聚合酶链反应法诊断结核病临床价值探讨
作者：刘辉国 熊盛道 熊薇 王斌
单位：430030 武汉,同济医科大学附属同济医院呼吸科
关键词：结核/诊断；聚合酶链反应
临床内科杂志/990508 【摘要】 目的 探讨PCR法对结核病的诊断价值。方法 用PCR法检测痰、纤支镜抽吸物、胸水和血液标本中结核杆菌DNA。结果 PCR法敏感性为21.9%,特异性为92.6%,总的阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为64.6%、65.9%和65.8%;不同标本敏感性有较大的差异。结论 PCR法诊断结核病的敏感性、特异性尚远不能完全满足临床的需要,需进一步完善和改进。
Study on diagnostic value of PCR in tuberculosis
Liu Huiguo,Xiong Shengdao,Xiong Wei,et al.
, 百拇医药
Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the diagnostic value of PCR in tuberculosis.Methods To detect mycobacterium tuberculosis DNA by PCR tecnique in 901 specimens,including sputum,bronchial lavage fluid,pleural effusion and blood.Results The sensitivity and specificity of PCR was 21.9% and 92.6%,respectively.Total positive predictive value,negative predictive value and diagnosis efficiency was 64.6%,65.9%and65.8%,respectively.Conclusion PCR techinque may be useful on diagnosis of tuberculosis,but at present the sensitivity and specificity are too low to meet clinical need.
, 百拇医药
【Key words】 Tuberculosis/ diagnosis Polymerase Chain Reaction
结核病是临床上常见但较难确诊的疾病,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从分子生物学水平为结核病的诊断提供了新的手段。但自PCR技术用于结核病的诊断以来,人们对其敏感性和特异性褒贬不一。为此,我们回顾分析了我院的一组资料,并进行了探讨。
对象与方法
一、对象:全部为本院1994年11月至1998年4月住院病人,其中结核病342例,非结核病患者559例。疾病的诊断主要由病史、实验室检查、细菌学检查、诊断性治疗和追踪观察而综合判断。共收集标本901份,其中痰标本277份,纤支镜抽吸物标本109份、胸水标本267份,血液标本248份。
二、方法:(1)试验试剂包括10×PCR Buffer、Taq-DNA聚合酶、四种dNTP混合物和引物均购自华美生物工程公司。结核杆菌DNA的提取、PCR扩增和扩增产物的鉴定参照有关方法进行,每次实验均设立阳性和阴性对照。(2)有关统计学计算公式如下:①敏感性(%)=真阳性/(真阳性+假阴性)×100;②特异性(%)=真阴性/(真阴性+假阳性)×100;③阳性预测值(%)=真阳性/(真阳性+假阳性)×100;④阴性预测值(%)=真阴性/(真阴性+假阴性)×100;⑤诊断效率(%)=(真阳性+真阴性)/(真阳性+真阴性+假阳性+假阴性)×100。其中临床诊断为结核病且PCR检查也阳性者为真阳性;而PCR阴性者为假阴性。临床诊断为非结核病,而PCR阳性者为假阳性;PCR阴性者为真阴性。
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结果
PCR法共检测各种标本901份,其中结核组标本342份,PCR阳性者75份,阳性率即敏感性为21.9%,非结核组标本559份,PCR阳性者41份,阴性率即特异性为92.6%,PCR法总的阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为64.6%、65.9%和65.8%。
不同种类标本PCR检查结果见附表。附表显示,敏感性最高者为痰标本,其次为纤支镜抽吸物,最低为胸水标本,相互间比较均具有显著性差异(P<0.01)。从阳性预测值来看,最好的是胸水标本,最差的为血标本,两者间比较也有非常显著性差异(P<0.01)。阴性预测值则相反,最低为胸水标本,仅为32.6%,与其它各种标本相比均有非常显著性差异(P<0.01)。诊断效率反映了PCR检查在临床上的使用价值,最低者也为胸水标本,明显低于其它各组标本(P<0.01),其它各种标本之间相比则无显著性差异。各组标本特异性均在90%以上,无显著性差异。
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附表 不同类型标本的PCR检查结果 标本
结核病
标本数
非结核病
标本数
阳性率
(%)
特异性
(%)
阳性预测值
(%)
阴性预测值
(%)
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诊断效率
