B, Kanazawa Y et al. Monolayer cell culture of neonatal rat pancreas. Endocrinology,1972,90:239

    2 胡远峰,王煜飞,丁一明等. 人胎胰胰岛细胞单层培养的研究.中华器官移植杂志.1990,11(4):158

    3 Okamoto Y, Ishida H, Taminato T et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes,1992,41(12):1555
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    4 Yada T, Itoh K, Nakata M. Glucagon-like peptide-1(7-36)amide and a rise in cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate increase cytosolic free Ca2+ in rat pancreatic b -cells by enhencing Ca2+ channel activity. Endocrinology,1993,133(4):1685

    5 王毅飞,汪洁仪.葡萄糖引起的胰岛β细胞胰岛素分泌和细胞内游离钙变化. 第一军医大学学报, 1998,18(3):222

    6 Oskov C, Rabenhoj L, Wettergren A et al. Tissue and plasma concentrations of amidated and glycine-extended glucagon-like peptide-1 in humans. Diabetes,1994,43(4): 535
, http://www.100md.com
    7 Fehmann HC, Habener JF. Homologous desensitization of the insulinotropic glucagon-like peptide-1(7-37)receptor on insulinoma (HIT-T15) cells. Endocrinology,1991,128(6):2880

    8 Wheeler MB, Lu M, Dillon JS. Functional expression of the rat glucagon-like peptide-1 receptor, evidence for coupling to both adenylyl cyclase and phospholipase-c. Endocrinology,1993,133(1):57

    9 Fridolf T, Bottcher G, Sundler F et al. GLP-1 and GLP-1(7-36)amdie: influences on basal and stimulated insulin and glucagon secretion in the mouse. Pancreas,1991,6(2): 208

    10 Gembal M, Detimary P, Gilon P et al. Mechanisms by which glucose can control insulin release independently from its action on adenosine triphosphate-sensitive K+ channels in mouse b cells. J Clin Invest,1993,91(3):871

    (收稿日期:1998-11-24), 百拇医药