p16基因的表达上调对鼻咽癌细胞恶性表型的影响——p16基因在鼻咽癌中的改变系列研究(Ⅱ)
作者：卓缨 易红 顾焕华 曹亚
单位：湖南医科大学肿瘤研究所分子生物室(长沙市，410078) *通讯作者
关键词：p16基因；鼻咽癌细胞系；表达上调；恶性表型逆转
癌症990504
【摘 要】 目的：探讨上调p16基因的表达对鼻咽癌细胞恶性表型逆转的作用，为p16基因在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用提供直接的证据。方法：本文采用电穿孔的方法向p16基因表达下调的鼻咽癌细胞系HNE1中导入全长野生型的p16cDNA，通过G418筛选获得可以稳定传代的转染细胞系。对其中4个转染细胞系以PCR和Northern杂交鉴定转染细胞系中外源p16cDNA整合以及p16基因表达的状况。并借助比较细胞倍增时间，流式细胞计数和裸鼠接种的方法对转染细胞的恶性表型进行了检测。结果：在所鉴定的4个转染细胞系中有一个转染细胞系(＃4-2)不仅整合了外源p16cDNA，且p16基因的表达明显增高。与未转染的鼻咽癌细胞系HNE1及未整合外源p16cDNA的转染细胞系相比，＃4-2细胞的倍增时间延长，停滞于G1期的细胞数明显增多，接种裸鼠后肿瘤形成的潜伏期延长。结论：以上实验结果证实p16基因在鼻咽癌的发生过程中确实具有一定的作用，它的表达上调可以促进鼻咽癌细胞恶性表型的逆转。
, 百拇医药
中图分类号：R739.63；R730.231 文献标识码：A 文章编号：1000-476X(1999)05-0499-05
Research on malignant phenotype reversion of nasopharyngeal carcinoma cell by up-regulation of p16 gene expression Serial research on alterations of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma Ⅱ
ZHUO Ying,YI Hong,GU Huan-hua,et al.
Cancer Research Instiute of Hunan Medical University, Changsha 410078, P.R. China
, 百拇医药
【Abstract】 Objective：To explore the role of the p16 gene up-regulation on the malignant phenotype reversion of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell,and to provide the direct evidence that the p16 gene play a role in nasopharyngeal carcinogenesis. Methods：Full-length wild-type p16 cDNA was introduced into NPC cell line HNE1 with p16 gene down-regulation by electroporation.Stable G418-resistant clones were isolated.Then PCR was used to detect the integration of the exogenous p16 cDNA and Northern blotting was used to detect the expression of the p16 gene in 4/7 clones.Finally the growth suppression of the positive clone (＃ 4-2) was detected by doubling time,cytometry and xenografts. Results：In 4 clones identified, only one transfectant ＃ 4-2 showed integration of exogenous p16 cDNA and up-regulation of p16 mRNA expression compared to NPC cell line HNE1 and the transfectant clones without integration of exogenous p16 cDNA, transfectant ＃ 4-2 showed：a). a longer doubling time; b). an accumulation of cells in G1 phase and c). longer latent period of tumor formation in nude mice. Conclusions：These data show that up-regulation of p16 expression can inhibit the growth and tumor formation of NPC cell. The p16 gene is really a functional tumor suppressor gene in nasopharyngeal carcinogenesis and takes part in promoting the malignant phenotype reversion of NPC cells.