(%)
痰标本
85
192
45.8
90.1
67.2
78.9
76.5
纤支镜标本
27
82
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33.3
91.4
56.2
80.6
77.1
胸水
184
83
10.3
96.3
86.3
32.6
37.1
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血液
46
202
17.4
94.1
40.0
83.3
79.8
讨论
PCR技术自1985年Saiki等首创以来,已在很多领域进行了广泛应用,并取得了明显的效果。PCR技术用于结核病的诊断最早见于1989年,之后国内对此作了大量研究,但研究结果在不同单位差异很大,各种标本的阳性率为40%～80%不等[1],特异性也不尽相同,为此我们回顾了本院自开展PCR法检查结核杆菌DNA以来各种标本901份,共发现阳性者116份。其中结核病标本342份,PCR阳性75份,阳性率即敏感性为21.9%;非结核病标本559份,PCR阴性518份,特异性为92.6%。在各种标本中,痰标本阳性率最高,为45.8%,其次为纤支镜标本,阳性率为33.3%,最低为血液和胸液标本,不同标本之间有非常显著性差异(P<0.01)。而特异性则相反,依次为胸液、血液、纤支镜抽吸物和痰液,但其差异无显著性。
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本组资料显示,PCR法检查结核杆菌的阳性率在不同的标本差异较大,但总的阳性率尚较低,低于国内一些报道。由于我们观察标本数量较大,我们认为其基本能反映PCR法检查结核杆菌的真实情况,至于其原因较为复杂,除因为我们属综合性医院、结核病多不典型、结核杆菌密度相对较低外,主要与引物的选择[2]、PCR产物的识别方法有关。此外,PCR方法本身也存在局限性。我们知道,随着PCR循环次数的增多,其特异性产物呈2n指数递增,但其增殖过程有一定自限性,经过一定周期数后,PCR对DNA的增殖不再呈2n指数增长,而呈直线增长,因此其敏感性有一定限度。为了获得更高的敏感性和特异性,Catherine等[3]尝试用套式—引物PCR进行再扩增,取得一定效果,国内也有类似报道[4]。同时,标本收集和处理对实验结果也有一定影响,有作者报道[5]由于标本中存在Taq-DNA聚合酶的抑制性物质(如SDS,Hb或酚类等),以及结核菌非特异性扩增产物(如引物的聚体)与其产生竞争等,都可导致假阴性。
, 百拇医药
在非结核性疾病的标本中,也有部分出现PCR阳性,其原因除与PCR法操作时易受PCR产物污染外,如空气中一个极小的产物气溶胶颗粒中可含有高达105个可成为模板的产物分子,还可能与部分患者存在潜在的结核杆菌感染,常规检查方法不易发现有关。因此有人提出为防止污染而产生假阳性[1],在实验操作时应注意下面几点:(1)PCR前的加样物品同PCR反应后的物品分开,其操作最好在不同房间进行。(2)使用一次性移液器,试剂分装一次性使用。(3)使用超净工作台,并且要定期紫外线消毒。
为评价PCR检查结核杆菌DNA的临床使用价值,分析了其诊断效率,发现总的诊断效率仅为65.8%,不同类型标本之间有一定差异,痰、纤支镜抽吸物和血标本均在75%～80%之间,无显著性差异,而胸水标本最低仅为37%。提示在临床上分析实验结果应慎重,不能单凭PCR的结果就肯定或否定诊断,这也说明PCR法在目前应用于临床还存在局限性。
我们观察不同标本PCR检查的敏感性也有较大差异。痰标本PCR敏感性最高,为45.8%,而最低为胸水标本,仅10.3%,它们之间有显著性差异,分析认为可能与标本不同、结核杆菌密度不同有关,这也进一步提示不同标本作PCR检查其使用价值及意义不同,因血液和胸水标本PCR检查阳性率尤其低,故其临床价值值得进一步探讨。
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从理论上讲,PCR是一种极有前景的结核病现代诊断技术之一,但目前仍处在发展过程,试剂盒应有可靠的质量保证体系,PCR操作必须严格要求,同时还应有严格的阳性对照和阴性对照,否则会导致PCR检查的敏感性和特异性明显下降,因此目前尚不能把PCR检查看作是一种成熟的常规确诊手段。当然,PCR技术的改进正在进行中,待将来经实践证明在一般实验室可以推广时再开展检查,以期能早日应用于临床。
参考文献
〔1〕陈一平,翁心华,徐肇月.聚合酶链反应检测结核杆菌DNA实验研究的近况.上海医学检验杂志,1994,(3)∶180.
〔2〕陈刚,陈兆军.聚合酶链反应试剂对检测结核分支杆菌的影响.中华结核和呼吸杂志,1996,19(5)∶294.
〔3〕Catherine P,Denise L,Yves B,et al.Use of a reamplification protocol improves sensitivity of detection of mycobacterium tuberculosis in clinical samples by amplification of DNA.J Clin Microbiol,1991,29∶712.
〔4〕王晓东,孟昭智,陶静,等.套式聚合酶链反应检测结核杆菌DNA.中华结核和呼吸杂志,1996,19(6)∶190.
〔5〕庄玉辉,李国利,张小刚,等.脱氧核糖核酸聚合酶链反应快速检测结核临床标本结核菌的评价.中华结核和呼吸杂志,1993,16(1)∶26.
