p53、nm23基因在喉鳞癌中的异常表达
作者：邹华 李海刚 关中 陈洁珠
单位：邹华 关中 陈洁珠，中山医科大学孙逸仙纪念医院耳鼻喉科(广州，510120)；李海刚，中山医科大学孙逸仙纪念医院病理科
关键词：喉肿瘤；p53；nm23；蛋白表达
癌症990521 【摘 要】 目的：探讨p53、nm23基因在喉鳞癌中的异常表达与预后的关系。方法：应用免疫组织化学方法对39例喉鳞癌石蜡标本进行p53蛋白、nm23蛋白检测。结果：18例(46.1%)喉癌呈p53过度表达；29例(74.4%)喉癌呈nm23阳性表达。p53蛋白的阳性过度表达与nm23阳性表达与喉癌的临床分期、颈淋巴结转移及5年生存率密切相关。结论：p53蛋白、nm23蛋白表达可作为临床预测喉癌颈淋巴结转移及预后的重要参考指标。
中图分类号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0560-03
, 百拇医药
The abnormal expression of p53 and nm23 genes in larynx sguamous carcinoma
ZHOU Hua,LI Hai-gang,GUAN Zhong,et al.
Sun Yat-sen Memorial Hospital,SUMS,Guangzhou 510120,P.R. China
【Abstract】 Objectives：To observe the correlation between the expression of p53,nm23 protein and the clinical staging and prognosis of human laryngeal squamous cell carcinoma (SCC). Methods：p53 and nm23 protein expression were detected by immunohistochemical technique with formalin fixed paraffin embedded specimens from 39 patients with SCC of larynx. Results：The positive rates of p53 and nm23 were 46.1% (18/39) and 74.4% (29/39) respectively. Regardless of age,sex,and pathologic types,the positive rates of p53 and nm23 were related to clinical staging,neck lymph node metastasis and five-year survival rate of SCC of larynx. Conclusion：The detection of p53 and nm23 may be considered as indicators for neck lymph node metastasis and prognosis of human laryngeal squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Key words：Laryngeal neoplasm;p53;nm23;Protein expression
p53抑癌基因的丢失或突变与人体多种肿瘤的发生发展有密切关系，而肿瘤抑制因子nm23则与肿瘤的转移有关。为了了解喉鳞癌和癌旁正常组织中p53、nm23表达的情况，我们应用免疫组化方法检测喉鳞癌、癌旁正常组织中p53及nm23基因表达的情况，探讨p53、nm23基因在喉鳞癌中的异常表达及与肿瘤的临床分期、颈淋巴结转移、病理类型及术后5年生存率的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
取我院自1987年至1992年经手术切除病理确诊、临床资料完整的喉鳞癌标本蜡块39例，其中男37例，女2例。年龄50～80岁，平均年龄62岁。病程为1月至2年不等，按1987年UICC分型分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期8例，其中伴颈淋巴结转移14例(35.9%)。检测癌旁正常组织30例。
, 百拇医药
1.2 免疫组化染色
p53、nm23单克隆抗体和S-PKits均购自福建迈新公司，按S-P法操作，其中作p53染色的切片，先用微波炉作抗原修复处理。已知阳性食管鳞癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。DAB显色。