, http://www.100md.com
Key words：p16 gene; NPC cell line; Up-regulation; Malignant phenotype reversion
细胞周期的有序进行是由一系列细胞周期调节蛋白来控制的，它包括促进细胞周期进行的周期素依赖性激酶(cyclin-depedentkinase，CDK)和周期素(cyclin)，以及在细胞周期中起负性调节作用的周期素依赖性激酶抑制子(CDKinhibitor，CKI)，这些基因的改变将导致肿瘤的发生。p16基因是定位于染色体9q21的一种周期素依赖性激酶抑制子，它所编码的p16蛋白与周期素D竞争同CDK4或CDK6的结合，抑制CDK4或CDK6这两种激酶的活性，从而导致细胞停滞在G1期〔1〕。作为一种在多种肿瘤中存在高频率多种形式改变的抑瘤基因，已有多篇报道p16基因在鼻咽癌也存在多种改变。Lo等人曾对香港鼻咽癌患者的活检组织进行了检测，发现有35%的样本存在p16基因外显子2的缺失，在另一项研究中他还在22%的鼻咽癌活检组织中检测到p16基因启动子和外显子1CpG岛的甲基化〔2，3〕。在我们先前的研究中发现在约85%的鼻咽癌活检组织中检测不到p16蛋白的表达。另外Sun等人也发现在鼻咽癌细胞系和鼠的异体移植瘤中存在p16基因的表达下调或无表达〔4〕。这些都提示p16基因可能在鼻咽癌的发病过程中起一定的作用。
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为了得到直接的证据，我们利用体外基因转染的技术上调鼻咽癌细胞系中p16基因的表达，观察p16基因的表达上调对鼻咽癌细胞恶性表型的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
鼻咽癌细胞系HNE1、结肠癌细胞系SW620和宫颈癌细胞系HeLa由湖南医科大学肿瘤研究所细胞中心提供。细胞用含15%小牛血清的1640培基，在37℃、5%CO2的条件下进行培养。
1.2 质粒
表达质粒pCDKN2WT由美国斯坦福大学Arap教授惠赠。该质粒带有野生型全长p16cDNA和筛选标志Neo基因。在p16cDNA上游及下游分别带有CMV启动子和BGH的polyA尾。在Neo基因的上游和下游分别带有SV40的启动子和polyA尾。
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1.3 电穿孔
80μg环状的pCDKN2WT与约1×107HNE1细胞混匀，以1.25kV/25μF.0.6sec-1的条件进行电击。电击后，细胞在含有G418的培基上进行筛选培养14天。7个抗G418的阳性克隆培养成稳定传代的转染细胞系。
1.4 PCR的方法鉴定转染细胞系中外源p16cDNA的整合
利用引物p16col/co2进行PCR来检测转染细胞中外源p16cDNA的整合。引物序列分别为p16co1：ATGGAGCCTTCGGCTGACT；p16c02：GAGCCTTCTTGGTTCTTTCA。扩增产物长为470bp。反应体系包括：0.6μg基因组DNA，5XPCR缓冲液，200μmoldNTP，30pmolp16col/co2，1μlTaqDNA聚合酶(2u/μl)。扩增条件：94℃变性5分钟，95℃50秒，58℃50秒，72℃50秒扩增35个循环，扩增产物进行凝胶电泳。
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1.5 Northern杂交检测p16基因的表达
按操作手册用TRIZOL的方法抽提细胞总RNA。以含6.0%甲醛的1.0%变性琼脂糖凝胶电泳分离25μgRNA，转移至尼龙膜上，与[α-32P]dCTP标记的全长p16cDNA探针杂交，洗膜后放射自显影。杂交信号经密度扫描分析。
1.6 通过生长曲线比较细胞的生长速度
将1×105细胞接种到6孔板上。每隔24小时对接种细胞进行计数，共进行5天。绘制生长曲线于半对数纸上，计算对数生长期细胞的倍增时间。
1.7 流式细胞计数
用70%的甲醇——PBS固定，混匀，于4℃放置1小时。然后1000rpm离心10分钟收集细胞，再用10μg/ml碘化丙啶(PI)和100μg/mlRNA酶于37℃，重悬细胞，放置30分钟。在由BectonDickison公司出品的FACA型流式细胞仪上进行分析，所得数据用ModFitLT软件进行统计。每种细胞均检测3次，用方差分析的方法进行统计处理。
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1.8 裸鼠接种实验
