三氧化二砷(As2O3)诱导人肺腺癌GLC-82细胞凋亡及分子机制的研究
作者：邓友平 林晨※ 张雪艳 陈洁平 肖培根 吴旻
单位：邓友平 肖培根，中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所(北京，100094)；林晨※ 张雪艳 陈洁平 吴旻，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室(北京，100021) ※通讯作者
关键词：三氧化二砷；人肺腺癌GLC-82细胞；细胞凋亡；基因表达
癌症990517 【摘 要】 目的：探讨As2O3对人肺腺癌GLC-82细胞系抑制生长、诱导凋亡的生物学效应及作用机制。方法：通过MTT还原法检测As2O3对该细胞系生长的影响；用光学显微镜、流式细胞仪、DNA凝胶电泳和细胞凋亡原位检测(TUNEL)研究As2O3诱导细胞凋亡的情况；用RT-PCR、Northern blot或Western blot分析As2O3对c-myc、p53、p16和bcl-X等基因表达的影响。结果：As2O3能抑制GLC-82细胞的生长。As2O3处理GLC-82细胞后，光学显微镜下可见到明显的凋亡细胞，细胞周期的G1期前有低于2倍体的凋亡峰，DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征：DNA有规律断裂形成的梯状图谱，蛋白水平的检测表明As2O3可使细胞c-myc基因表达下降，p16和p53表达升高。结论：As2O3能显著抑制GLC-82细胞生长、诱导细胞凋亡，并主要通过调节c-myc，p16和p53等基因的表达来实现。
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中图分类号：R73-361 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0545-05
Studies on arsenic trioxide induced human pulmonary adenocarcinoma GLC-82 cell apoptosis and its molecular mechanisms
DENG You-ping,LIN Chen,ZHANG Xue-yan,et al.
National Laboratory of Molecular Oncology,Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, Beijing 100021,P.R. China
, 百拇医药
【Abstract】 Objective：To study the biological effect of As2O3 on human pulmonary adenocarcinoma GLC-82 cells and its mechanisms. Methods：MTT reduction assay,morphology investigation,flowcytometric analysis,DNA gel electrophoresis and TUNEL,RT-PCR,Northern blot, Western blot methods were perfomed. Results：As2O3 inhibited the growth of GLC-82 cell line. The cells treated with As2O3 showed a typical apoptotic morphology and hypodiploid peak before G1 phase. DNA of treated GLC-82 cells appeared a ladder pattern characteristic of apoptosis. In situ cell death detection analysis also revealed the DNA fragmentation. Besides,As2O3 inhibited c-myc gene expression and increased p53 and p16 gene expression. Conclusion：As2O3 can induce GLC-82 cell apoptosis mainly with regulation of c-myc,p53 and p16 gene expression.
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Key words：Arsenic trioxide;Human pulmonary adenocarcinoma GLC-82 cells;apoptosis;Gene expression
三氧化二砷(As2O3)对急性早幼粒白血病(APL)〔1,2〕具有良好疗效，并认为As2O3抗APL的机制是诱导细胞凋亡，调节Bcl-2基因的表达与PML-RARa融合蛋白有关〔2〕，从而备受关注。我室动物体内的抗肿瘤药效学研究证实，As2O3不仅对白血病有效，而且对其它肿瘤如小鼠肝癌和S180实体肿瘤有效〔3〕。为了寻找新的治疗肺癌的有效药物，本文以人肺腺癌GLC-82细胞为模型，研究As2O3对其生物学效应及作用机制。
1 材料和方法
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1.1 材料
As2O3购自Sigma公司，用生理盐水配成1mmol/L的贮存液，使用前用完全培养基稀释到所需浓度。四氮唑蓝(MTT)，购自Sigma公司。细胞系：人肺腺癌GLC-82细胞，由昆明医学院梁明达教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 MTT还原试验：细胞接种于96孔板后加入不同浓度As2O3，培养l、3、5、7d后，参考文献方法进行MTT试验〔4〕。用自动酶标检测仪(Biokinetics Reader，Microplate EL312eM美国)在540nm处检测96孔的光吸收值OD，以(用药组OD/对照组OD)×100%计算细胞的存活率。
