乳腺癌mdr1基因表达调控的探讨
作者：袁亚维 张积仁 周殿元
单位：作者单位：袁亚维 张积仁 第一军医大学1珠江医院肿瘤科，广州，510282；周殿元 南方医院消化科，广州，510515)
关键词：乳腺癌；肿瘤多药抗性；mdr1基因；基因调控；凋亡机制
乳腺癌mdr1基因表达调控的探讨摘要：目的 探讨肿瘤多药抗性(mdr1)的基因调控及其特异的凋亡机制。方法 在建立的mdr1肿瘤裸鼠的瘤组织中，采用ABC免疫组化法，检测P-170、c-myc、野生型p53、p16、Fas和Bcl-2等蛋白的表达。结果 发现mdr1肿瘤细胞的c-myc表达增强；经抗mdr1-ribozyme部分逆转MDR表型后，mdr1肿瘤细胞的p53表达有所升高。结论 c-myc、p53可能参与了对mdr1基因表达的调控，其中c-myc可能起着激活mdr1基因转录的作用。实验还发现mdr1肿瘤细胞的Fas蛋白缺失、Bcl-2表达升高，提示mdr1肿瘤可能拥有自己特异的凋亡调节机制。
, 百拇医药
中图分类号：R730.231
Study of mdr1 gene modulation in breast cancer
Yuan Yawei1, Zhang Jiren1, Zhou Dianyuan2
1Department of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282;2Department of Gastro-enterology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515 Abstract: Objective To clarify the mechanism of gene regulation and specific apoptosis mechanism in the generation of tumor multidrug resistance phenotype. Methods By ABC immunohistochemical analysis, the expression of several tumor genes (c-myc, p16, wild-type p53, Bcl-2 and Fas) in nude mice bearing MDR tumor (MCF-7/Adr) were detected. Results c-myc-Ag was highly expressed in the MDR tumor cells, and the expression of wild-type p53 was increased a little in the MDR tumor after MDR phenotype was reversed partly by the anti-mdr1-ribozyme. Conclusions c-myc and p53 may play a role in modulating mdr1 gene expression, and c-myc may activate the transcription of mdr1 gene. The MDR is correlated with a loss of surface Fas-protein expression and high expression of Bcl-2-Ag. These results suggest that the MDR tumor may have a specific regulatory mechanism of apoptosis.
, 百拇医药
Key words: breast cancer; tumour MDR; mdr1 gene; gene regulatiom; apoptosis
本实验对某些肿瘤生长相关蛋白与多药抗性基因(mdr1)表达的关系作了初步研究，旨在探讨肿瘤相关基因在mdr1基因表达调控机制中所起的作用，为从基因水平上来逆转肿瘤多药耐药(MDR)提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 抗体与试剂 原癌蛋白(c-myc)-抗体(Ab)、p16-Ab、野生型p53-Ab、Bcl-2-Ab、Fas-Ab和P-170-Ab均作为一抗；ABC试剂盒。
1.1.2 细胞 人乳腺癌细胞株及其耐药株MCF-7/Adr和MCF-7由中国医学科学院肿瘤研究所刘舒仪教授惠赠。 抗mdr1-ribozyme稳定表达的MCF-7/Adr细胞株( MCF-7/Adr/mR )为本小组建立[2]。
, 百拇医药
1.1.3 动物 BALB/c-nu小鼠购自第一军医大学动物中心。
1.2 方法
1.2.1 荷肿瘤裸小鼠模型的建立[3] 将培养至对数增长期的肿瘤细胞(MCF-7、MCF-7/Adr、 MCF-7/Adr/mR)用胰酶消化，吹打成单个悬浮细胞，计数。选择3～4周龄、体质量约10 g 的健康雌鼠，消毒腹部乳房皮肤，于乳腺脂肪垫中注入事先备好的0.1 ml瘤细胞悬液。注射完毕后继续于无特定病原体(specific-pathogen-free，SPF)环境中饲养。大约20 d后，80%成瘤。
1.2.2 瘤组织检查 取荷瘤裸鼠瘤组织进行石蜡包埋，切片，免疫组化ABC法检测各标本的相应蛋白表达。读片时以显微图像分析仪(Quitment 520)测定每张片子的10个场面积D(λ)值，取平均一个场面积D(λ)值进行分析。
, http://www.100md.com
1.2.3 统计学处理 本实验所用的统计学方法是t检验。
