海带对双歧杆菌促生长作用的研究
作者：张桂兰 程薇莉 何嫱 宗鲜 赵美林 张媛 丁茗敏 赵瑛 毕洪玲
单位：张桂兰 程薇莉 何嫱 宗鲜 赵美林 张媛 丁茗敏 赵瑛 济南军区第一疗养院 青岛 266071；毕洪玲 济南军区青岛警备区门诊部 青岛 266071
关键词：海带；双歧杆菌；增殖
海带对双歧杆菌促生长作用的研究 摘 要 探讨海带对双歧杆菌生长的促进作用。选用海带以平板打洞法、试管法对青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌进行了体外生长促进实验。结果发现，两种双歧杆菌在含有海带汁洞口周围，菌苔生长均较为茂盛；随着离洞口的距离渐近，菌苔逐渐增厚；随着海带汁浓度的增加，菌苔茂盛程度增加，活菌数亦增多；在海带培养基中，双歧杆菌增殖12小时基本达到稳定期，与对照管比较，增殖速度快而稳定。结果表明海带对双歧杆菌增殖有稳定的促进作用。
双歧杆菌(Bifidobacterium)是定植于人类或某些哺乳动物肠道内重要的生理性细菌。该菌营养要求高，需要外源性生长因子即双歧杆菌促生长因子(bifidus factor，BF)。目前已报道的BF中，主要是寡聚糖及糖基化类物质[1]。本文旨在探讨海带对双歧杆菌生长的促进作用。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器 721分光光度计(上海分析仪器厂)、超净工作台(济南空气净化消毒设备厂)、厌氧培养罐(北京新明生物医学技术研究所)、Olympus双目显微镜(日本)、磨浆机(江苏丹徒县新生机械厂)。
1.1.2 菌株及培养基 实验所用菌株婴儿双歧杆菌(B.infantis)，由中国预防医学中心流行病微生物研究所提供；青春双歧杆菌(B.adolescentis)，由大连市卫生防疫站提供。均经中国科学院微生物研究所正式鉴定确认。培养基采用BS肉汤和平板，本室自行配制[2]。
1.1.3 菌液 将上述菌株复活后，分别取3个～4个纯菌落各接种于4ml～5ml BS肉汤中，置厌氧罐内，用气体发生袋法[2]进行厌氧培养，经35℃ 48小时培养后，用生理盐水洗三次(每次2500转/分×5min)，按10倍梯度稀释，采用文献报道滴注法[3]，定量其菌液浓度为106CFU/ml备用。
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1.1.4 海带汁 新鲜海带购自青岛集市。将海带洗净切成细丝，称取重量，按每100克海带加入100ml水的比例加足蒸馏水，然后置磨浆机内打碎分离出海带汁，再用双层纱布过滤后为海带原汁，此浓度为100%。再将部分海带原汁用BS肉汤稀释成50%、25%、12.5%、6.25%系列浓度，分装后经12磅15分钟高压灭菌备用。
1.2 实验方法
1.2.1 平板打洞法 用无菌棉拭沾取106CFU/ml的菌液涂布接种于新鲜配制的BS琼脂表面，重复三次，每次旋转平皿约60度，使菌液均匀分布，盖好平皿。放置2分钟左右，待平板表面水分吸收后，用外径6mm的灭菌铜管于平板上打4个洞，并取出洞内培养基(各孔距24mm)，孔距平皿边缘15mm)。然后于不同孔内分别加入上述不同浓度海带汁0.05ml，同时另设一对照孔，内加等量BS液体培养基。每种浓度做3孔。经35℃厌氧培养48小时后，观察细菌生长情况，同时涂片，革兰染色，镜检。
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1.2.2 试管法 取含有6.25%、12.5%、25%、50%的海带汁肉汤管及海带原汁管各3支，每管总量为5ml。分别于各管内加入106CFU/ml的菌液0.1ml，同时设等量BS肉汤管做对照。于35℃进行厌氧培养。在不同培养时间，分别取出各管培养物10微升，经无菌生理盐水稀释，采用滴注法[3]接种至BS固体培养基上，经35℃厌氧培养48小时后，计算出每毫升培养液中的活菌数。各种浓度3管的均数为最后的结果数据。
2 结 果
2.1 平板打洞法结果 经35℃厌氧培养48小时后发现，在含有海带汁洞口周围，菌苔生长较对照孔茂盛；随着海带浓度的增加，茂盛程度逐渐增加；随着离洞口的距离渐近，菌苔逐渐增厚。青春双歧杆菌优于婴儿双歧杆菌。菌苔呈灰白色，涂片染色镜检，菌体染色特性典型且粗大。