将约0.5ml(1×107)细胞悬液注入4～8周大小的BALB/C裸鼠皮下。每天观察肿瘤生长的情况。3周后处死小鼠。肿瘤组织进行称重，并用甲醛固定石蜡包埋后制成切片进行病理诊断，免疫组化和原位杂交。
1.9 免疫组化
5μm厚的石蜡切片脱腊入水后与1∶40稀释的兔抗人p16多克隆抗体p16c-20(美国SantaCruz公司)在4℃孵育过夜。再用ABC法进行检测。最后以苏木素复染。
1.10 原位杂交
5μm厚的石蜡切片脱蜡入水后，5mMMgC12/1XPBS冼，0.2N的盐酸浸泡30分钟，5mMEDTA/2XSSC30分钟，42℃，20μg/ml蛋白酶K消化30分钟，再用5mMMgCl2/1XPBS洗，预杂交30分钟37℃，以地高辛标记的p16全长cDNA做探针进行杂交，37℃过夜，洗片后以地高辛检测试剂盒(德国宝灵曼公司)免疫检测显色，核固红复染。
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2 结果
2.1 p16基因转染
为了检测上调p16基因的表达是否能促进鼻咽癌细胞恶性表型的逆转，我们向存在p16基因表达下调的鼻咽癌细胞系HNE1导入全长野生型p16cDNA。通过G418筛选后，挑选7个克隆培养成稳定传代的转染细胞系。我们对其中4个转染细胞系中外源p16cDNA整合和表达的情况进行了检测。利用跨p16基因3个外显子的引物p16col/co2进行PCR来检测外源p16cDNA整合情况(见表1)。外源性p16cDNA的扩增产物约为470bp,而内源性p16基因由于在3个外显子间还插有2个内含子，因此难以检测到扩增产物。图1显示以HNE1作为阴性对照，3个转染细胞系(＃1-1，＃3-2，＃4-2)整合有外源p16cDNA。
表1 转染细胞系pCDKN2WTHEN1的鉴定 克隆编号
外源p16cDNA的整合
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p16mRNA的表达
＃1-1
Y
D
＃1-6
ND
ND
＃2-3
ND
ND
＃3-2
Y
D
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＃3-4
N
D
＃4-2
Y
U
＃4-5
ND
ND
Y，整合；N，未整合；D，下调；U，上调；ND，未检测；
图1 PCR鉴定转染细胞系外源质粒的整合情
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况.用引物p16c01/c02进行护增。转染
细胞系＃1-1、＃3-2and＃4-2中可护增出～
470bp的护增产物。鼻咽癌细胞系HNE1
和转染细胞系＃3-4中无护增产物。
进一步利用Northern杂交的方法检测转染细胞系中p16基因的表达状况。在实验中以p16基因表达正常的宫颈癌细胞系HeLa和结肠癌细胞系SW620作为阳性对照，并以HNE1和没有整合外源p16cDNA的转染细胞系＃3-4作为阴性对照。为了定量准确，在密度扫描时，以转膜前凝胶照片上各组样本的18S和28SRNA带作为内对照。实验发现非转染的鼻咽癌细胞系HNE1和＃3-4转染细胞系p16mRNA的水平明显低于HeLa细胞系和SW620细胞系，而在3个整合了外源p16cDNA的转染的细胞系中，只有一个＃4-2转染细胞系具有高水平表达的p16mRNA(图2)。这一结果说明＃4-2转染细胞系p16基因mRNA表达上调。
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图2 Northern杂交鉴定转染细胞系中p16基
因的表达状况.HeLa细胞、SW620细胞
和p16转染细胞系＃4-2中表达明显的
长约0.8kb的p16mRNA。HNE12和转
染细胞系＃1-1，＃3-2，＃3-4中p16mRNA
的表达下调。以凝胶电泳时溴乙啶染色
后的18S和28S作为内照。
2.2 ＃4-2转染细胞系恶性表型的改变
由于p16基因是一个在细胞周期中起负性调节作用的抑瘤基因，因此，首先通过生长曲线的绘制来观察上调p16基因的表达对细胞生长抑制的作用。从图3中可以看到和HNE1细胞的生长速度相比，＃4-2转染细胞的生长速度明显减慢，两者的倍增时间分别为23.8小时和31.2小时。
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同时以未转染的鼻咽癌细胞系HNE1和整合有外源p16cDNA但p16基因表达无改变的转染细胞系＃3-2为对照，利用流式细胞仪对三种细胞的细胞周期分布进行了检测。表2中显示HNE1和＃3-2转染细胞系细胞周期的分布没有差别(P>0.05)。而＃4-2转染细胞系与上述两种细胞系相比，GO/G1期细胞数明显增多(P<0.05和 P< 0.01)。这一数据提示p16基因的上调导致了停滞于G1期的细胞明显增多，这与对倍增时间的观察结果是一致的。
