中国北方人PAH基因外显子6，12的突变研究
作者：李红杰 张学 金春元 孙开来
单位：中国医科大学基础医学院遗传学教研室，沈阳 110001
关键词：苯丙酮尿症；苯丙氨酸羟化酶；聚合酶链反应；变性梯度凝胶电泳
中国医科990505 摘要 目的：检测中国北方人中苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子6，12中的突变。方法：应用聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)及直接测序方法，检测突变。结果：中国北方人34例PKU患者外周血DNA中鉴定PAH基因外显子6，12中的3种突变：Y204C，Q232Q和R413P，其频率分别为5.9%(4/68)，4.4%(3/68)，5.9%(4/68)。结论：本实验提示Q232Q可能为中国北方人中较常见的一种新突变，并可能为协助苯丙酮尿症的诊断提供方便手段。同时证实了DGGE法不仅是一种高效快速的突变检测技术，而且作为一种鉴定已知点突变及通过连锁分析进行产前诊断的简便策略，有更广阔的应用前景。
, http://www.100md.com
Studies on Mutation in Exon 6 and 12 of PAH Gene in Northern Chinese
Li Hongjie, Zhang Xue, Jin Chunyuan, et al
Department of Medical Genetics, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective:This study was to detect the mutation in exon 6 and 12 of PHA gene in Northern Chinese. Methods：We used polymerase chain reaction-denaturing gradiet gel electrophoresis and DNA direct sequencing to detect mutations. Results:We identified 3 mutations in exon 6 and 12 of PAH gene: Y204C, Q232Q and R413P, and their frequencies were 5.9%(4/68), 4.4%(3/68) and 5.9%(4/68), respectively. Conclusion:The previous researchers indicated that Y204C and R413P were the common mutations, but Q232Q may be a novel mutation in Northern Chinese, and may be a convinent way to be used as an aid to the diagnosis of phenylketonuria. We also confirm that DGGE is not only an efficient method of detecting mutations, but can also be used as a simple method for identification of known point mutations and prenatal diagnosis through linkage analysis.
, 百拇医药
KEY WORDS phenylketonuria; phenylalane hydroxylase; polymerase chain reaction; denatuing gradient gel electrophoresis
苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是一种常见的常染色体隐性遗传代谢性疾病。中国人群中发病率1/16 500，临床表现主要为高苯丙氨酸血症和智力低下。目前研究表明，其分子基础主要为肝脏的苯丙氨酸羟化酶(phenylalane hydroxylase, PAH)基因突变所致酶活性降低或丧失，从而使其底物及继发代谢产物蓄积。尽管人们对其发病机制研究较早，但由于诸多研究证实了苯丙酮尿症是一种高度遗传异质性疾病：等位基因突变种类众多且突变种类存在群体差异，这使得在各种人群中的深入研究成为必需。同时，经典型PKU与非经典型和其它原因如四氢喋呤合成障碍所致的高苯丙氨酸血症的发病机制不同，治疗方案亦不同，所以在治疗前精确的分子诊断有时也是必不可少的。而建立PAH基因突变型和疾病表型之间的关系对选择最佳方案也有指导作用。随着研究的深入使人们对传统的治疗方案——低苯丙氨酸饮食治疗提出质疑，许多研究表明即使较早进行治疗的PKU患者中仍不可避免地出现智力低下，这使得寻找新的治疗方案、进行产前诊断及携带者诊断具有重要意义。而上述问题的解决是以PAH基因突变的研究为前提的，它对了解苯丙酮尿症的发病机理、明确基因型与表型的关系[1]、开展基因诊断与治疗、以及研究基因起源[2]均有重要意义。
, 百拇医药
本实验采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)法，对34例中国北方人PKU患者的PAH基因突变的相对热点区外显子6，12进行突变检测，并对可疑突变进行测序。
1 材料与方法
1.1 标本来源及DNA提取