2 结果
2.1 三种荷瘤裸鼠(荷MCF-7鼠、荷MCF-7/Adr鼠和荷MCF-7/Adr/mR鼠)瘤组织的P-170表达 荷瘤裸鼠瘤组织P-170免疫组化检测结果(表1)显示，荷MCF-7/Adr鼠瘤组织有明显的P-170表达，而荷MCF-7鼠瘤组织无P-170表达，两者相差明显(P<0.05)。这与肿瘤细胞的多药耐药性一致。荷MCF-7/Adr/mR鼠瘤组织P-170表达与母代细胞MCF-7/Adr相比，有明显降低，说明这种特异地切割mdr1mRNA的ribozyme在体内能较好地抑制P-170的表达。
2.2 凋亡相关蛋白(Fas、Bcl-2)与MDR的关系 以Fas-Ab和Bcl-2-Ab检测三种荷瘤裸鼠瘤组织相应蛋白的表达，表1可见药物敏感瘤组织(MCF-7)的Fas表达明显，Bcl-2几乎不表达；多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr)的Fas不表达，Bcl-2表达明显。而抗mdr1-ribozyme转染的MCF-7/Adr组织，恢复了Fas表达，Bcl-2则不表达。
, 百拇医药
2.3 c-myc与MDR的关系 以c-myc-Ab检测荷瘤裸鼠瘤组织，结果见表1，其中多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr)c-myc表达较药物敏感瘤组织(MCF-7)明显，P<0.05；而抗mdr1-ribozyme的转染对c-myc表达无明显影响，与多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr)相比P>0.05。
2.4 抑癌蛋白(p16、p53)与MDR的关系 以p16-Ab和野生型p53-Ab检测上述荷瘤裸鼠瘤组织相应蛋白的表达，结果见表1，可见野生型p53在抗mdr1-ribozyme转染的多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr/mR)有少许表达，而其他两种瘤组织(MCF-7、MCF-7/Adr)无此种蛋白表达；同时三种瘤组织均无p16表达。
表1 瘤组织各蛋白的表达[D(λ)值/1个场面积]
Tab.1 The expression of proteins associated with cancer (OD value/field area)
, 百拇医药
Protein
Negative control
Positive control
MCF-7
MCF-7/Adr
MCF-7/Adr/mR
P-170
0.001212
0.870982
0.001326
0.81092
0.001363
, 百拇医药
Fas
0.000789
0.765796
0.750423
0.000663
0.500876
Bcl-2
0.000789
0.457621
0.000989
0.418763
0.000997
, 百拇医药
c-myc
0.000117
0.386596
0.099746
0.347462
0.350044
p16
0.000201
0.381031
0.000311
0.000201
0.000278
, 百拇医药
p53
0.000202
0.269813
0.000227
0.000208
0.094127
3 讨论
肿瘤细胞mdr1基因表达调控机制很复杂，至今尚未明了。我们的实验发现原癌基因c-myc在耐药肿瘤细胞中表达升高，而在转录水平以特异性ribozyme阻断mdr1的表达并不影响c-myc的表达。这也许是由于c-myc基因激活了mdr1基因转录启动，而对转录及转录以后则无影响，因此切割mdr1 mRNA并不影响c-myc基因的表达。1996年Prados等[4]在研究中也初步发现，c-myc基因可能参与了肿瘤mdr1表达的调节。近年来，人们非常关注一些抑癌基因与mdr1基因表达的关系。大多数的研究认为，p53蛋白通过一个特殊的p53基因反应元件来调节mdr1基因的表达[5]。
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Fas和Bcl-2抗原是与细胞凋亡密切相关的细胞表面分子，两者对肿瘤药物抗性发生过程中出现抵抗凋亡现象具有重要作用。我们的实验发现，药物敏感肿瘤细胞MCF-7的Fas表达明显，Bcl-2几乎不表达；而它相应的耐药株正好相反。这种除P糖蛋白过度表达以外，其它细胞膜蛋白表达的改变也许反映了MDR表型多样化的一个侧面，并且在其它MDR细胞株也发现有Fas抗原的丢失[6]。因此，提示继发于药物抗性产生之后的Fas系统的改变是一个较为普遍的现象。有人发现一些化疗药物(如doxorubicin)通过Fas/Fas L途径来诱导细胞凋亡[7]。因此我们认为，这种mdr1细胞的Fas丢失也许参与了MDR表型的产生。
我们的实验还发现抗mdr1-ribozyme可提高mdr1细胞Fas的表达，降低Bcl-2，有关它的机制还在进一步研究，但提示抗mdr1-ribozyme也许还可通过调节Fas/Fas L系统，来促进一些药物或细胞因子诱导mdr1肿瘤细胞的凋亡。
, 百拇医药
作者简介：袁亚维，女，1966年出生；1997年博士毕业，副主任医师、副教授；电话85143484
参考文献
1 Benchimol S, Ling V. P-glycoprotein and tumor progression. J Natl Cancer Inst, 1994, 86(11): 814
2 袁亚维，张积仁，周殿元等. Ribozyme基因对人肿瘤细胞株MCF-7/Adr多药抗药性靶向逆转. 中华医学杂志，1997，77：494