2.2 试管法结果详见表1。试验结果表明，随着海带汁浓度的增高，双歧杆菌活菌数逐渐增多。在海带培养基中，双歧杆菌增殖12小时基本达到稳定期。而对照管需经12小时左右的迟缓期才能进入对数生长期，即使进入对数生长期，其增殖速度也明显偏低。
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表1 海带浓度对双歧杆菌增殖作用的影响
时间 (小时)
不同浓度海带汁(%)中双歧杆菌活菌数(log10n/ml)
6.25
12.5
50
100
对照
青春双歧
婴儿双歧
青春双歧
婴儿双歧
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青春双歧
婴儿双歧
青春双歧
婴儿双歧
青春双歧
婴儿双歧
0
5.01
5.01
5.01
5.01
5.01
5.01
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5.01
5.01
5.01
5.01
4
6.66
6.50
7.75
7.07
8.88
8.75
9.97
9.81
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5.98
5.86
8
8.66
8.65
9.95
9.37
10.37
10.18
11.98
11.87
6.66
6.50
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12
10.56
10.49
11.49
10.16
12.36
12.22
13.08
13.01
8.95
8.65
16
10.86
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10.52
11.52
11.38
12.56
12.40
13.48
13.41
9.88
9.77
20
11.48
11.41
12.06
, 百拇医药
12.00
13.38
13.18
13.92
13.84
10.92
10.68
24
10.98
10.89
11.92
11.65
12.98
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12.76
13.32
13.01
10.67
10.41
48
10.58
10.36
11.02
10.98
11.86
11.52
12.98
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12.26
9.66
9.64
3 讨 论
双歧杆菌促生长因子是能促进双歧杆菌生长繁殖的一大类天然及合成物质，近年来也称之为生化药物。BF通过促进双歧杆菌生长繁殖，来提高人体免疫力；使肠道内pH值下降；抑制肠道有害菌生长；产生B族维生素；分解致癌物质，促进肠蠕动，增强蛋白质吸收等。BF的重要作用还在于直接服用后，可刺激和促进人体肠道内固有的双歧杆菌生长繁殖[1]。因此，近年来随着微生态学理论的发展，BF的研究生产受到国内外学者的普遍关注。目前我国BF的研究开发刚起步，尚未形成规模化大生产。在这方面日本已取得了较大效益。
从目前已报道的BF研究结果分析，BF主要由以下几类物质所组成：纯寡聚糖类物质、蛋白质水解产物及一些蛋白质类物质、多糖类物质、短链脂肪酸类物质、天然植物及中草药的提取物等。其中寡聚糖及糖基化类物质是研究开发的重点内容[1]。
, 百拇医药
海带(laminaria japonica Aresch)，别名叫江白菜(旅大)[4]，属于海藻类褐藻门，为多细胞植物，含有多种营养成分，具有多种保健功能。目前国内外从海带中发现和提取有关抗肿瘤、防治心血管病、抗放射性病、抗老年性痴呆、止血、代血浆等有效成分屡见报告。但对双歧杆菌促生长作用的研究，尚未见系统报道。本文采用了平板打洞法和试管法进行了定性和定量实验，结果发现两种双歧杆菌在含有海带汁洞口周围，菌苔生长均较为茂盛；随着离洞口的距离渐近，菌苔逐渐增厚；随着海带汁浓度的增加，菌苔茂盛程度增加，双歧杆菌活菌数亦增多；在海带培养基中，双歧杆菌增殖12小时基本达到稳定期，与对照管比较，增殖速度快而稳定。实验还发现，在同一条件下，菌苔厚度和活菌数，青春双歧杆菌均略优于婴儿双歧杆菌，说明后者较前者生长所需营养要求更高。实验结果表明，海带对双歧杆菌增殖有稳定的促进作用。