34例患者外周血由第二临床学院儿科生化遗传室提供(患儿父母均来自辽宁省、吉林省、黑龙江省、河北省或天津市的北方人)，经临床及实验室检查诊断为经典型PKU，4例正常人由第一临床学院内科采血室提供。采用常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，-20℃保存。
1.2 PCR引物
根据文献报道[3]由上海细胞生物学研究所合成PAH基因外显子6和12、用于DGGE的带有GC-clamp的引物，引物位于两侧的内含子序列内，扩增片段分别为370 bp和232 bp。
, 百拇医药
引物序列如下：6F：5′[GC]CCGACTCCCTCTGCTAACCT-3′；6R：5′-CAATCCTCCCCCAACT-
TTCT-3′；12F：5′-ATGCCACTGAGAACTCTCT-
T-3′；12R：5′[GC]-GATTACTGAGAAAGTGGC-
CT-3′；[GC]=CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCG-
TCCCGCCGCCCCCGCCCG。
1.3 PCR扩增
PCR扩增主要试剂购自北京泰克金生物技术公司。反应总体积为50μl。反应混合物94℃ 7 min变性后，以94℃ 1min、52℃ 1min、72℃ 1min循环40次，最后72℃延伸10min。
, 百拇医药
1.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
用BIO-RAD公司生产的D GeneTM System进行电泳，制备6%聚丙烯酰胺/TAE凝胶，变性梯度范围20%～80%(100%变性为7 mol/L尿素和40%甲酰胺)。取20 μl PCR产物及示踪剂的混合物上样，150 V，60℃，6.0 h电泳后凝胶经0.4 μg/ml溴化乙锭染色，于紫外灯下观察并拍照。
1.5 测序
1.5.1 PCR产物纯化：
对经DGGE分析疑有突变者再进行目的片段的PCR扩增，取50μl PCR产物于1.5%低熔点琼脂糖凝胶上分离回收后，用Promega公司生产的WizardTMPCR Preps DNA Purification System纯化。
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1.5.2 测序反应及突变分析：
外显子6采用DGGE所用的未加GC-clamp的反向引物经PE公司生产的ABI PRISM 310型全自动遗传分析仪进行荧光素末端测序及突变分析。
外显子12采用DGGE所用的未加GC-clamp的正向引物进行PCR产物双链循环测序。测序选用Promega公司的fmolTMDNA测序试剂盒，γ-32P-ATP(37 kBq/μl)由北京亚辉生物医学工程公司提供。
2 结果
2.1 DGGE结果
应用本文所提及的引物对34例PKU患者进行PCR-DGGE的部分结果(见图1)。其中有泳动变位及多个带型者为突变，其余PKU患者DNA的PCR产物电泳未见异常。
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图1 部分PAH基因外显子6的PCR-DGGE结果
P1-P6为PKU患者，N为正常人,其中P1和P6为携有外显子6突变的患者
2.2 测序结果
外显子6经反向引物进行自动测序结果(见图2，3)。因为我们采用反向引物进行测序反应，所以测序链为反意义链。参照Simon C.M于1985年测定的PAH cDNA序列[4]，证实外显子6的两种突变Y204C[TAT(Tys204)→TGT(Cys)]和Q232Q[CAA(Gln232)→CAG(Gln)]。
图2 Y204C突变箭头所示处为突变所在
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图3 Q232Q突变箭头所示处为突变所在
外显子12经正向引物进行手工测序的结果(见图4)。突变经测序证实了R413P[CGC(Arg413)→CCC(Pro)]。
图4 R413P突变
3 讨论
苯丙酮尿症是一种常见的遗传性疾病。截止1997年2月，国际PAH基因研究协作组报道了28个国家的研究结果，于7 000多条突变染色体上发现了316种突变。突变遍及PAH基因的13个外显子、部分外显子—内含子交界区及5′非翻译区，其中以外显子7、6、11、12为相对的突变热点区。PAH基因的研究在白种人中较为详尽，但在中国人中尚不全面。目前在中国人中已发现PAH基因突变近30种，尚有20%的突变尚未鉴定。目前研究发现即使大多数早期进行饮食治疗的PKU患者，其智力水平也较预期低，部分患儿出现心理或精神症状[5]，而且饮食治疗的费用大多数中国家庭难以负担。因此，PKU的基因诊断，尤其是产前诊断防止PKU的患儿出生是目前在中国能广泛接受的首要方法。近年来，在此研究领域我室已开展了大量工作，先后应用PCR-SSCP[6]，STR，ddF[7]等方法相互结合进行突变分析及基因诊断。
