用cDNA阵列研究人肺癌与正常肺及胚肺组织基因表达谱
作者：何志巍 许亮国 任彩萍 谢鹭 姚开泰
单位：湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室(长沙,410078)
关键词：cDNA表达阵列；基因表达谱；肺癌
癌症990501
【摘 要】 目的：研究人肺癌、成人肺及胚肺组织基因表达谱差异，观察肺癌发生中多个基因的作用。方法：用鳞状细胞肺癌、胎儿胚肺、胸外伤部分肺切除肺组织，提取总RNA后逆转录标记cDNA探针，与代表588个基因的AtlasTM cDNA阵列杂交，灰度扫描杂交信号强弱及统计分析差异。结果：肺癌组织中c-myc、c-fos相关基因等多个较正常肺组织表达增加的基因，其中有些基因表达变化与胚胎肺组织相似。结论：多个基因的表达变化在肺癌发生中起作用,且与胚肺基因表达谱相似，而表现出恶性肿瘤发生中的“胚胎化”生物学特性。
, 百拇医药
中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0489-03
Study of the genes expression profile on the tissues of the adult lung cancer,the normal adult lung and the fetal lung
HE Zhi-wei，XU Liang-guo，YAO Kai-tai, et al.
The key laboratory of carcinogenesis of Chinese Ministry of Public Health，Cancer Research Institute of Hunan Medical University, Changsha 410078, P.R. China
, 百拇医药
【Abstract】 Objective：To study the genes expression profile on the tissues of the adult lung cancer,the normal adult lung and the fetal lung, and observe the effect of the changes of gene expression in lung cancer. Methods：The total RNA were respectively extracted from the lung tissues which came from the fetal,the chest hurt and the lung cancer patients. Reverse transcriptase probed the total RNA and the probes respectively hybrided to the Atlas Human cDNA expression arrays. Results：The genes expression level，such as c-myc and c-fos genes，distinctly increased comparing with normal adult lung，but these changes occurred in fetal lung genes expression profile pattern. Conclusion：More than one gene contributed to adult lung cancer and the“fetalized”genes expression pattern also showed in adult lung cancer.
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Key words： cDNA expression array；Gene expression profile；Lung cancer
大多数肿瘤的发生是多个瘤基因或抑瘤基因共同作用的结果，如胃癌中p53、DCC、CD44、nm23、c-myc、c-erb-2、EGFR等多个基因突变或表达异常〔1〕，鼻咽癌与cyclinD1、c-myc、c-ras等基因作用有关〔2〕，而p53、c-myc、PCNA等基因表达异常或突变参与肺癌的发生〔3〕，但是否还存在其它一些生长因子、凋亡调节、信号传导等相关的基因在肺癌中起作用?又如何同时在大范围内观察这些基因的表达变化呢?本文采用目前国际最新的cDNA表达阵列技术,同时检测肺鳞状细胞癌、胚胎肺和成人肺组织588个基因的表达差异，旨在寻找组织相对高表达基因及进一步阐明肿瘤发生的多基因作用特性。
1 材料和方法
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1.1 标本来源
8个月人胚3例，分离肺组织，取6例病理诊断为肺鳞状细胞癌及5例胸外伤部分肺切除组织，均即刻液氮冻存。