表2 转染细胞系pCDKN2WTHNE1细胞周期的分布 细胞系
p16mRNA的
表达状况
G0/G1%
S
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G2/M
HNE1
D
88.58±3.28
10.96±3.19
0.46±0.11
＃3-2
D
90.35±0.73
7.74±0.89
1.91±0.62
＃4-2
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U
97.06±0.87
1.30±0.62
1.64±1.40
D，下调；U，上调；
最后，将HNE1、＃3-2和＃4-2三种细胞系分别注入裸鼠皮下以观察这三种细胞的成瘤性。接种HNE1和＃3-2细胞的裸鼠在接种后6天就出现了肿瘤，而接种了＃4-2细胞的裸鼠在接种后11天才有肿瘤生成，说明＃4-2细胞系致瘤的潜伏期比HNE1和＃3-2细胞系延长。3周以后取出肿瘤进行病理诊断均为低分化鳞癌(图4)，免疫组化和原位杂交都显示＃4-2来源的裸鼠肿瘤组织中p16基因的表达明显强于HNE1和＃3-2来源的裸鼠肿瘤组织(图5，6)。但三种细胞系所形成的肿瘤的重量没有明显的差别。
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图3 鼻咽癌细胞系HNE1和转染细胞系
＃4-2细胞的生长曲线。
图4 鼻咽癌转染细胞系异体称植瘤的HE染色(×200)
图5 免疫组化检测异体移植瘤中p16基因的表达状况。
A).转染细胞系＃4-2异体移植植瘤中p16基因的表达。
B).鼻咽癌细胞系HNE1异体移植瘤中p16基因的表达(×400)。
只在＃4-2异体移植瘤中有明显的核着色(如箭头所示)。
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图6 原位杂交检测异体移植瘤中p16基因的表达状况。
A).转染细胞系＃4-2异体移植瘤中p16基因的表达。
B).鼻咽癌细胞系HNE1异体移植瘤中p16基因的表达(×400).
＃4-2异体移植瘤中蓝色着色明显强于HNE1中的(如箭头所示)。
3 讨论
在先前的研究中已发现p16基因在鼻咽癌中存在高频率的失活，本实验进一步确证了p16基因在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用。上调p16基因的表达能有效阻止鼻咽癌细胞系HNE1的生长，延长其倍增时间，使大部分癌细胞停滞在G1期。同时具有p16基因表达上调的鼻咽癌转染细胞系＃4-2在裸鼠体内成瘤的潜伏期比无p16基因表达上调的细胞系延长。但肿瘤的发生是一个多基因改变多阶段的过程，p16基因很可能是鼻咽癌发生的早期起作用，因此，单纯上调p16基因的表达并不能完全逆转鼻咽癌细胞的恶性表型，表现在＃4-2细胞在裸鼠皮下仍能形成肿瘤，且肿瘤的生长速度与对照组没有明显区别。最近，有研究表明除p16基因外其他细胞周期调节基因的改变也可导致人类肿瘤的形成。如在头颈部肿瘤或胶质瘤等多种肿瘤中都分别检测到了周期素D1基因和CDK4基因的扩增〔5，6〕。这也提示我们在鼻咽癌的发病过程中CDK4基因和周期素D1基因可能与p16基因一同发生作用。
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致谢：感谢姚开泰教授和李桂源教授在本文完成过程中给予的支持和帮助。
[编者按：该系列研究(Ⅰ)发表于本刊1999(4)：368～371页]
基金项目：国家杰出青年科学家基金(批准号：39525022)和中华医学基金(CMB)(批准号：90-529)资助。
〔参考文献〕
〔1〕 Serrano M,Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4〔J〕. Nature,1993,366：704～ 707.
〔2〕 Lo KW,Huang DP,Lau KM. p16 gene alterations in nasopharyngeal carcinoma〔J〕. Cancer Res,1995,55：2039～2043.
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〔3〕 Lo KW,Cheung ST,Leung SF,et al. Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma〔J〕. Cancer Res,1996,56：2721～ 2725.