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本研究在PAH的相对突变热点区6、12鉴定了PAH基因的3种突变：Y204C，Q232Q和R413P，频率分别为5.9%(4/68)，4.4%(3/68)和5.9%(4/68)。1991年Wang T等首次在中国人中发现Y204C和R413P突变，后经统计资料表明二者为中国北方人中较常见突变，频率分别为13%和13.8%[8]。他们通过体外表达实验证实Y204C对酶活性无影响，而R413P突变体的酶活性仅为正常的3%，甚至更少。本研究证实了二者为中国北方人中较常见突变的结论，但突变频率略有差异，可能是由于样本选择偏倚所致。Q232Q为本研究首次在中国人群中报道，但Kalaydjieve L等于1991年在德国人、法国人及土耳其人几组高加索人群中有报道[9]。他们证实了这种CAA-CAG的碱基转换可产生一Ddel的限制性酶切位点且通过PCR即可检查，因此这种突变在PKU产前诊断中作为标记可提供一定的信息。他们同时也证实了在所研究的人群中此突变与单倍型3，4连锁，所以其诊断性应用与靶人群的单倍型分布有密切关系。目前，PAH基因内含子3中的(TCTA)n多态已作为快速简便的产前诊断方法得到广泛应用，但在中国人群中其杂合度为70%[10]，尚有一部分患儿需其它辅助手段进行产前诊断。本研究结果提示Q232Q可能为中国北方人中一种较常见的新突变，而且中国人中80%为单倍型4，所以此突变可能成为协助中国人PKU基因诊断的一种方便手段。同时作者认为结合外显子7常见的多态V245V，这种多态分析方法与STR相结合可能提高苯丙酮尿病的产前诊断。
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本实验采用的DGGE法可检测DNA分子的任何一种单碱基的替代，包括转换和颠换。1983年Fischer和Lerman建立的DGGE不断改进，主要是GC-clamp和异源双链方法的应用使突变检出率由50%提高至99%甚至更高。GC-clamp是在一侧引物的5′端加一个30～40 bp的GC结构，在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的序列处于低熔点区便于分析。在实际工作中，又发现突变样本中混有正常组织时形成的异源双链确保了突变的高检出率，于是又将变性梯度凝胶电泳的PCR过程加以改正，增添了一个异源双链形成的过程。每种碱基替代对某一DNA片段熔解性质的影响是特异性的，所以结合同源和异源双链带，每个突变带型呈“指纹样”，从而可以与已知突变带型比较鉴定其性质。国外学者应用此技术开展人类肿瘤、单基因遗传病、复杂疾病及基因鉴定等诸多领域的研究，国内应用此法较少。我们在国内首先采用了结合了GC-clamp引物和异源双链的DGGE法，通过测序证实突变相同的DNA的突变性质亦相同。同时，我们通过对DGGE中的多种带型进行连锁分析完成2例STR无法提供信息的产前诊断，从而为提高苯丙酮尿症的产前诊断率提供一简便途径。
, 百拇医药
参考文献
1 Okano Y, Eisensmith RC, Guttler F, et al. Molecular basis of phenotypic heterogeneity in phenylketonuria. N Engl J Med, 1991,324(17):1232_1237
2 Wanf T, Okano Y, Eisensmith RC, et al. Identification of a novel phennylketonuria (PKU) mutation on the Chinese: evidence for multiple origins of PKU on Asia. Am J Hum Genet, 1991,48(3):628_641
3 Guldberg P, Valentino R, Nadia C, et al. Mutational spectrum of phenylalanine hydroxylase deficiency in Sicily: implication for diagnosis of hyperphenylalaninemia in Southern Europe. Hum Mol Genet, 1993,2(10):1703_1705
, 百拇医药
4 Simon CMK, Fred DL, Anthony GD, et al. Nuleotide sequence of a full-length complementary DNA clone and amino acid sequence of human phenylalanine hydroxylase. Biochemistry, 1985,24(3):556_559
5 Wilson HyL, Wang T, Randy E, et al. Molecular basis of PKU in China. Med Sci J, 1993,8(3):180_186
6 孙开来，姜莉，张学.应用PCR-SSCP分析法进行苯丙酮尿症的基因诊断.中国医科大学学报，1993,22(2)：94—97
7 孙桂凤，姜莉，张学.一种新的突变检测方法-双脱氧指纹图谱法(ddF)及其应用.中华医学遗传学杂志，1997，14(1)：47—48
, 百拇医药
8 Wang T, Okano Y， Eisensmith RC, et al. Founder effect of a prevalent phenylketonuria mutation in the oriental population. Pro Natl Acad Sci USA, 1991，88(6):2146_2150
9 Kalaydjieva L, Dworniczak L, Aulehla Scholz C, et al. Silent mutation in the phnylalanine hydroxylase gene as an aid to the diagnosis of phenylketonuria. J Med Genet, 1991，28:686_692