海带富含双歧因子。据分析，约含褐藻酸24.3%，粗蛋白5.97%～8.20%，甘露醇11.13%～17.67%，钾4.36%，碘0.34%。每百克干品约含胡萝卜素0.57毫克，维生素B10.69毫克，维生素B20.36毫克，烟酸1.6毫克，脂肪0.1克，醣57克，钙2.25克，铁0.15克。还含维生素C，脯氨酸，褐氨酸，多聚酸和镁、钠、锌、锰、铜等微量元素[4]。其中蛋白质、无机盐、有机酸、维生素等许多成分是细菌生长必须的营养；胡罗卜素和微量元素对双歧杆菌的新陈代谢有促进作用[5]。铁、镁、锌、钙、锰等离子是双歧杆菌酶的激活剂，这些金属离子对双歧杆菌生长起关键作用[6]。
, 百拇医药
醣是海带的主要成分，广泛存在于该植物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一。在实验中，海带含有的糖成分可能起双歧因子的作用，从而有效促进双歧杆菌增殖。此有待分离提取研究证实。
我国海域辽阔，海藻资源丰富，本研究将为进一步发掘和利用开辟一条新途径。
参考文献
1 杜昱光，蒋寒青等.双歧杆菌促生长因子的研究，中国微生态学杂志.1996；8(6)：50
2 张桂兰，吴力克等.腹泻老年人肠菌群的微生态学研究.中国微生态学杂志.1994；6(5)：27
3 康白编著.正常菌群与健康--人体微生态学.1989
4 中国人民解放军后勤部卫生部.上海医药工业研究院编.中国药用海洋生物.上海人民出版社，1977
5 康白著.微生态学原理.大连出版社，1996
6 Tochikura T,et al.Agric Biol chem,1986;50(9):2279
(收稿日期：1999-03-09), 百拇医药
单位：张桂兰 程薇莉 何嫱 宗鲜 赵美林 张媛 丁茗敏 赵瑛 济南军区第一疗养院 青岛 266071；毕洪玲 济南军区青岛警备区门诊部 青岛 266071
关键词：海带；双歧杆菌；增殖
海带对双歧杆菌促生长作用的研究 摘 要 探讨海带对双歧杆菌生长的促进作用。选用海带以平板打洞法、试管法对青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌进行了体外生长促进实验。结果发现，两种双歧杆菌在含有海带汁洞口周围，菌苔生长均较为茂盛；随着离洞口的距离渐近，菌苔逐渐增厚；随着海带汁浓度的增加，菌苔茂盛程度增加，活菌数亦增多；在海带培养基中，双歧杆菌增殖12小时基本达到稳定期，与对照管比较，增殖速度快而稳定。结果表明海带对双歧杆菌增殖有稳定的促进作用。
双歧杆菌(Bifidobacterium)是定植于人类或某些哺乳动物肠道内重要的生理性细菌。该菌营养要求高，需要外源性生长因子即双歧杆菌促生长因子(bifidus factor，BF)。目前已报道的BF中，主要是寡聚糖及糖基化类物质[1]。本文旨在探讨海带对双歧杆菌生长的促进作用。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器 721分光光度计(上海分析仪器厂)、超净工作台(济南空气净化消毒设备厂)、厌氧培养罐(北京新明生物医学技术研究所)、Olympus双目显微镜(日本)、磨浆机(江苏丹徒县新生机械厂)。
1.1.2 菌株及培养基 实验所用菌株婴儿双歧杆菌(B.infantis)，由中国预防医学中心流行病微生物研究所提供；青春双歧杆菌(B.adolescentis)，由大连市卫生防疫站提供。均经中国科学院微生物研究所正式鉴定确认。培养基采用BS肉汤和平板，本室自行配制[2]。
1.1.3 菌液 将上述菌株复活后，分别取3个～4个纯菌落各接种于4ml～5ml BS肉汤中，置厌氧罐内，用气体发生袋法[2]进行厌氧培养，经35℃ 48小时培养后，用生理盐水洗三次(每次2500转/分×5min)，按10倍梯度稀释，采用文献报道滴注法[3]，定量其菌液浓度为106CFU/ml备用。