3 Ueda K, Clark DP, Chen CJ et al. The human multidrug-resistance (mdr1) gene: cDNA cloning and transcription initiation. J Biol Chem，1987, 262:505
, 百拇医药
4 Prados J, Melgulzo C, Fernandez A et al. Inverse expression of mdr1 and c-myc genes in a rhabdomyosarcoma cell line resistant to actinomycin D. J Pathol，1996, 180(1):85
5 Chin KV, Ueda K, Pastan I et al. Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53. Science, 1992 , 255(5043): 459
6 Zhenzi CA, Rodica S, Marie K et al. Impairment of Fas-antigen expression in adriamycin-resistant but not TNF-resistant MCF7 tumor cells. Int J Cancer，1996, 68:535
7 Friesen C, Herr I, Krammer PH et al. Involvement of the CD95 (APO-1/FAS) receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cells. Nat Med，1996, 2(5): 574
(收稿日期：1998-10-20), 百拇医药
单位：作者单位：袁亚维 张积仁 第一军医大学1珠江医院肿瘤科，广州，510282；周殿元 南方医院消化科，广州，510515)
关键词：乳腺癌；肿瘤多药抗性；mdr1基因；基因调控；凋亡机制
乳腺癌mdr1基因表达调控的探讨摘要：目的 探讨肿瘤多药抗性(mdr1)的基因调控及其特异的凋亡机制。方法 在建立的mdr1肿瘤裸鼠的瘤组织中，采用ABC免疫组化法，检测P-170、c-myc、野生型p53、p16、Fas和Bcl-2等蛋白的表达。结果 发现mdr1肿瘤细胞的c-myc表达增强；经抗mdr1-ribozyme部分逆转MDR表型后，mdr1肿瘤细胞的p53表达有所升高。结论 c-myc、p53可能参与了对mdr1基因表达的调控，其中c-myc可能起着激活mdr1基因转录的作用。实验还发现mdr1肿瘤细胞的Fas蛋白缺失、Bcl-2表达升高，提示mdr1肿瘤可能拥有自己特异的凋亡调节机制。
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中图分类号：R730.231
Study of mdr1 gene modulation in breast cancer
Yuan Yawei1, Zhang Jiren1, Zhou Dianyuan2
1Department of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282;2Department of Gastro-enterology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515 Abstract: Objective To clarify the mechanism of gene regulation and specific apoptosis mechanism in the generation of tumor multidrug resistance phenotype. Methods By ABC immunohistochemical analysis, the expression of several tumor genes (c-myc, p16, wild-type p53, Bcl-2 and Fas) in nude mice bearing MDR tumor (MCF-7/Adr) were detected. Results c-myc-Ag was highly expressed in the MDR tumor cells, and the expression of wild-type p53 was increased a little in the MDR tumor after MDR phenotype was reversed partly by the anti-mdr1-ribozyme. Conclusions c-myc and p53 may play a role in modulating mdr1 gene expression, and c-myc may activate the transcription of mdr1 gene. The MDR is correlated with a loss of surface Fas-protein expression and high expression of Bcl-2-Ag. These results suggest that the MDR tumor may have a specific regulatory mechanism of apoptosis.