10 Alexei AG, Randy CE, Eileen RW, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria. Hum Mole Genet, 1993，2(5):577_580
1998-05-19收稿, http://www.100md.com
单位：中国医科大学基础医学院遗传学教研室，沈阳 110001
关键词：苯丙酮尿症；苯丙氨酸羟化酶；聚合酶链反应；变性梯度凝胶电泳
中国医科990505 摘要 目的：检测中国北方人中苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子6，12中的突变。方法：应用聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)及直接测序方法，检测突变。结果：中国北方人34例PKU患者外周血DNA中鉴定PAH基因外显子6，12中的3种突变：Y204C，Q232Q和R413P，其频率分别为5.9%(4/68)，4.4%(3/68)，5.9%(4/68)。结论：本实验提示Q232Q可能为中国北方人中较常见的一种新突变，并可能为协助苯丙酮尿症的诊断提供方便手段。同时证实了DGGE法不仅是一种高效快速的突变检测技术，而且作为一种鉴定已知点突变及通过连锁分析进行产前诊断的简便策略，有更广阔的应用前景。
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Studies on Mutation in Exon 6 and 12 of PAH Gene in Northern Chinese
Li Hongjie, Zhang Xue, Jin Chunyuan, et al
Department of Medical Genetics, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective:This study was to detect the mutation in exon 6 and 12 of PHA gene in Northern Chinese. Methods：We used polymerase chain reaction-denaturing gradiet gel electrophoresis and DNA direct sequencing to detect mutations. Results:We identified 3 mutations in exon 6 and 12 of PAH gene: Y204C, Q232Q and R413P, and their frequencies were 5.9%(4/68), 4.4%(3/68) and 5.9%(4/68), respectively. Conclusion:The previous researchers indicated that Y204C and R413P were the common mutations, but Q232Q may be a novel mutation in Northern Chinese, and may be a convinent way to be used as an aid to the diagnosis of phenylketonuria. We also confirm that DGGE is not only an efficient method of detecting mutations, but can also be used as a simple method for identification of known point mutations and prenatal diagnosis through linkage analysis.
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KEY WORDS phenylketonuria; phenylalane hydroxylase; polymerase chain reaction; denatuing gradient gel electrophoresis
苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是一种常见的常染色体隐性遗传代谢性疾病。中国人群中发病率1/16 500，临床表现主要为高苯丙氨酸血症和智力低下。目前研究表明，其分子基础主要为肝脏的苯丙氨酸羟化酶(phenylalane hydroxylase, PAH)基因突变所致酶活性降低或丧失，从而使其底物及继发代谢产物蓄积。尽管人们对其发病机制研究较早，但由于诸多研究证实了苯丙酮尿症是一种高度遗传异质性疾病：等位基因突变种类众多且突变种类存在群体差异，这使得在各种人群中的深入研究成为必需。同时，经典型PKU与非经典型和其它原因如四氢喋呤合成障碍所致的高苯丙氨酸血症的发病机制不同，治疗方案亦不同，所以在治疗前精确的分子诊断有时也是必不可少的。而建立PAH基因突变型和疾病表型之间的关系对选择最佳方案也有指导作用。随着研究的深入使人们对传统的治疗方案——低苯丙氨酸饮食治疗提出质疑，许多研究表明即使较早进行治疗的PKU患者中仍不可避免地出现智力低下，这使得寻找新的治疗方案、进行产前诊断及携带者诊断具有重要意义。而上述问题的解决是以PAH基因突变的研究为前提的，它对了解苯丙酮尿症的发病机理、明确基因型与表型的关系[1]、开展基因诊断与治疗、以及研究基因起源[2]均有重要意义。