1.3 结果判定
p53阳性定位于细胞核，nm23阳性定位于细胞浆。
根据阳性比例分为：-：无阳性细胞；+：阳性细胞<20%；++：阳性细胞20%～50%；+++：阳性细胞≥50%。
1.4 统计学分析
采用SSPS统计软件，各组间差异采用卡方分析和精确概率法进行统计分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 p53，nm23阳性率
在喉癌组织中，p53蛋白表达的阳性率为46.1%(18/39)，nm23的阳性率74.4%(29/39)，癌旁正常组织nm23的阳性率为80%(24/30)，而p53蛋白无阳性表达。详见表1。
2.2 p53、nm23表达与喉癌临床分期、颈淋巴结转移的关系
p53、nm23阳性表达与喉癌临床分期、颈淋巴结转移患者有密切关系，即：Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者p53蛋白表达阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，而nm23表达则相反。p53、nm23阳性表达与肿瘤病理类型、患者的年龄和性别无关。详见表2。
表1 喉癌和癌旁正常组织p53、nm23的表达 组 织
例数
p53表达(例)
, 百拇医药
阳性率
阳性率(%)
阳性率
-
+
++
+++
(%)
-
+
++
+++
(%)
, 百拇医药 喉鳞癌
39
21
2
6
10
46.1
10
19
5
5
74.4
癌旁正常组织
30
, 百拇医药
30
0
0
0
0
6
3
3
18
80.0
表2 p53、nm23表达与喉癌临床分期、颈淋巴结转移的关系 项 目
例数
p53表达
, 百拇医药
P值
nm23
P值
阴性
阳性
阴性
阳性
临床分期：
Ⅰ～Ⅱ
21
15
6
<0.05
, 百拇医药 2
19
<0.05
Ⅲ～Ⅳ
18
6
12
8
10
淋巴结转移：
有
14
4
10
, http://www.100md.com
<0.05
8
6
<0.05
无
25
17
8
2
23
病理类型：
高分化
6
3
, 百拇医药
3
>0.05
1
5
>0.05
中分化
5
3
2
1
4
低分化
28
15
, 百拇医药
13
8
20
2.3 随访情况
39例患者手术后随访5年，5年内死亡13例，死亡率为33.3%(13/39)。在5年内死亡13例中，p53蛋白阳性9例，阳性率为69.2%，超过5年生存的26例中，p53蛋白阳性9例，阳性率为34.62%，虽然生存时间少于5年者其p53蛋白阳性率比生存时间超过5年者高，但两者无统计学差异；在5年内死亡13例中，nm23阳性5例，阳性率为38.46%，超过5年生存的26例中，nm23阳性24例，阳性率为92.31%，两者有统计学差异，即生存超过5年者其nm23阳性率显著高于生存时间少于5年者。详见表3。表3 p53蛋白和nm23表达与五年死亡率的关系 蛋白表达
生存期(例)
, 百拇医药
P值
<5年
>5年
总例数
13
26
p53阳性
9
9
>0.05
nm23阳性
5
24
, http://www.100md.com <0.05
3 讨论
p53可以抑制细胞的生长和分裂，并能抑制癌基因活动，当p53基因发生突变时可产生突变型p53蛋白。突变型p53蛋白可抑制野生型p53的活性或使之失活，从而引起细胞的转化和癌变。由于野生型p53半衰期短，一般情况下用免疫组化法检测不到，检测到的p53往往是突变型的p53蛋白在肿瘤细胞内的积聚〔1〕。Maestro〔2〕等发现60%喉癌患者存在着p53异常及相应蛋白质的过度表达，而国内有关喉癌DNA序列分析也表明p53基因突变对判断其恶性程度及估计预后有参考意义〔3〕。
在Gasparini〔4〕等对头颈癌包括喉癌的报道中，显示p53蛋白的表达与肿瘤临床分期及淋巴结转移明显相关，p53蛋白的表达者多为临床晚期，临床恶性度较高。本文对39例不同时期的喉鳞癌标本检测p53蛋白表达发现，18例呈阳性反应(46.1%)，其中强阳性10例。在30例癌旁正常组织中，p53蛋白均无表达。p53蛋白的表达与患者的年龄、性别、病理类型无关。但其阳性表达在临床Ⅰ～Ⅱ期低于Ⅲ～Ⅳ期，差异有显著性。结果与文献报道类似〔4，5〕。在与颈淋巴结转移的关系研究中，有转移者，p53蛋白阳性率高于无转移者，两者有显著性差异。p53蛋白表达与随访者的5年生存率有关，在13例死亡病人中，p53阳性者率为69.2%，在生存期超过5年者，p53阳性者率为34.62%。我们的结果说明p53蛋白的过度表达不仅与喉鳞癌的发生发展有关，并且在喉癌颈淋巴结转移等方面也可能起重要作用。p53蛋白阳性表达率越高，5年生存率越低。