1.2 RNA提取
按TRIzol(GIBCO BRL)试剂盒说明书抽提总RNA。用DNase I消化去除gDNA后再抽取总RNA。分光光度计测浓度和纯度，PCR检测有无gDNA存在。取RNA 5ng于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外仪检测摄相。
1.3 放射性标记cDNA探针合成、纯化
按AtlasTM cDNA Expression Arrsy Ⅰ (CLONTE-CH Co.)试剂盒说明书进行，每样品取5 μg总RNA进行α-32P-dATP标记。用Sephdex G-50过柱纯化探针，其此放射活性计数在1×108 cpm/μg DNA以上。
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1.4 杂交、洗膜及放射自显影
AtlasTM cDNA Expression Array与Hybridization Expression Solution(CLONTECH Co.)68℃预杂交2h，加入探针68℃杂交过夜。68℃洗膜三次。用KODAK胶片，YEZ-ELB400型增感屏，70℃曝光3天。显影后将X胶片上于VDS(Image Master VDS-Pharmacia)系统打印成像。
1.5 图像分析
在图像分析仪上,以看家基因G6PDH杂交信号密度为校对值，其它信号与之相比为各基因相对光密度值。
2 结果
2.1 各组织总RNA
提取各组织总RNA,经DNase I消化后PCR检测无gDNA污染，OD260/OD280值均在1.9～2.0之间，电泳检测无降解。见图1。
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图1 各组织总RNA2%琼脂糖凝胶电泳
lane1成人肺，lane2胚胎肺，lane3肺癌
2.2 各组织588个基因的表达谱
将各组织总RNA所标记的cDNA探针分别与cDNA阵列杂交后显影，如图2所示。图中A-G为膜的七个功能区，对应不同功能的基因。G区为看家基因区，如G6PDH、β-actin等。该组照片显示灰度较高而表达明显的基因。
图2 各组织cDNA探针与AtlasTM cDNA Expression Array杂交图谱。
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I：成人肺组织；II：胚胎肺组织；III：肺癌组织
2.3 各组织基因表达谱的差异
将X光片经图像扫描后光密度分析仪分析比较，选出表达最明显的、有差异的基因，如表1示。
3 讨论
传统的对基因表达水平的检测方法有敏感度不够高(如Northern blot)或一次仅能检测单个或几个基因表达(如RT-PCR)或须大规模测序(如SAGE)等局限性，而新近发展起来的cDNA阵列技术，不但可高敏感地定量(5拷贝/细胞)、定性检测基因表达水平,且其最大优点是彻底改变了仅对单个或几个基因表达水平的研究,而同时研究同一组织或不同组织中成千上万个基因的表达〔4,5〕。我们已采用cDNA阵列进行了人鼻咽癌基因表达的初步研究，并发现在鼻咽癌存在多个高表达的基因〔6〕。
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表1 在AtlasTMcDNAExpressionArray中各组织基因表达差异明显的基因* 成人肺组织高表达
人胚肺组织高表达
肺癌组织高表达
B7m：热休克蛋白(27kDa蛋白1)
A1a：Myc原瘤基因
A1a：Myc原瘤基因
A4e：Fos相关抗原2
A4e：Fos相关抗原2
A4g：绒毛蛋白2
A4g：绒毛蛋白2
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C3b：谷胱苷肽转移酶P
B5m：cAMP-依赖性蛋白激酶1型β调节亚单位
B5m：cAMP-依赖性蛋白激酶1型β调节亚单位
D1a：核因子NF-κBP105亚单位
D5a：核敏感DNA结合蛋白
D3b：锌指蛋白91
F4d：胸腺素β-10
D5a：核敏感DNA结合蛋白
D4f：早期生长应答蛋白1
D5a：核敏感DNA结合蛋白
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D3k：鸟嘌呤核酸结合蛋白
G-S(α亚单位)
D1a：核因子NF-κBP105亚单位
D4f：早期生长应答蛋白1
E5c：T细胞表面糖蛋白CD4
E5c：T细胞表面糖蛋白CD4
E5e：T细胞活化抗原[CD27]
F4d：胸腺素β-10
E5e：T细胞活化抗原[CD27]
E5k：B淋巴细胞分化抗原[CD19]
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E5k：B淋巴细胞分化抗原[CD19]
E6a：细胞粘附蛋白AQM1
F6g：白细胞介素10
F6g：白细胞介素10
F4j：钙颗粒素B