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本实验采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)法，对34例中国北方人PKU患者的PAH基因突变的相对热点区外显子6，12进行突变检测，并对可疑突变进行测序。
1 材料与方法
1.1 标本来源及DNA提取
34例患者外周血由第二临床学院儿科生化遗传室提供(患儿父母均来自辽宁省、吉林省、黑龙江省、河北省或天津市的北方人)，经临床及实验室检查诊断为经典型PKU，4例正常人由第一临床学院内科采血室提供。采用常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，-20℃保存。
1.2 PCR引物
根据文献报道[3]由上海细胞生物学研究所合成PAH基因外显子6和12、用于DGGE的带有GC-clamp的引物，引物位于两侧的内含子序列内，扩增片段分别为370 bp和232 bp。
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引物序列如下：6F：5′[GC]CCGACTCCCTCTGCTAACCT-3′；6R：5′-CAATCCTCCCCCAACT-
TTCT-3′；12F：5′-ATGCCACTGAGAACTCTCT-
T-3′；12R：5′[GC]-GATTACTGAGAAAGTGGC-
CT-3′；[GC]=CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCG-
TCCCGCCGCCCCCGCCCG。
1.3 PCR扩增
PCR扩增主要试剂购自北京泰克金生物技术公司。反应总体积为50μl。反应混合物94℃ 7 min变性后，以94℃ 1min、52℃ 1min、72℃ 1min循环40次，最后72℃延伸10min。
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1.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
用BIO-RAD公司生产的D GeneTM System进行电泳，制备6%聚丙烯酰胺/TAE凝胶，变性梯度范围20%～80%(100%变性为7 mol/L尿素和40%甲酰胺)。取20 μl PCR产物及示踪剂的混合物上样，150 V，60℃，6.0 h电泳后凝胶经0.4 μg/ml溴化乙锭染色，于紫外灯下观察并拍照。
1.5 测序
1.5.1 PCR产物纯化：
对经DGGE分析疑有突变者再进行目的片段的PCR扩增，取50μl PCR产物于1.5%低熔点琼脂糖凝胶上分离回收后，用Promega公司生产的WizardTMPCR Preps DNA Purification System纯化。
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1.5.2 测序反应及突变分析：
外显子6采用DGGE所用的未加GC-clamp的反向引物经PE公司生产的ABI PRISM 310型全自动遗传分析仪进行荧光素末端测序及突变分析。
外显子12采用DGGE所用的未加GC-clamp的正向引物进行PCR产物双链循环测序。测序选用Promega公司的fmolTMDNA测序试剂盒，γ-32P-ATP(37 kBq/μl)由北京亚辉生物医学工程公司提供。
2 结果
2.1 DGGE结果
应用本文所提及的引物对34例PKU患者进行PCR-DGGE的部分结果(见图1)。其中有泳动变位及多个带型者为突变，其余PKU患者DNA的PCR产物电泳未见异常。
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图1 部分PAH基因外显子6的PCR-DGGE结果
P1-P6为PKU患者，N为正常人,其中P1和P6为携有外显子6突变的患者
2.2 测序结果
外显子6经反向引物进行自动测序结果(见图2，3)。因为我们采用反向引物进行测序反应，所以测序链为反意义链。参照Simon C.M于1985年测定的PAH cDNA序列[4]，证实外显子6的两种突变Y204C[TAT(Tys204)→TGT(Cys)]和Q232Q[CAA(Gln232)→CAG(Gln)]。
图2 Y204C突变箭头所示处为突变所在
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图3 Q232Q突变箭头所示处为突变所在
外显子12经正向引物进行手工测序的结果(见图4)。突变经测序证实了R413P[CGC(Arg413)→CCC(Pro)]。
图4 R413P突变
3 讨论
苯丙酮尿症是一种常见的遗传性疾病。截止1997年2月，国际PAH基因研究协作组报道了28个国家的研究结果，于7 000多条突变染色体上发现了316种突变。突变遍及PAH基因的13个外显子、部分外显子—内含子交界区及5′非翻译区，其中以外显子7、6、11、12为相对的突变热点区。PAH基因的研究在白种人中较为详尽，但在中国人中尚不全面。目前在中国人中已发现PAH基因突变近30种，尚有20%的突变尚未鉴定。目前研究发现即使大多数早期进行饮食治疗的PKU患者，其智力水平也较预期低，部分患儿出现心理或精神症状[5]，而且饮食治疗的费用大多数中国家庭难以负担。因此，PKU的基因诊断，尤其是产前诊断防止PKU的患儿出生是目前在中国能广泛接受的首要方法。近年来，在此研究领域我室已开展了大量工作，先后应用PCR-SSCP[6]，STR，ddF[7]等方法相互结合进行突变分析及基因诊断。