, 百拇医药
转移抑制基因nm23是由steeg〔6〕等于1988年最先发现的，通过特异性的克隆杂交证实nm23在高低转移的鼠K-1735黑色素瘤细胞系中的表达不同，且高转移潜能的细胞系其nm23表达较低，从而将其与转移潜能联系起来。
在人类肿瘤中，乳腺癌、胃癌及卵巢癌中nm23基因的表达与淋巴结转移呈负相关，大多数正常组织中，nm23呈低表达。这提示nm23基因在肿瘤的中晚期表达减弱，在抑制喉癌淋巴结转移作用方面也减弱。其机理可能是由于肿瘤早期生长旺盛，nm23高水平表达，肿瘤细胞营养充分，细胞极少运动，不发生转移，到中后期，营养受限，生长受抑，nm23表达下降，细胞运动、浸润增强，突破基底膜，因而发生转移〔7〕。但本组病例发现，在癌旁正常组织中，nm23的阳性表达率为81.5%，而喉癌组织为69.2%，两者无显著性差异，这与Kodera〔8〕胃癌研究的结果相似，而与乳腺癌〔9〕的结果相反，提示肿瘤组织nm23基因表达的水平因荷瘤器官的不同而不同。
, 百拇医药
我们的研究显示，nm23蛋白表达与患者年龄、性别、病理类型无明显关系。喉癌组织中nm23蛋白的表达与喉癌的临床分期、颈淋巴结转移密切相关，其阳性表达在早期高于晚期，有颈淋巴结转移者，其阳性表达低于无颈淋巴结转移者，说明nm23阳性表达率越高，临床分期越早，颈淋巴结转移发生越少。13例死亡病例中，nm23阳性率为38.5%；在生存期超过5年者中，nm23的阳性率为92.31%，两者有显著性差异。说明nm23阳性率越高，患者的5年生存率越高，也证实了nm23蛋白具有抑制肿瘤生长、发展和转移的作用。
喉癌的临床分期、颈淋巴结转移及5年生存率与p53、nm23蛋白表达密切相关，提示p53、nm23蛋白的检测可作为临床预测喉癌颈淋巴结转移及预后的重要参考指标。
〔参考文献〕
〔1〕 纪小龙、施作霖主编.诊断免疫组织化学〔M〕.北京：军事医学科学出版社,1997：63～66.
, 百拇医药
〔2〕 Maestro R,Dolcetti R,Gasparotto D. et al. High frequency of p53 gene alterations associated with protein overexpression in human squamous cell carcinoma of the larynx〔J〕. Oncogene,1992,7：1159～1166.
〔3〕 李一伟.喉鳞癌p53基因突变与癌恶性度的关系〔J〕.中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30：101～104.
〔4〕 Gasparini G,Weidner N,Maluta S,et al. Intratumoral microvessel density and p53 protein：correlation with metastasis in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕. Int J Cancer,1993,55：739～744.
, http://www.100md.com
〔5〕 Field JK,Spandidos DA,Malliri A,et al. Elavated p53 expression correlates with a history of heavy smoking in squamous cell carcinoma of the head and neck〔J〕. Br J Cancer,1991,64：573～577.
〔6〕 Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential〔J〕. J Natl Cancer Inst,1988,80：200～204.
〔7〕 叶颖江.人体肿瘤23基因不同水平的研究.国外医学(肿瘤学分册,1996,(增刊)：11～13.
, 百拇医药 〔8〕 Kodera Y,Isobe K,Yamauchi M et al. Expression of nm23 RNA levels in human gastric cancer tissues A negative correlation with nodal metastasis〔J〕. Cancer,1994,73：259～265.