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Key words: breast cancer; tumour MDR; mdr1 gene; gene regulatiom; apoptosis
本实验对某些肿瘤生长相关蛋白与多药抗性基因(mdr1)表达的关系作了初步研究，旨在探讨肿瘤相关基因在mdr1基因表达调控机制中所起的作用，为从基因水平上来逆转肿瘤多药耐药(MDR)提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 抗体与试剂 原癌蛋白(c-myc)-抗体(Ab)、p16-Ab、野生型p53-Ab、Bcl-2-Ab、Fas-Ab和P-170-Ab均作为一抗；ABC试剂盒。
1.1.2 细胞 人乳腺癌细胞株及其耐药株MCF-7/Adr和MCF-7由中国医学科学院肿瘤研究所刘舒仪教授惠赠。 抗mdr1-ribozyme稳定表达的MCF-7/Adr细胞株( MCF-7/Adr/mR )为本小组建立[2]。
, 百拇医药
1.1.3 动物 BALB/c-nu小鼠购自第一军医大学动物中心。
1.2 方法
1.2.1 荷肿瘤裸小鼠模型的建立[3] 将培养至对数增长期的肿瘤细胞(MCF-7、MCF-7/Adr、 MCF-7/Adr/mR)用胰酶消化，吹打成单个悬浮细胞，计数。选择3～4周龄、体质量约10 g 的健康雌鼠，消毒腹部乳房皮肤，于乳腺脂肪垫中注入事先备好的0.1 ml瘤细胞悬液。注射完毕后继续于无特定病原体(specific-pathogen-free，SPF)环境中饲养。大约20 d后，80%成瘤。
1.2.2 瘤组织检查 取荷瘤裸鼠瘤组织进行石蜡包埋，切片，免疫组化ABC法检测各标本的相应蛋白表达。读片时以显微图像分析仪(Quitment 520)测定每张片子的10个场面积D(λ)值，取平均一个场面积D(λ)值进行分析。
, http://www.100md.com
1.2.3 统计学处理 本实验所用的统计学方法是t检验。
2 结果
2.1 三种荷瘤裸鼠(荷MCF-7鼠、荷MCF-7/Adr鼠和荷MCF-7/Adr/mR鼠)瘤组织的P-170表达 荷瘤裸鼠瘤组织P-170免疫组化检测结果(表1)显示，荷MCF-7/Adr鼠瘤组织有明显的P-170表达，而荷MCF-7鼠瘤组织无P-170表达，两者相差明显(P<0.05)。这与肿瘤细胞的多药耐药性一致。荷MCF-7/Adr/mR鼠瘤组织P-170表达与母代细胞MCF-7/Adr相比，有明显降低，说明这种特异地切割mdr1mRNA的ribozyme在体内能较好地抑制P-170的表达。
2.2 凋亡相关蛋白(Fas、Bcl-2)与MDR的关系 以Fas-Ab和Bcl-2-Ab检测三种荷瘤裸鼠瘤组织相应蛋白的表达，表1可见药物敏感瘤组织(MCF-7)的Fas表达明显，Bcl-2几乎不表达；多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr)的Fas不表达，Bcl-2表达明显。而抗mdr1-ribozyme转染的MCF-7/Adr组织，恢复了Fas表达，Bcl-2则不表达。
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2.3 c-myc与MDR的关系 以c-myc-Ab检测荷瘤裸鼠瘤组织，结果见表1，其中多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr)c-myc表达较药物敏感瘤组织(MCF-7)明显，P<0.05；而抗mdr1-ribozyme的转染对c-myc表达无明显影响，与多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr)相比P>0.05。
2.4 抑癌蛋白(p16、p53)与MDR的关系 以p16-Ab和野生型p53-Ab检测上述荷瘤裸鼠瘤组织相应蛋白的表达，结果见表1，可见野生型p53在抗mdr1-ribozyme转染的多药耐药瘤组织(MCF-7/Adr/mR)有少许表达，而其他两种瘤组织(MCF-7、MCF-7/Adr)无此种蛋白表达；同时三种瘤组织均无p16表达。
表1 瘤组织各蛋白的表达[D(λ)值/1个场面积]
Tab.1 The expression of proteins associated with cancer (OD value/field area)
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Protein
Negative control
Positive control
MCF-7
MCF-7/Adr
MCF-7/Adr/mR
P-170
0.001212
0.870982
0.001326
0.81092
0.001363
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Fas