F4j：钙颗粒素B
F6b：白细胞介素6(B细胞分化因子)
*表中代号为基因在定位框中之位置，根据代号可查出杂交信号对应的基因名称。大写字母为功能区，阿拉伯数字为列，小写字母为行，如B7m为B区7列m行。
细胞中某种mRNA的量是其编码基因活性的直接反应，并随不同时、空状态下编码基因表达活性的不同而变化。本文采用cDNA表达阵列技术，研究了人胚肺组织、成人肺组织和肺癌组织内588个基因的表达差异，这588个基因覆盖于瘤基因/抑瘤基因、细胞周期调节、凋亡调节、转录因子、细胞粘附、信号传导等14大类，均为严密转录调控下代表人类基因的cDNA序列片段，这些基因与生长发育密切相关〔7〕。结果发现：(1)不同组织高表达基因不同：在肺癌组织中Myc原癌基因、fos相关抗原2、cAMP依赖蛋白激酶1-β、CD40受体相关因子(CRAF1：TNF受体相关因子2)等15个基因高表达；核因子NFKBP105、核敏感元件DNA结合蛋白等12个基因在胚胎肺中高表达；成人肺组织中乌嘌呤核酸结合蛋白G-S(α亚单位)、热休克蛋白27kDa亚单位等6个基因明显高表达；(2)同一基因可在不同组织中高表达：如早期反应蛋白即转录因子ETR103在胚肺及肺癌组织中均高表达；(3)胚肺与肺癌基因表达谱极为相似：如胸腺素β10、转录因子ETR103绒毛蛋白2等10个基因均存在高表达，见图2。高表达基因中部分用RTPCR证实(结果未显示)与文献报道相符〔8〕。
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以上结果表明，不同组织有其相应的基因表达谱模式，并由此构成该组织细胞的生物学功能基础。如在肺癌组织中Myc原癌基因、fos相关抗原2基因、绒毛蛋白2、cAMP依赖性蛋白激酶基因、钙结合蛋白基因等高表达与肺癌的恶性表型有关；肺癌组织中存在较正常成人肺组织多个高表达的基因而与胚胎肺组织基因表达谱相似，由此反映出肺癌组织基因表达的“胚胎化”生物学特征。
基金项目：国家自然科学基金重点项目(39730200)；和美国中华医学会基金项目(96-655)资助
〔参考文献〕
〔1〕 夏建川，张宏伟，吕嵩，等.胃癌发病的分子机理研究〔J〕.国外医学遗传学分册，1998，21(3)：139～143.
〔2〕 Porter PL，Gowm AM，Kramp SG，et al. Widespread p53 overexpression in human malignant tumors. An immunohistochemical study using methacarn-fixed, embedded fissue 〔J〕. Am J Pathol,1992,140(1)：145～153.
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〔3〕 Sun Y. Molecular oncology of human nasopharyngeal carcinoma〔J〕. Cancer J, 1995,8(6)：325～330.
〔4〕 Lockhart DJ,Dong H,Byrne MC,et al. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays〔J〕. Nat Biotechnol,1996,14：1675～1680.
〔5〕 Milosavljevic A, Zeremski M, Strezoska Z, et al. Discovering distinct genes represented in 29 570 clones from infant brain cDNA libraries by applying sequencing by hybridization methodology. Genome Res〔J〕. 1996,6：132～141.
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〔6〕 黎众魁，谢 鹭，何志巍，等.用cDNA表达阵列谱比较鼻咽癌与正常鼻咽组织的基因表达谱差异〔J〕.科学通报,1998,16(22)：2462～2463.
〔7〕 Atlas Human cDNA Expression Array Ⅰ. CLONTECHniques,April1997,XⅡ(2)：4～7.
〔8〕 Sehgal A，Boynton AL，Young RF，et al. Application of the differential hybridization of AtlasTM Human expression arrays technique in the identification of differentially expressed genes in human glioblastoma multiforme tumor tissue〔J〕. J Surg Oncol, 1998,67：234～241.