〔9〕 Tokunaga Y,Urano T,Furukawa K,et al. Reduced expression of nm23-H1,but not of nm23-H2 is concordant with the frequency of lymph-node metastasis of human breast cancer〔J〕. Int J Cancer,1993,55：66～71.
收稿日期：1999-06-03, 百拇医药
单位：邹华 关中 陈洁珠，中山医科大学孙逸仙纪念医院耳鼻喉科(广州，510120)；李海刚，中山医科大学孙逸仙纪念医院病理科
关键词：喉肿瘤；p53；nm23；蛋白表达
癌症990521 【摘 要】 目的：探讨p53、nm23基因在喉鳞癌中的异常表达与预后的关系。方法：应用免疫组织化学方法对39例喉鳞癌石蜡标本进行p53蛋白、nm23蛋白检测。结果：18例(46.1%)喉癌呈p53过度表达；29例(74.4%)喉癌呈nm23阳性表达。p53蛋白的阳性过度表达与nm23阳性表达与喉癌的临床分期、颈淋巴结转移及5年生存率密切相关。结论：p53蛋白、nm23蛋白表达可作为临床预测喉癌颈淋巴结转移及预后的重要参考指标。
中图分类号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0560-03
, 百拇医药
The abnormal expression of p53 and nm23 genes in larynx sguamous carcinoma
ZHOU Hua,LI Hai-gang,GUAN Zhong,et al.
Sun Yat-sen Memorial Hospital,SUMS,Guangzhou 510120,P.R. China
【Abstract】 Objectives：To observe the correlation between the expression of p53,nm23 protein and the clinical staging and prognosis of human laryngeal squamous cell carcinoma (SCC). Methods：p53 and nm23 protein expression were detected by immunohistochemical technique with formalin fixed paraffin embedded specimens from 39 patients with SCC of larynx. Results：The positive rates of p53 and nm23 were 46.1% (18/39) and 74.4% (29/39) respectively. Regardless of age,sex,and pathologic types,the positive rates of p53 and nm23 were related to clinical staging,neck lymph node metastasis and five-year survival rate of SCC of larynx. Conclusion：The detection of p53 and nm23 may be considered as indicators for neck lymph node metastasis and prognosis of human laryngeal squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Key words：Laryngeal neoplasm;p53;nm23;Protein expression
p53抑癌基因的丢失或突变与人体多种肿瘤的发生发展有密切关系，而肿瘤抑制因子nm23则与肿瘤的转移有关。为了了解喉鳞癌和癌旁正常组织中p53、nm23表达的情况，我们应用免疫组化方法检测喉鳞癌、癌旁正常组织中p53及nm23基因表达的情况，探讨p53、nm23基因在喉鳞癌中的异常表达及与肿瘤的临床分期、颈淋巴结转移、病理类型及术后5年生存率的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
取我院自1987年至1992年经手术切除病理确诊、临床资料完整的喉鳞癌标本蜡块39例，其中男37例，女2例。年龄50～80岁，平均年龄62岁。病程为1月至2年不等，按1987年UICC分型分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期8例，其中伴颈淋巴结转移14例(35.9%)。检测癌旁正常组织30例。
, 百拇医药
1.2 免疫组化染色
p53、nm23单克隆抗体和S-PKits均购自福建迈新公司，按S-P法操作，其中作p53染色的切片，先用微波炉作抗原修复处理。已知阳性食管鳞癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。DAB显色。
1.3 结果判定
p53阳性定位于细胞核，nm23阳性定位于细胞浆。
根据阳性比例分为：-：无阳性细胞；+：阳性细胞<20%；++：阳性细胞20%～50%；+++：阳性细胞≥50%。
1.4 统计学分析
采用SSPS统计软件，各组间差异采用卡方分析和精确概率法进行统计分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 p53，nm23阳性率