(收稿:1999-03-10 修回:1999-04-12), 百拇医药
单位：430030 武汉,同济医科大学附属同济医院呼吸科
关键词：结核/诊断；聚合酶链反应
临床内科杂志/990508 【摘要】 目的 探讨PCR法对结核病的诊断价值。方法 用PCR法检测痰、纤支镜抽吸物、胸水和血液标本中结核杆菌DNA。结果 PCR法敏感性为21.9%,特异性为92.6%,总的阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为64.6%、65.9%和65.8%;不同标本敏感性有较大的差异。结论 PCR法诊断结核病的敏感性、特异性尚远不能完全满足临床的需要,需进一步完善和改进。
Study on diagnostic value of PCR in tuberculosis
Liu Huiguo,Xiong Shengdao,Xiong Wei,et al.
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Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the diagnostic value of PCR in tuberculosis.Methods To detect mycobacterium tuberculosis DNA by PCR tecnique in 901 specimens,including sputum,bronchial lavage fluid,pleural effusion and blood.Results The sensitivity and specificity of PCR was 21.9% and 92.6%,respectively.Total positive predictive value,negative predictive value and diagnosis efficiency was 64.6%,65.9%and65.8%,respectively.Conclusion PCR techinque may be useful on diagnosis of tuberculosis,but at present the sensitivity and specificity are too low to meet clinical need.
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【Key words】 Tuberculosis/ diagnosis Polymerase Chain Reaction
结核病是临床上常见但较难确诊的疾病,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从分子生物学水平为结核病的诊断提供了新的手段。但自PCR技术用于结核病的诊断以来,人们对其敏感性和特异性褒贬不一。为此,我们回顾分析了我院的一组资料,并进行了探讨。
对象与方法
一、对象:全部为本院1994年11月至1998年4月住院病人,其中结核病342例,非结核病患者559例。疾病的诊断主要由病史、实验室检查、细菌学检查、诊断性治疗和追踪观察而综合判断。共收集标本901份,其中痰标本277份,纤支镜抽吸物标本109份、胸水标本267份,血液标本248份。
二、方法:(1)试验试剂包括10×PCR Buffer、Taq-DNA聚合酶、四种dNTP混合物和引物均购自华美生物工程公司。结核杆菌DNA的提取、PCR扩增和扩增产物的鉴定参照有关方法进行,每次实验均设立阳性和阴性对照。(2)有关统计学计算公式如下:①敏感性(%)=真阳性/(真阳性+假阴性)×100;②特异性(%)=真阴性/(真阴性+假阳性)×100;③阳性预测值(%)=真阳性/(真阳性+假阳性)×100;④阴性预测值(%)=真阴性/(真阴性+假阴性)×100;⑤诊断效率(%)=(真阳性+真阴性)/(真阳性+真阴性+假阳性+假阴性)×100。其中临床诊断为结核病且PCR检查也阳性者为真阳性;而PCR阴性者为假阴性。临床诊断为非结核病,而PCR阳性者为假阳性;PCR阴性者为真阴性。
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结果
PCR法共检测各种标本901份,其中结核组标本342份,PCR阳性者75份,阳性率即敏感性为21.9%,非结核组标本559份,PCR阳性者41份,阴性率即特异性为92.6%,PCR法总的阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为64.6%、65.9%和65.8%。
不同种类标本PCR检查结果见附表。附表显示,敏感性最高者为痰标本,其次为纤支镜抽吸物,最低为胸水标本,相互间比较均具有显著性差异(P<0.01)。从阳性预测值来看,最好的是胸水标本,最差的为血标本,两者间比较也有非常显著性差异(P<0.01)。阴性预测值则相反,最低为胸水标本,仅为32.6%,与其它各种标本相比均有非常显著性差异(P<0.01)。诊断效率反映了PCR检查在临床上的使用价值,最低者也为胸水标本,明显低于其它各组标本(P<0.01),其它各种标本之间相比则无显著性差异。各组标本特异性均在90%以上,无显著性差异。
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附表 不同类型标本的PCR检查结果 标本
结核病
标本数
非结核病
标本数
阳性率
(%)
特异性
(%)
阳性预测值
(%)
阴性预测值
(%)