收稿日期：1999-02-09；修回日期：1999-07-15, http://www.100md.com
单位：湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室(长沙,410078)
关键词：cDNA表达阵列；基因表达谱；肺癌
癌症990501
【摘 要】 目的：研究人肺癌、成人肺及胚肺组织基因表达谱差异，观察肺癌发生中多个基因的作用。方法：用鳞状细胞肺癌、胎儿胚肺、胸外伤部分肺切除肺组织，提取总RNA后逆转录标记cDNA探针，与代表588个基因的AtlasTM cDNA阵列杂交，灰度扫描杂交信号强弱及统计分析差异。结果：肺癌组织中c-myc、c-fos相关基因等多个较正常肺组织表达增加的基因，其中有些基因表达变化与胚胎肺组织相似。结论：多个基因的表达变化在肺癌发生中起作用,且与胚肺基因表达谱相似，而表现出恶性肿瘤发生中的“胚胎化”生物学特性。
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中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0489-03
Study of the genes expression profile on the tissues of the adult lung cancer,the normal adult lung and the fetal lung
HE Zhi-wei，XU Liang-guo，YAO Kai-tai, et al.
The key laboratory of carcinogenesis of Chinese Ministry of Public Health，Cancer Research Institute of Hunan Medical University, Changsha 410078, P.R. China
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【Abstract】 Objective：To study the genes expression profile on the tissues of the adult lung cancer,the normal adult lung and the fetal lung, and observe the effect of the changes of gene expression in lung cancer. Methods：The total RNA were respectively extracted from the lung tissues which came from the fetal,the chest hurt and the lung cancer patients. Reverse transcriptase probed the total RNA and the probes respectively hybrided to the Atlas Human cDNA expression arrays. Results：The genes expression level，such as c-myc and c-fos genes，distinctly increased comparing with normal adult lung，but these changes occurred in fetal lung genes expression profile pattern. Conclusion：More than one gene contributed to adult lung cancer and the“fetalized”genes expression pattern also showed in adult lung cancer.
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Key words： cDNA expression array；Gene expression profile；Lung cancer
大多数肿瘤的发生是多个瘤基因或抑瘤基因共同作用的结果，如胃癌中p53、DCC、CD44、nm23、c-myc、c-erb-2、EGFR等多个基因突变或表达异常〔1〕，鼻咽癌与cyclinD1、c-myc、c-ras等基因作用有关〔2〕，而p53、c-myc、PCNA等基因表达异常或突变参与肺癌的发生〔3〕，但是否还存在其它一些生长因子、凋亡调节、信号传导等相关的基因在肺癌中起作用?又如何同时在大范围内观察这些基因的表达变化呢?本文采用目前国际最新的cDNA表达阵列技术,同时检测肺鳞状细胞癌、胚胎肺和成人肺组织588个基因的表达差异，旨在寻找组织相对高表达基因及进一步阐明肿瘤发生的多基因作用特性。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本来源