在喉癌组织中，p53蛋白表达的阳性率为46.1%(18/39)，nm23的阳性率74.4%(29/39)，癌旁正常组织nm23的阳性率为80%(24/30)，而p53蛋白无阳性表达。详见表1。
2.2 p53、nm23表达与喉癌临床分期、颈淋巴结转移的关系
p53、nm23阳性表达与喉癌临床分期、颈淋巴结转移患者有密切关系，即：Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者p53蛋白表达阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，而nm23表达则相反。p53、nm23阳性表达与肿瘤病理类型、患者的年龄和性别无关。详见表2。
表1 喉癌和癌旁正常组织p53、nm23的表达 组 织
例数
p53表达(例)
, 百拇医药
阳性率
阳性率(%)
阳性率
-
+
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+++
(%)
-
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(%)
, 百拇医药 喉鳞癌
39
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2
6
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46.1
10
19
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5
74.4
癌旁正常组织
30
, 百拇医药
30
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80.0
表2 p53、nm23表达与喉癌临床分期、颈淋巴结转移的关系 项 目
例数
p53表达
, 百拇医药
P值
nm23
P值
阴性
阳性
阴性
阳性
临床分期：
Ⅰ～Ⅱ
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Ⅲ～Ⅳ
18
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10
淋巴结转移：
有
14
4
10
, http://www.100md.com
<0.05
8
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无
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17
8
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23
病理类型：
高分化
6
3
, 百拇医药
3
>0.05
1
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中分化
5
3
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低分化
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, 百拇医药
13
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2.3 随访情况
39例患者手术后随访5年，5年内死亡13例，死亡率为33.3%(13/39)。在5年内死亡13例中，p53蛋白阳性9例，阳性率为69.2%，超过5年生存的26例中，p53蛋白阳性9例，阳性率为34.62%，虽然生存时间少于5年者其p53蛋白阳性率比生存时间超过5年者高，但两者无统计学差异；在5年内死亡13例中，nm23阳性5例，阳性率为38.46%，超过5年生存的26例中，nm23阳性24例，阳性率为92.31%，两者有统计学差异，即生存超过5年者其nm23阳性率显著高于生存时间少于5年者。详见表3。表3 p53蛋白和nm23表达与五年死亡率的关系 蛋白表达
生存期(例)
, 百拇医药
P值
<5年
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总例数
13
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p53阳性
9
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nm23阳性
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3 讨论
p53可以抑制细胞的生长和分裂，并能抑制癌基因活动，当p53基因发生突变时可产生突变型p53蛋白。突变型p53蛋白可抑制野生型p53的活性或使之失活，从而引起细胞的转化和癌变。由于野生型p53半衰期短，一般情况下用免疫组化法检测不到，检测到的p53往往是突变型的p53蛋白在肿瘤细胞内的积聚〔1〕。Maestro〔2〕等发现60%喉癌患者存在着p53异常及相应蛋白质的过度表达，而国内有关喉癌DNA序列分析也表明p53基因突变对判断其恶性程度及估计预后有参考意义〔3〕。