〔4〕 Sun Y,Hildesheim A,Lanier AE,et al. No point mutation but decreased expression of the p16/MTS1 tumor suppressor gene in nasopharyngeal carcinomas〔J〕. Oncogene,1995,10：785～ 788.
〔5〕 Michalides R,van Veelen N, Hart A,et al. Overexpression of cyclin D1 correlates with recurrence in a group of forty-seven operable squamous cell carcinomas of the head and neck〔J〕. Cancer Res,1995,55:975～ 978.
〔6〕 He J,Allen JR,Collins VP,et al. CDK4 amplification is an alternative mechanism to p16 gene homozygous deletion in glioma cell lines〔J〕. Cancer Res,1994,54：5804～5087.
收稿日期：1999-04-08；修回日期：1999-05-12, http://www.100md.com
单位：湖南医科大学肿瘤研究所分子生物室(长沙市，410078) *通讯作者
关键词：p16基因；鼻咽癌细胞系；表达上调；恶性表型逆转
癌症990504
【摘 要】 目的：探讨上调p16基因的表达对鼻咽癌细胞恶性表型逆转的作用，为p16基因在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用提供直接的证据。方法：本文采用电穿孔的方法向p16基因表达下调的鼻咽癌细胞系HNE1中导入全长野生型的p16cDNA，通过G418筛选获得可以稳定传代的转染细胞系。对其中4个转染细胞系以PCR和Northern杂交鉴定转染细胞系中外源p16cDNA整合以及p16基因表达的状况。并借助比较细胞倍增时间，流式细胞计数和裸鼠接种的方法对转染细胞的恶性表型进行了检测。结果：在所鉴定的4个转染细胞系中有一个转染细胞系(＃4-2)不仅整合了外源p16cDNA，且p16基因的表达明显增高。与未转染的鼻咽癌细胞系HNE1及未整合外源p16cDNA的转染细胞系相比，＃4-2细胞的倍增时间延长，停滞于G1期的细胞数明显增多，接种裸鼠后肿瘤形成的潜伏期延长。结论：以上实验结果证实p16基因在鼻咽癌的发生过程中确实具有一定的作用，它的表达上调可以促进鼻咽癌细胞恶性表型的逆转。
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中图分类号：R739.63；R730.231 文献标识码：A 文章编号：1000-476X(1999)05-0499-05
Research on malignant phenotype reversion of nasopharyngeal carcinoma cell by up-regulation of p16 gene expression Serial research on alterations of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma Ⅱ
ZHUO Ying,YI Hong,GU Huan-hua,et al.
Cancer Research Instiute of Hunan Medical University, Changsha 410078, P.R. China
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【Abstract】 Objective：To explore the role of the p16 gene up-regulation on the malignant phenotype reversion of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell,and to provide the direct evidence that the p16 gene play a role in nasopharyngeal carcinogenesis. Methods：Full-length wild-type p16 cDNA was introduced into NPC cell line HNE1 with p16 gene down-regulation by electroporation.Stable G418-resistant clones were isolated.Then PCR was used to detect the integration of the exogenous p16 cDNA and Northern blotting was used to detect the expression of the p16 gene in 4/7 clones.Finally the growth suppression of the positive clone (＃ 4-2) was detected by doubling time,cytometry and xenografts. Results：In 4 clones identified, only one transfectant ＃ 4-2 showed integration of exogenous p16 cDNA and up-regulation of p16 mRNA expression compared to NPC cell line HNE1 and the transfectant clones without integration of exogenous p16 cDNA, transfectant ＃ 4-2 showed：a). a longer doubling time; b). an accumulation of cells in G1 phase and c). longer latent period of tumor formation in nude mice. Conclusions：These data show that up-regulation of p16 expression can inhibit the growth and tumor formation of NPC cell. The p16 gene is really a functional tumor suppressor gene in nasopharyngeal carcinogenesis and takes part in promoting the malignant phenotype reversion of NPC cells.