8个月人胚3例，分离肺组织，取6例病理诊断为肺鳞状细胞癌及5例胸外伤部分肺切除组织，均即刻液氮冻存。
1.2 RNA提取
按TRIzol(GIBCO BRL)试剂盒说明书抽提总RNA。用DNase I消化去除gDNA后再抽取总RNA。分光光度计测浓度和纯度，PCR检测有无gDNA存在。取RNA 5ng于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外仪检测摄相。
1.3 放射性标记cDNA探针合成、纯化
按AtlasTM cDNA Expression Arrsy Ⅰ (CLONTE-CH Co.)试剂盒说明书进行，每样品取5 μg总RNA进行α-32P-dATP标记。用Sephdex G-50过柱纯化探针，其此放射活性计数在1×108 cpm/μg DNA以上。
, 百拇医药
1.4 杂交、洗膜及放射自显影
AtlasTM cDNA Expression Array与Hybridization Expression Solution(CLONTECH Co.)68℃预杂交2h，加入探针68℃杂交过夜。68℃洗膜三次。用KODAK胶片，YEZ-ELB400型增感屏，70℃曝光3天。显影后将X胶片上于VDS(Image Master VDS-Pharmacia)系统打印成像。
1.5 图像分析
在图像分析仪上,以看家基因G6PDH杂交信号密度为校对值，其它信号与之相比为各基因相对光密度值。
2 结果
2.1 各组织总RNA
提取各组织总RNA,经DNase I消化后PCR检测无gDNA污染，OD260/OD280值均在1.9～2.0之间，电泳检测无降解。见图1。
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图1 各组织总RNA2%琼脂糖凝胶电泳
lane1成人肺，lane2胚胎肺，lane3肺癌
2.2 各组织588个基因的表达谱
将各组织总RNA所标记的cDNA探针分别与cDNA阵列杂交后显影，如图2所示。图中A-G为膜的七个功能区，对应不同功能的基因。G区为看家基因区，如G6PDH、β-actin等。该组照片显示灰度较高而表达明显的基因。
图2 各组织cDNA探针与AtlasTM cDNA Expression Array杂交图谱。
, 百拇医药
I：成人肺组织；II：胚胎肺组织；III：肺癌组织
2.3 各组织基因表达谱的差异
将X光片经图像扫描后光密度分析仪分析比较，选出表达最明显的、有差异的基因，如表1示。
3 讨论
传统的对基因表达水平的检测方法有敏感度不够高(如Northern blot)或一次仅能检测单个或几个基因表达(如RT-PCR)或须大规模测序(如SAGE)等局限性，而新近发展起来的cDNA阵列技术，不但可高敏感地定量(5拷贝/细胞)、定性检测基因表达水平,且其最大优点是彻底改变了仅对单个或几个基因表达水平的研究,而同时研究同一组织或不同组织中成千上万个基因的表达〔4,5〕。我们已采用cDNA阵列进行了人鼻咽癌基因表达的初步研究，并发现在鼻咽癌存在多个高表达的基因〔6〕。
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表1 在AtlasTMcDNAExpressionArray中各组织基因表达差异明显的基因* 成人肺组织高表达
人胚肺组织高表达
肺癌组织高表达
B7m：热休克蛋白(27kDa蛋白1)
A1a：Myc原瘤基因
A1a：Myc原瘤基因
A4e：Fos相关抗原2
A4e：Fos相关抗原2
A4g：绒毛蛋白2
A4g：绒毛蛋白2
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C3b：谷胱苷肽转移酶P
B5m：cAMP-依赖性蛋白激酶1型β调节亚单位
B5m：cAMP-依赖性蛋白激酶1型β调节亚单位
D1a：核因子NF-κBP105亚单位
D5a：核敏感DNA结合蛋白
D3b：锌指蛋白91
F4d：胸腺素β-10
D5a：核敏感DNA结合蛋白
D4f：早期生长应答蛋白1
D5a：核敏感DNA结合蛋白
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D3k：鸟嘌呤核酸结合蛋白
G-S(α亚单位)
D1a：核因子NF-κBP105亚单位
D4f：早期生长应答蛋白1
E5c：T细胞表面糖蛋白CD4
E5c：T细胞表面糖蛋白CD4
E5e：T细胞活化抗原[CD27]
F4d：胸腺素β-10
E5e：T细胞活化抗原[CD27]
E5k：B淋巴细胞分化抗原[CD19]
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E5k：B淋巴细胞分化抗原[CD19]
E6a：细胞粘附蛋白AQM1
F6g：白细胞介素10
F6g：白细胞介素10
F4j：钙颗粒素B
F4j：钙颗粒素B