0.000789
0.765796
0.750423
0.000663
0.500876
Bcl-2
0.000789
0.457621
0.000989
0.418763
0.000997
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c-myc
0.000117
0.386596
0.099746
0.347462
0.350044
p16
0.000201
0.381031
0.000311
0.000201
0.000278
, 百拇医药
p53
0.000202
0.269813
0.000227
0.000208
0.094127
3 讨论
肿瘤细胞mdr1基因表达调控机制很复杂，至今尚未明了。我们的实验发现原癌基因c-myc在耐药肿瘤细胞中表达升高，而在转录水平以特异性ribozyme阻断mdr1的表达并不影响c-myc的表达。这也许是由于c-myc基因激活了mdr1基因转录启动，而对转录及转录以后则无影响，因此切割mdr1 mRNA并不影响c-myc基因的表达。1996年Prados等[4]在研究中也初步发现，c-myc基因可能参与了肿瘤mdr1表达的调节。近年来，人们非常关注一些抑癌基因与mdr1基因表达的关系。大多数的研究认为，p53蛋白通过一个特殊的p53基因反应元件来调节mdr1基因的表达[5]。
, http://www.100md.com
Fas和Bcl-2抗原是与细胞凋亡密切相关的细胞表面分子，两者对肿瘤药物抗性发生过程中出现抵抗凋亡现象具有重要作用。我们的实验发现，药物敏感肿瘤细胞MCF-7的Fas表达明显，Bcl-2几乎不表达；而它相应的耐药株正好相反。这种除P糖蛋白过度表达以外，其它细胞膜蛋白表达的改变也许反映了MDR表型多样化的一个侧面，并且在其它MDR细胞株也发现有Fas抗原的丢失[6]。因此，提示继发于药物抗性产生之后的Fas系统的改变是一个较为普遍的现象。有人发现一些化疗药物(如doxorubicin)通过Fas/Fas L途径来诱导细胞凋亡[7]。因此我们认为，这种mdr1细胞的Fas丢失也许参与了MDR表型的产生。
我们的实验还发现抗mdr1-ribozyme可提高mdr1细胞Fas的表达，降低Bcl-2，有关它的机制还在进一步研究，但提示抗mdr1-ribozyme也许还可通过调节Fas/Fas L系统，来促进一些药物或细胞因子诱导mdr1肿瘤细胞的凋亡。
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作者简介：袁亚维，女，1966年出生；1997年博士毕业，副主任医师、副教授；电话85143484
参考文献
1 Benchimol S, Ling V. P-glycoprotein and tumor progression. J Natl Cancer Inst, 1994, 86(11): 814
2 袁亚维，张积仁，周殿元等. Ribozyme基因对人肿瘤细胞株MCF-7/Adr多药抗药性靶向逆转. 中华医学杂志，1997，77：494
3 Ueda K, Clark DP, Chen CJ et al. The human multidrug-resistance (mdr1) gene: cDNA cloning and transcription initiation. J Biol Chem，1987, 262:505
, 百拇医药
4 Prados J, Melgulzo C, Fernandez A et al. Inverse expression of mdr1 and c-myc genes in a rhabdomyosarcoma cell line resistant to actinomycin D. J Pathol，1996, 180(1):85
5 Chin KV, Ueda K, Pastan I et al. Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53. Science, 1992 , 255(5043): 459
6 Zhenzi CA, Rodica S, Marie K et al. Impairment of Fas-antigen expression in adriamycin-resistant but not TNF-resistant MCF7 tumor cells. Int J Cancer，1996, 68:535
7 Friesen C, Herr I, Krammer PH et al. Involvement of the CD95 (APO-1/FAS) receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cells. Nat Med，1996, 2(5): 574
(收稿日期：1998-10-20), 百拇医药