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Key words：p16 gene; NPC cell line; Up-regulation; Malignant phenotype reversion
细胞周期的有序进行是由一系列细胞周期调节蛋白来控制的，它包括促进细胞周期进行的周期素依赖性激酶(cyclin-depedentkinase，CDK)和周期素(cyclin)，以及在细胞周期中起负性调节作用的周期素依赖性激酶抑制子(CDKinhibitor，CKI)，这些基因的改变将导致肿瘤的发生。p16基因是定位于染色体9q21的一种周期素依赖性激酶抑制子，它所编码的p16蛋白与周期素D竞争同CDK4或CDK6的结合，抑制CDK4或CDK6这两种激酶的活性，从而导致细胞停滞在G1期〔1〕。作为一种在多种肿瘤中存在高频率多种形式改变的抑瘤基因，已有多篇报道p16基因在鼻咽癌也存在多种改变。Lo等人曾对香港鼻咽癌患者的活检组织进行了检测，发现有35%的样本存在p16基因外显子2的缺失，在另一项研究中他还在22%的鼻咽癌活检组织中检测到p16基因启动子和外显子1CpG岛的甲基化〔2，3〕。在我们先前的研究中发现在约85%的鼻咽癌活检组织中检测不到p16蛋白的表达。另外Sun等人也发现在鼻咽癌细胞系和鼠的异体移植瘤中存在p16基因的表达下调或无表达〔4〕。这些都提示p16基因可能在鼻咽癌的发病过程中起一定的作用。
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为了得到直接的证据，我们利用体外基因转染的技术上调鼻咽癌细胞系中p16基因的表达，观察p16基因的表达上调对鼻咽癌细胞恶性表型的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
鼻咽癌细胞系HNE1、结肠癌细胞系SW620和宫颈癌细胞系HeLa由湖南医科大学肿瘤研究所细胞中心提供。细胞用含15%小牛血清的1640培基，在37℃、5%CO2的条件下进行培养。
1.2 质粒
表达质粒pCDKN2WT由美国斯坦福大学Arap教授惠赠。该质粒带有野生型全长p16cDNA和筛选标志Neo基因。在p16cDNA上游及下游分别带有CMV启动子和BGH的polyA尾。在Neo基因的上游和下游分别带有SV40的启动子和polyA尾。
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1.3 电穿孔
80μg环状的pCDKN2WT与约1×107HNE1细胞混匀，以1.25kV/25μF.0.6sec-1的条件进行电击。电击后，细胞在含有G418的培基上进行筛选培养14天。7个抗G418的阳性克隆培养成稳定传代的转染细胞系。
1.4 PCR的方法鉴定转染细胞系中外源p16cDNA的整合
利用引物p16col/co2进行PCR来检测转染细胞中外源p16cDNA的整合。引物序列分别为p16co1：ATGGAGCCTTCGGCTGACT；p16c02：GAGCCTTCTTGGTTCTTTCA。扩增产物长为470bp。反应体系包括：0.6μg基因组DNA，5XPCR缓冲液，200μmoldNTP，30pmolp16col/co2，1μlTaqDNA聚合酶(2u/μl)。扩增条件：94℃变性5分钟，95℃50秒，58℃50秒，72℃50秒扩增35个循环，扩增产物进行凝胶电泳。
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1.5 Northern杂交检测p16基因的表达
按操作手册用TRIZOL的方法抽提细胞总RNA。以含6.0%甲醛的1.0%变性琼脂糖凝胶电泳分离25μgRNA，转移至尼龙膜上，与[α-32P]dCTP标记的全长p16cDNA探针杂交，洗膜后放射自显影。杂交信号经密度扫描分析。
1.6 通过生长曲线比较细胞的生长速度
将1×105细胞接种到6孔板上。每隔24小时对接种细胞进行计数，共进行5天。绘制生长曲线于半对数纸上，计算对数生长期细胞的倍增时间。
1.7 流式细胞计数
用70%的甲醇——PBS固定，混匀，于4℃放置1小时。然后1000rpm离心10分钟收集细胞，再用10μg/ml碘化丙啶(PI)和100μg/mlRNA酶于37℃，重悬细胞，放置30分钟。在由BectonDickison公司出品的FACA型流式细胞仪上进行分析，所得数据用ModFitLT软件进行统计。每种细胞均检测3次，用方差分析的方法进行统计处理。