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1.1.4 海带汁 新鲜海带购自青岛集市。将海带洗净切成细丝，称取重量，按每100克海带加入100ml水的比例加足蒸馏水，然后置磨浆机内打碎分离出海带汁，再用双层纱布过滤后为海带原汁，此浓度为100%。再将部分海带原汁用BS肉汤稀释成50%、25%、12.5%、6.25%系列浓度，分装后经12磅15分钟高压灭菌备用。
1.2 实验方法
1.2.1 平板打洞法 用无菌棉拭沾取106CFU/ml的菌液涂布接种于新鲜配制的BS琼脂表面，重复三次，每次旋转平皿约60度，使菌液均匀分布，盖好平皿。放置2分钟左右，待平板表面水分吸收后，用外径6mm的灭菌铜管于平板上打4个洞，并取出洞内培养基(各孔距24mm)，孔距平皿边缘15mm)。然后于不同孔内分别加入上述不同浓度海带汁0.05ml，同时另设一对照孔，内加等量BS液体培养基。每种浓度做3孔。经35℃厌氧培养48小时后，观察细菌生长情况，同时涂片，革兰染色，镜检。
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1.2.2 试管法 取含有6.25%、12.5%、25%、50%的海带汁肉汤管及海带原汁管各3支，每管总量为5ml。分别于各管内加入106CFU/ml的菌液0.1ml，同时设等量BS肉汤管做对照。于35℃进行厌氧培养。在不同培养时间，分别取出各管培养物10微升，经无菌生理盐水稀释，采用滴注法[3]接种至BS固体培养基上，经35℃厌氧培养48小时后，计算出每毫升培养液中的活菌数。各种浓度3管的均数为最后的结果数据。
2 结 果
2.1 平板打洞法结果 经35℃厌氧培养48小时后发现，在含有海带汁洞口周围，菌苔生长较对照孔茂盛；随着海带浓度的增加，茂盛程度逐渐增加；随着离洞口的距离渐近，菌苔逐渐增厚。青春双歧杆菌优于婴儿双歧杆菌。菌苔呈灰白色，涂片染色镜检，菌体染色特性典型且粗大。
2.2 试管法结果详见表1。试验结果表明，随着海带汁浓度的增高，双歧杆菌活菌数逐渐增多。在海带培养基中，双歧杆菌增殖12小时基本达到稳定期。而对照管需经12小时左右的迟缓期才能进入对数生长期，即使进入对数生长期，其增殖速度也明显偏低。
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表1 海带浓度对双歧杆菌增殖作用的影响
时间 (小时)
不同浓度海带汁(%)中双歧杆菌活菌数(log10n/ml)
6.25
12.5
50
100
对照
青春双歧
婴儿双歧
青春双歧
婴儿双歧
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青春双歧
婴儿双歧
青春双歧
婴儿双歧
青春双歧
婴儿双歧
0
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5.01
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4
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8.88
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10.37
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12.56
12.40
13.48
13.41
9.88
9.77
20
11.48
11.41
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12.00
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13.18
13.92
13.84
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13.32
13.01
10.67
10.41