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诊断效率
(%)
痰标本
85
192
45.8
90.1
67.2
78.9
76.5
纤支镜标本
27
82
, http://www.100md.com
33.3
91.4
56.2
80.6
77.1
胸水
184
83
10.3
96.3
86.3
32.6
37.1
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血液
46
202
17.4
94.1
40.0
83.3
79.8
讨论
PCR技术自1985年Saiki等首创以来,已在很多领域进行了广泛应用,并取得了明显的效果。PCR技术用于结核病的诊断最早见于1989年,之后国内对此作了大量研究,但研究结果在不同单位差异很大,各种标本的阳性率为40%～80%不等[1],特异性也不尽相同,为此我们回顾了本院自开展PCR法检查结核杆菌DNA以来各种标本901份,共发现阳性者116份。其中结核病标本342份,PCR阳性75份,阳性率即敏感性为21.9%;非结核病标本559份,PCR阴性518份,特异性为92.6%。在各种标本中,痰标本阳性率最高,为45.8%,其次为纤支镜标本,阳性率为33.3%,最低为血液和胸液标本,不同标本之间有非常显著性差异(P<0.01)。而特异性则相反,依次为胸液、血液、纤支镜抽吸物和痰液,但其差异无显著性。
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本组资料显示,PCR法检查结核杆菌的阳性率在不同的标本差异较大,但总的阳性率尚较低,低于国内一些报道。由于我们观察标本数量较大,我们认为其基本能反映PCR法检查结核杆菌的真实情况,至于其原因较为复杂,除因为我们属综合性医院、结核病多不典型、结核杆菌密度相对较低外,主要与引物的选择[2]、PCR产物的识别方法有关。此外,PCR方法本身也存在局限性。我们知道,随着PCR循环次数的增多,其特异性产物呈2n指数递增,但其增殖过程有一定自限性,经过一定周期数后,PCR对DNA的增殖不再呈2n指数增长,而呈直线增长,因此其敏感性有一定限度。为了获得更高的敏感性和特异性,Catherine等[3]尝试用套式—引物PCR进行再扩增,取得一定效果,国内也有类似报道[4]。同时,标本收集和处理对实验结果也有一定影响,有作者报道[5]由于标本中存在Taq-DNA聚合酶的抑制性物质(如SDS,Hb或酚类等),以及结核菌非特异性扩增产物(如引物的聚体)与其产生竞争等,都可导致假阴性。
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在非结核性疾病的标本中,也有部分出现PCR阳性,其原因除与PCR法操作时易受PCR产物污染外,如空气中一个极小的产物气溶胶颗粒中可含有高达105个可成为模板的产物分子,还可能与部分患者存在潜在的结核杆菌感染,常规检查方法不易发现有关。因此有人提出为防止污染而产生假阳性[1],在实验操作时应注意下面几点:(1)PCR前的加样物品同PCR反应后的物品分开,其操作最好在不同房间进行。(2)使用一次性移液器,试剂分装一次性使用。(3)使用超净工作台,并且要定期紫外线消毒。
为评价PCR检查结核杆菌DNA的临床使用价值,分析了其诊断效率,发现总的诊断效率仅为65.8%,不同类型标本之间有一定差异,痰、纤支镜抽吸物和血标本均在75%～80%之间,无显著性差异,而胸水标本最低仅为37%。提示在临床上分析实验结果应慎重,不能单凭PCR的结果就肯定或否定诊断,这也说明PCR法在目前应用于临床还存在局限性。
我们观察不同标本PCR检查的敏感性也有较大差异。痰标本PCR敏感性最高,为45.8%,而最低为胸水标本,仅10.3%,它们之间有显著性差异,分析认为可能与标本不同、结核杆菌密度不同有关,这也进一步提示不同标本作PCR检查其使用价值及意义不同,因血液和胸水标本PCR检查阳性率尤其低,故其临床价值值得进一步探讨。
, http://www.100md.com
从理论上讲,PCR是一种极有前景的结核病现代诊断技术之一,但目前仍处在发展过程,试剂盒应有可靠的质量保证体系,PCR操作必须严格要求,同时还应有严格的阳性对照和阴性对照,否则会导致PCR检查的敏感性和特异性明显下降,因此目前尚不能把PCR检查看作是一种成熟的常规确诊手段。当然,PCR技术的改进正在进行中,待将来经实践证明在一般实验室可以推广时再开展检查,以期能早日应用于临床。
参考文献
〔1〕陈一平,翁心华,徐肇月.聚合酶链反应检测结核杆菌DNA实验研究的近况.上海医学检验杂志,1994,(3)∶180.
〔2〕陈刚,陈兆军.聚合酶链反应试剂对检测结核分支杆菌的影响.中华结核和呼吸杂志,1996,19(5)∶294.
〔3〕Catherine P,Denise L,Yves B,et al.Use of a reamplification protocol improves sensitivity of detection of mycobacterium tuberculosis in clinical samples by amplification of DNA.J Clin Microbiol,1991,29∶712.
〔4〕王晓东,孟昭智,陶静,等.套式聚合酶链反应检测结核杆菌DNA.中华结核和呼吸杂志,1996,19(6)∶190.
〔5〕庄玉辉,李国利,张小刚,等.脱氧核糖核酸聚合酶链反应快速检测结核临床标本结核菌的评价.中华结核和呼吸杂志,1993,16(1)∶26.
(收稿:1999-03-10 修回:1999-04-12), 百拇医药