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1.8 裸鼠接种实验
将约0.5ml(1×107)细胞悬液注入4～8周大小的BALB/C裸鼠皮下。每天观察肿瘤生长的情况。3周后处死小鼠。肿瘤组织进行称重，并用甲醛固定石蜡包埋后制成切片进行病理诊断，免疫组化和原位杂交。
1.9 免疫组化
5μm厚的石蜡切片脱腊入水后与1∶40稀释的兔抗人p16多克隆抗体p16c-20(美国SantaCruz公司)在4℃孵育过夜。再用ABC法进行检测。最后以苏木素复染。
1.10 原位杂交
5μm厚的石蜡切片脱蜡入水后，5mMMgC12/1XPBS冼，0.2N的盐酸浸泡30分钟，5mMEDTA/2XSSC30分钟，42℃，20μg/ml蛋白酶K消化30分钟，再用5mMMgCl2/1XPBS洗，预杂交30分钟37℃，以地高辛标记的p16全长cDNA做探针进行杂交，37℃过夜，洗片后以地高辛检测试剂盒(德国宝灵曼公司)免疫检测显色，核固红复染。
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2 结果
2.1 p16基因转染
为了检测上调p16基因的表达是否能促进鼻咽癌细胞恶性表型的逆转，我们向存在p16基因表达下调的鼻咽癌细胞系HNE1导入全长野生型p16cDNA。通过G418筛选后，挑选7个克隆培养成稳定传代的转染细胞系。我们对其中4个转染细胞系中外源p16cDNA整合和表达的情况进行了检测。利用跨p16基因3个外显子的引物p16col/co2进行PCR来检测外源p16cDNA整合情况(见表1)。外源性p16cDNA的扩增产物约为470bp,而内源性p16基因由于在3个外显子间还插有2个内含子，因此难以检测到扩增产物。图1显示以HNE1作为阴性对照，3个转染细胞系(＃1-1，＃3-2，＃4-2)整合有外源p16cDNA。
表1 转染细胞系pCDKN2WTHEN1的鉴定 克隆编号
外源p16cDNA的整合
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p16mRNA的表达
＃1-1
Y
D
＃1-6
ND
ND
＃2-3
ND
ND
＃3-2
Y
D
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＃3-4
N
D
＃4-2
Y
U
＃4-5
ND
ND
Y，整合；N，未整合；D，下调；U，上调；ND，未检测；
图1 PCR鉴定转染细胞系外源质粒的整合情
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况.用引物p16c01/c02进行护增。转染
细胞系＃1-1、＃3-2and＃4-2中可护增出～
470bp的护增产物。鼻咽癌细胞系HNE1
和转染细胞系＃3-4中无护增产物。
进一步利用Northern杂交的方法检测转染细胞系中p16基因的表达状况。在实验中以p16基因表达正常的宫颈癌细胞系HeLa和结肠癌细胞系SW620作为阳性对照，并以HNE1和没有整合外源p16cDNA的转染细胞系＃3-4作为阴性对照。为了定量准确，在密度扫描时，以转膜前凝胶照片上各组样本的18S和28SRNA带作为内对照。实验发现非转染的鼻咽癌细胞系HNE1和＃3-4转染细胞系p16mRNA的水平明显低于HeLa细胞系和SW620细胞系，而在3个整合了外源p16cDNA的转染的细胞系中，只有一个＃4-2转染细胞系具有高水平表达的p16mRNA(图2)。这一结果说明＃4-2转染细胞系p16基因mRNA表达上调。
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图2 Northern杂交鉴定转染细胞系中p16基
因的表达状况.HeLa细胞、SW620细胞
和p16转染细胞系＃4-2中表达明显的
长约0.8kb的p16mRNA。HNE12和转
染细胞系＃1-1，＃3-2，＃3-4中p16mRNA
的表达下调。以凝胶电泳时溴乙啶染色
后的18S和28S作为内照。
2.2 ＃4-2转染细胞系恶性表型的改变
由于p16基因是一个在细胞周期中起负性调节作用的抑瘤基因，因此，首先通过生长曲线的绘制来观察上调p16基因的表达对细胞生长抑制的作用。从图3中可以看到和HNE1细胞的生长速度相比，＃4-2转染细胞的生长速度明显减慢，两者的倍增时间分别为23.8小时和31.2小时。