在Gasparini〔4〕等对头颈癌包括喉癌的报道中，显示p53蛋白的表达与肿瘤临床分期及淋巴结转移明显相关，p53蛋白的表达者多为临床晚期，临床恶性度较高。本文对39例不同时期的喉鳞癌标本检测p53蛋白表达发现，18例呈阳性反应(46.1%)，其中强阳性10例。在30例癌旁正常组织中，p53蛋白均无表达。p53蛋白的表达与患者的年龄、性别、病理类型无关。但其阳性表达在临床Ⅰ～Ⅱ期低于Ⅲ～Ⅳ期，差异有显著性。结果与文献报道类似〔4，5〕。在与颈淋巴结转移的关系研究中，有转移者，p53蛋白阳性率高于无转移者，两者有显著性差异。p53蛋白表达与随访者的5年生存率有关，在13例死亡病人中，p53阳性者率为69.2%，在生存期超过5年者，p53阳性者率为34.62%。我们的结果说明p53蛋白的过度表达不仅与喉鳞癌的发生发展有关，并且在喉癌颈淋巴结转移等方面也可能起重要作用。p53蛋白阳性表达率越高，5年生存率越低。
, 百拇医药
转移抑制基因nm23是由steeg〔6〕等于1988年最先发现的，通过特异性的克隆杂交证实nm23在高低转移的鼠K-1735黑色素瘤细胞系中的表达不同，且高转移潜能的细胞系其nm23表达较低，从而将其与转移潜能联系起来。
在人类肿瘤中，乳腺癌、胃癌及卵巢癌中nm23基因的表达与淋巴结转移呈负相关，大多数正常组织中，nm23呈低表达。这提示nm23基因在肿瘤的中晚期表达减弱，在抑制喉癌淋巴结转移作用方面也减弱。其机理可能是由于肿瘤早期生长旺盛，nm23高水平表达，肿瘤细胞营养充分，细胞极少运动，不发生转移，到中后期，营养受限，生长受抑，nm23表达下降，细胞运动、浸润增强，突破基底膜，因而发生转移〔7〕。但本组病例发现，在癌旁正常组织中，nm23的阳性表达率为81.5%，而喉癌组织为69.2%，两者无显著性差异，这与Kodera〔8〕胃癌研究的结果相似，而与乳腺癌〔9〕的结果相反，提示肿瘤组织nm23基因表达的水平因荷瘤器官的不同而不同。
, 百拇医药
我们的研究显示，nm23蛋白表达与患者年龄、性别、病理类型无明显关系。喉癌组织中nm23蛋白的表达与喉癌的临床分期、颈淋巴结转移密切相关，其阳性表达在早期高于晚期，有颈淋巴结转移者，其阳性表达低于无颈淋巴结转移者，说明nm23阳性表达率越高，临床分期越早，颈淋巴结转移发生越少。13例死亡病例中，nm23阳性率为38.5%；在生存期超过5年者中，nm23的阳性率为92.31%，两者有显著性差异。说明nm23阳性率越高，患者的5年生存率越高，也证实了nm23蛋白具有抑制肿瘤生长、发展和转移的作用。
喉癌的临床分期、颈淋巴结转移及5年生存率与p53、nm23蛋白表达密切相关，提示p53、nm23蛋白的检测可作为临床预测喉癌颈淋巴结转移及预后的重要参考指标。
〔参考文献〕
〔1〕 纪小龙、施作霖主编.诊断免疫组织化学〔M〕.北京：军事医学科学出版社,1997：63～66.
, 百拇医药
〔2〕 Maestro R,Dolcetti R,Gasparotto D. et al. High frequency of p53 gene alterations associated with protein overexpression in human squamous cell carcinoma of the larynx〔J〕. Oncogene,1992,7：1159～1166.
〔3〕 李一伟.喉鳞癌p53基因突变与癌恶性度的关系〔J〕.中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30：101～104.
〔4〕 Gasparini G,Weidner N,Maluta S,et al. Intratumoral microvessel density and p53 protein：correlation with metastasis in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕. Int J Cancer,1993,55：739～744.
, http://www.100md.com
〔5〕 Field JK,Spandidos DA,Malliri A,et al. Elavated p53 expression correlates with a history of heavy smoking in squamous cell carcinoma of the head and neck〔J〕. Br J Cancer,1991,64：573～577.
〔6〕 Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential〔J〕. J Natl Cancer Inst,1988,80：200～204.
〔7〕 叶颖江.人体肿瘤23基因不同水平的研究.国外医学(肿瘤学分册,1996,(增刊)：11～13.
, 百拇医药 〔8〕 Kodera Y,Isobe K,Yamauchi M et al. Expression of nm23 RNA levels in human gastric cancer tissues A negative correlation with nodal metastasis〔J〕. Cancer,1994,73：259～265.
〔9〕 Tokunaga Y,Urano T,Furukawa K,et al. Reduced expression of nm23-H1,but not of nm23-H2 is concordant with the frequency of lymph-node metastasis of human breast cancer〔J〕. Int J Cancer,1993,55：66～71.
收稿日期：1999-06-03, 百拇医药