F6b：白细胞介素6(B细胞分化因子)
*表中代号为基因在定位框中之位置，根据代号可查出杂交信号对应的基因名称。大写字母为功能区，阿拉伯数字为列，小写字母为行，如B7m为B区7列m行。
细胞中某种mRNA的量是其编码基因活性的直接反应，并随不同时、空状态下编码基因表达活性的不同而变化。本文采用cDNA表达阵列技术，研究了人胚肺组织、成人肺组织和肺癌组织内588个基因的表达差异，这588个基因覆盖于瘤基因/抑瘤基因、细胞周期调节、凋亡调节、转录因子、细胞粘附、信号传导等14大类，均为严密转录调控下代表人类基因的cDNA序列片段，这些基因与生长发育密切相关〔7〕。结果发现：(1)不同组织高表达基因不同：在肺癌组织中Myc原癌基因、fos相关抗原2、cAMP依赖蛋白激酶1-β、CD40受体相关因子(CRAF1：TNF受体相关因子2)等15个基因高表达；核因子NFKBP105、核敏感元件DNA结合蛋白等12个基因在胚胎肺中高表达；成人肺组织中乌嘌呤核酸结合蛋白G-S(α亚单位)、热休克蛋白27kDa亚单位等6个基因明显高表达；(2)同一基因可在不同组织中高表达：如早期反应蛋白即转录因子ETR103在胚肺及肺癌组织中均高表达；(3)胚肺与肺癌基因表达谱极为相似：如胸腺素β10、转录因子ETR103绒毛蛋白2等10个基因均存在高表达，见图2。高表达基因中部分用RTPCR证实(结果未显示)与文献报道相符〔8〕。
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以上结果表明，不同组织有其相应的基因表达谱模式，并由此构成该组织细胞的生物学功能基础。如在肺癌组织中Myc原癌基因、fos相关抗原2基因、绒毛蛋白2、cAMP依赖性蛋白激酶基因、钙结合蛋白基因等高表达与肺癌的恶性表型有关；肺癌组织中存在较正常成人肺组织多个高表达的基因而与胚胎肺组织基因表达谱相似，由此反映出肺癌组织基因表达的“胚胎化”生物学特征。
基金项目：国家自然科学基金重点项目(39730200)；和美国中华医学会基金项目(96-655)资助
〔参考文献〕
〔1〕 夏建川，张宏伟，吕嵩，等.胃癌发病的分子机理研究〔J〕.国外医学遗传学分册，1998，21(3)：139～143.
〔2〕 Porter PL，Gowm AM，Kramp SG，et al. Widespread p53 overexpression in human malignant tumors. An immunohistochemical study using methacarn-fixed, embedded fissue 〔J〕. Am J Pathol,1992,140(1)：145～153.
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〔3〕 Sun Y. Molecular oncology of human nasopharyngeal carcinoma〔J〕. Cancer J, 1995,8(6)：325～330.
〔4〕 Lockhart DJ,Dong H,Byrne MC,et al. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays〔J〕. Nat Biotechnol,1996,14：1675～1680.
〔5〕 Milosavljevic A, Zeremski M, Strezoska Z, et al. Discovering distinct genes represented in 29 570 clones from infant brain cDNA libraries by applying sequencing by hybridization methodology. Genome Res〔J〕. 1996,6：132～141.
, 百拇医药
〔6〕 黎众魁，谢 鹭，何志巍，等.用cDNA表达阵列谱比较鼻咽癌与正常鼻咽组织的基因表达谱差异〔J〕.科学通报,1998,16(22)：2462～2463.
〔7〕 Atlas Human cDNA Expression Array Ⅰ. CLONTECHniques,April1997,XⅡ(2)：4～7.
〔8〕 Sehgal A，Boynton AL，Young RF，et al. Application of the differential hybridization of AtlasTM Human expression arrays technique in the identification of differentially expressed genes in human glioblastoma multiforme tumor tissue〔J〕. J Surg Oncol, 1998,67：234～241.
收稿日期：1999-02-09；修回日期：1999-07-15, http://www.100md.com