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同时以未转染的鼻咽癌细胞系HNE1和整合有外源p16cDNA但p16基因表达无改变的转染细胞系＃3-2为对照，利用流式细胞仪对三种细胞的细胞周期分布进行了检测。表2中显示HNE1和＃3-2转染细胞系细胞周期的分布没有差别(P>0.05)。而＃4-2转染细胞系与上述两种细胞系相比，GO/G1期细胞数明显增多(P<0.05和 P< 0.01)。这一数据提示p16基因的上调导致了停滞于G1期的细胞明显增多，这与对倍增时间的观察结果是一致的。
表2 转染细胞系pCDKN2WTHNE1细胞周期的分布 细胞系
p16mRNA的
表达状况
G0/G1%
S
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G2/M
HNE1
D
88.58±3.28
10.96±3.19
0.46±0.11
＃3-2
D
90.35±0.73
7.74±0.89
1.91±0.62
＃4-2
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U
97.06±0.87
1.30±0.62
1.64±1.40
D，下调；U，上调；
最后，将HNE1、＃3-2和＃4-2三种细胞系分别注入裸鼠皮下以观察这三种细胞的成瘤性。接种HNE1和＃3-2细胞的裸鼠在接种后6天就出现了肿瘤，而接种了＃4-2细胞的裸鼠在接种后11天才有肿瘤生成，说明＃4-2细胞系致瘤的潜伏期比HNE1和＃3-2细胞系延长。3周以后取出肿瘤进行病理诊断均为低分化鳞癌(图4)，免疫组化和原位杂交都显示＃4-2来源的裸鼠肿瘤组织中p16基因的表达明显强于HNE1和＃3-2来源的裸鼠肿瘤组织(图5，6)。但三种细胞系所形成的肿瘤的重量没有明显的差别。
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图3 鼻咽癌细胞系HNE1和转染细胞系
＃4-2细胞的生长曲线。
图4 鼻咽癌转染细胞系异体称植瘤的HE染色(×200)
图5 免疫组化检测异体移植瘤中p16基因的表达状况。
A).转染细胞系＃4-2异体移植植瘤中p16基因的表达。
B).鼻咽癌细胞系HNE1异体移植瘤中p16基因的表达(×400)。
只在＃4-2异体移植瘤中有明显的核着色(如箭头所示)。
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图6 原位杂交检测异体移植瘤中p16基因的表达状况。
A).转染细胞系＃4-2异体移植瘤中p16基因的表达。
B).鼻咽癌细胞系HNE1异体移植瘤中p16基因的表达(×400).
＃4-2异体移植瘤中蓝色着色明显强于HNE1中的(如箭头所示)。
3 讨论
在先前的研究中已发现p16基因在鼻咽癌中存在高频率的失活，本实验进一步确证了p16基因在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用。上调p16基因的表达能有效阻止鼻咽癌细胞系HNE1的生长，延长其倍增时间，使大部分癌细胞停滞在G1期。同时具有p16基因表达上调的鼻咽癌转染细胞系＃4-2在裸鼠体内成瘤的潜伏期比无p16基因表达上调的细胞系延长。但肿瘤的发生是一个多基因改变多阶段的过程，p16基因很可能是鼻咽癌发生的早期起作用，因此，单纯上调p16基因的表达并不能完全逆转鼻咽癌细胞的恶性表型，表现在＃4-2细胞在裸鼠皮下仍能形成肿瘤，且肿瘤的生长速度与对照组没有明显区别。最近，有研究表明除p16基因外其他细胞周期调节基因的改变也可导致人类肿瘤的形成。如在头颈部肿瘤或胶质瘤等多种肿瘤中都分别检测到了周期素D1基因和CDK4基因的扩增〔5，6〕。这也提示我们在鼻咽癌的发病过程中CDK4基因和周期素D1基因可能与p16基因一同发生作用。
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致谢：感谢姚开泰教授和李桂源教授在本文完成过程中给予的支持和帮助。
[编者按：该系列研究(Ⅰ)发表于本刊1999(4)：368～371页]
基金项目：国家杰出青年科学家基金(批准号：39525022)和中华医学基金(CMB)(批准号：90-529)资助。
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收稿日期：1999-04-08；修回日期：1999-05-12, http://www.100md.com