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本研究在PAH的相对突变热点区6、12鉴定了PAH基因的3种突变：Y204C，Q232Q和R413P，频率分别为5.9%(4/68)，4.4%(3/68)和5.9%(4/68)。1991年Wang T等首次在中国人中发现Y204C和R413P突变，后经统计资料表明二者为中国北方人中较常见突变，频率分别为13%和13.8%[8]。他们通过体外表达实验证实Y204C对酶活性无影响，而R413P突变体的酶活性仅为正常的3%，甚至更少。本研究证实了二者为中国北方人中较常见突变的结论，但突变频率略有差异，可能是由于样本选择偏倚所致。Q232Q为本研究首次在中国人群中报道，但Kalaydjieve L等于1991年在德国人、法国人及土耳其人几组高加索人群中有报道[9]。他们证实了这种CAA-CAG的碱基转换可产生一Ddel的限制性酶切位点且通过PCR即可检查，因此这种突变在PKU产前诊断中作为标记可提供一定的信息。他们同时也证实了在所研究的人群中此突变与单倍型3，4连锁，所以其诊断性应用与靶人群的单倍型分布有密切关系。目前，PAH基因内含子3中的(TCTA)n多态已作为快速简便的产前诊断方法得到广泛应用，但在中国人群中其杂合度为70%[10]，尚有一部分患儿需其它辅助手段进行产前诊断。本研究结果提示Q232Q可能为中国北方人中一种较常见的新突变，而且中国人中80%为单倍型4，所以此突变可能成为协助中国人PKU基因诊断的一种方便手段。同时作者认为结合外显子7常见的多态V245V，这种多态分析方法与STR相结合可能提高苯丙酮尿病的产前诊断。
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参考文献
1 Okano Y, Eisensmith RC, Guttler F, et al. Molecular basis of phenotypic heterogeneity in phenylketonuria. N Engl J Med, 1991,324(17):1232_1237
2 Wanf T, Okano Y, Eisensmith RC, et al. Identification of a novel phennylketonuria (PKU) mutation on the Chinese: evidence for multiple origins of PKU on Asia. Am J Hum Genet, 1991,48(3):628_641
3 Guldberg P, Valentino R, Nadia C, et al. Mutational spectrum of phenylalanine hydroxylase deficiency in Sicily: implication for diagnosis of hyperphenylalaninemia in Southern Europe. Hum Mol Genet, 1993,2(10):1703_1705
, 百拇医药
4 Simon CMK, Fred DL, Anthony GD, et al. Nuleotide sequence of a full-length complementary DNA clone and amino acid sequence of human phenylalanine hydroxylase. Biochemistry, 1985,24(3):556_559
5 Wilson HyL, Wang T, Randy E, et al. Molecular basis of PKU in China. Med Sci J, 1993,8(3):180_186
6 孙开来，姜莉，张学.应用PCR-SSCP分析法进行苯丙酮尿症的基因诊断.中国医科大学学报，1993,22(2)：94—97
7 孙桂凤，姜莉，张学.一种新的突变检测方法-双脱氧指纹图谱法(ddF)及其应用.中华医学遗传学杂志，1997，14(1)：47—48
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8 Wang T, Okano Y， Eisensmith RC, et al. Founder effect of a prevalent phenylketonuria mutation in the oriental population. Pro Natl Acad Sci USA, 1991，88(6):2146_2150
9 Kalaydjieva L, Dworniczak L, Aulehla Scholz C, et al. Silent mutation in the phnylalanine hydroxylase gene as an aid to the diagnosis of phenylketonuria. J Med Genet, 1991，28:686_692
10 Alexei AG, Randy CE, Eileen RW, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria. Hum Mole Genet, 1993，2(5):577_580
1998-05-19收稿, http://www.100md.com