48
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10.36
11.02
10.98
11.86
11.52
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12.26
9.66
9.64
3 讨 论
双歧杆菌促生长因子是能促进双歧杆菌生长繁殖的一大类天然及合成物质，近年来也称之为生化药物。BF通过促进双歧杆菌生长繁殖，来提高人体免疫力；使肠道内pH值下降；抑制肠道有害菌生长；产生B族维生素；分解致癌物质，促进肠蠕动，增强蛋白质吸收等。BF的重要作用还在于直接服用后，可刺激和促进人体肠道内固有的双歧杆菌生长繁殖[1]。因此，近年来随着微生态学理论的发展，BF的研究生产受到国内外学者的普遍关注。目前我国BF的研究开发刚起步，尚未形成规模化大生产。在这方面日本已取得了较大效益。
从目前已报道的BF研究结果分析，BF主要由以下几类物质所组成：纯寡聚糖类物质、蛋白质水解产物及一些蛋白质类物质、多糖类物质、短链脂肪酸类物质、天然植物及中草药的提取物等。其中寡聚糖及糖基化类物质是研究开发的重点内容[1]。
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海带(laminaria japonica Aresch)，别名叫江白菜(旅大)[4]，属于海藻类褐藻门，为多细胞植物，含有多种营养成分，具有多种保健功能。目前国内外从海带中发现和提取有关抗肿瘤、防治心血管病、抗放射性病、抗老年性痴呆、止血、代血浆等有效成分屡见报告。但对双歧杆菌促生长作用的研究，尚未见系统报道。本文采用了平板打洞法和试管法进行了定性和定量实验，结果发现两种双歧杆菌在含有海带汁洞口周围，菌苔生长均较为茂盛；随着离洞口的距离渐近，菌苔逐渐增厚；随着海带汁浓度的增加，菌苔茂盛程度增加，双歧杆菌活菌数亦增多；在海带培养基中，双歧杆菌增殖12小时基本达到稳定期，与对照管比较，增殖速度快而稳定。实验还发现，在同一条件下，菌苔厚度和活菌数，青春双歧杆菌均略优于婴儿双歧杆菌，说明后者较前者生长所需营养要求更高。实验结果表明，海带对双歧杆菌增殖有稳定的促进作用。
海带富含双歧因子。据分析，约含褐藻酸24.3%，粗蛋白5.97%～8.20%，甘露醇11.13%～17.67%，钾4.36%，碘0.34%。每百克干品约含胡萝卜素0.57毫克，维生素B10.69毫克，维生素B20.36毫克，烟酸1.6毫克，脂肪0.1克，醣57克，钙2.25克，铁0.15克。还含维生素C，脯氨酸，褐氨酸，多聚酸和镁、钠、锌、锰、铜等微量元素[4]。其中蛋白质、无机盐、有机酸、维生素等许多成分是细菌生长必须的营养；胡罗卜素和微量元素对双歧杆菌的新陈代谢有促进作用[5]。铁、镁、锌、钙、锰等离子是双歧杆菌酶的激活剂，这些金属离子对双歧杆菌生长起关键作用[6]。
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醣是海带的主要成分，广泛存在于该植物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一。在实验中，海带含有的糖成分可能起双歧因子的作用，从而有效促进双歧杆菌增殖。此有待分离提取研究证实。
我国海域辽阔，海藻资源丰富，本研究将为进一步发掘和利用开辟一条新途径。
参考文献
1 杜昱光，蒋寒青等.双歧杆菌促生长因子的研究，中国微生态学杂志.1996；8(6)：50
2 张桂兰，吴力克等.腹泻老年人肠菌群的微生态学研究.中国微生态学杂志.1994；6(5)：27
3 康白编著.正常菌群与健康--人体微生态学.1989
4 中国人民解放军后勤部卫生部.上海医药工业研究院编.中国药用海洋生物.上海人民出版社，1977
5 康白著.微生态学原理.大连出版社，1996
6 Tochikura T,et al.Agric Biol chem,1986;50(9):2279
(收稿日期：1999-03-09), 百拇医药
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