1.2.2 克隆形成试验：参考文献〔5〕方法进行。接种细胞后，加入不同浓度As2O3，24h后换液，继续培养3周，计数克隆数，计算克隆形成率。
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1.2.3 流式细胞仪检测：参考文献〔6〕方法进行。收集不同浓度As203：处理不同时间的细胞，70%冷乙醇固定18h，RNA酶10μg/ml，37℃温育30min，加PI20μg/ml，用流式细胞仪(Coulter，Epicus ELITE，ESP，美国)检测，数据用multicycle分析软件处理。
1.2.4 DNA提取和凝胶电泳：按照文献〔7〕的方法略加改进。
1.2.5 细胞凋亡的TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)检测：按细胞凋亡检测试剂盒(Boehringer mannheim公司产)方法略加改进进行。
1.2.6 半定量逆转录-PCR(RT-PCR)分析：按照GIBC0 BRL提供的TRIZ0L试剂盒的说明提取RNA，定量后按照Life Technologies Inc.逆转录试剂盒的说明，略加改进进行逆转录。取cDNA产物在PE-2400热循环仪上，按下列条件进行PCR：(1)95℃，5min；(2)95℃，lmin；55-57℃，lmin；72℃，l～2min；25～30个循环；(3)72℃，7min。引物序列见表1，PCR产物用1.5%～2.0%琼脂糖凝胶电泳。紫外灯下检测DNA并照相。
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1.2.7 Western Blot分析：提取细胞总蛋白，BCA Protein Assay Kit定量，80μg蛋白用10%SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维膜(Bio-Rad公司)上，按ECLWestern blotting Kit方法杂交。
表1 引物序列表 引物名称
引物序列
扩增片段长度(bp)
Bcl-2
上游
5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’
下游
5’-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3’
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280
Bcl-x
上游
5’-GTGAGTGGACGGTCAGTGGTG-3’
800(bcl-xl)
下游
5’-TTGGACAATGGACTGGTTGTTGA-3’
600(bcl-xS)
c-myc
上游
5’-CTCTCAACGACAGCAGCCCG-3’
, 百拇医药
下游
5’-AGGTGATCCAGACTCTGACC-3’
250
Bax
上游
5’-GCGTCCACCAAGAAGCTGAG-3’
下游
5’-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3’
311
p53
上游
5’-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3’
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下游
5’-CTTAGCACCTGAAGGGTGAAATATTC-3’
620
p16
上游
5’-CATGATGATGGGCAGCGCC-3’
下游
5’-CAGGGTTTCTCAGAGCCT-3’
310
β-actin
上游
, 百拇医药 5’-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACC-3’
下游
5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3’
600
α-tubulin
上游
5’-CCCGTCTTCAGGGCTTCTTG-3’
下游
5’-TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3’
295
2 结果
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2.1 三氧化二砷(As2O3)降低肺腺癌GLC-82细胞的存活率
As2O3明显抑制GLC-82细胞的存活，随着浓度和时间增加，细胞的存活率逐渐降低，2μmol/L作用ld即可抑制细胞的存活，在相对较高浓度的情况下，5～7d可以杀死绝大多数的细胞。
2.2 三氧化二砷(As2O3)降低肺腺癌GLC-82细胞的克隆形成能力
三氧化二砷(As2O3)可显著降低肺腺癌GLC-82细胞的克隆形成能力，1、2、5、10μmol/LAs2O3处理GLC-82细胞的克隆形成率分别为68.4%、48.1%、24.8%、和8.1%，呈明显剂量依赖关系。
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2.3 As2O3对肺腺癌GLC-82细胞形态的影响
As2O3处理GLC-82细胞后，在相差显微镜下观察其形态变化，5μmol/LAs2O3处理ld的GLC-82细胞即有少数细胞开始变圆，2d时GLC-82细胞染色质和细胞质浓缩，细胞膜弯曲有由核碎裂形成的凋亡小体，显现典型的凋亡细胞形态；到第3天凋亡的细胞数进一步增加，多数细胞脱落而悬浮于细胞培养基中，有少数细胞体积增大，细胞破裂，而呈细胞坏死状(图1)。
2.4 As2O3诱导GLC-82细胞凋亡
图2可见As2O3处理GLC-82细胞后，在2μmol/L2d以及1μmol/L3d的情况下，即可出现明显的位于二倍体峰前的凋亡峰，而且随着用药浓度和时间的延长，凋亡峰值逐渐加大，表明凋亡细胞数量逐渐增多。而0.5μmol/L时凋亡峰不明显。
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图1 相差显微镜下AsS03处理GLC-82细胞的形态变化
A.处理前的对照组细胞，B～D5μmol/L分别处理24h,48h和72h的细胞
图2 AS2O3处理的GLC-82细胞流式细胞仪检测
DNA含量分布图。AP代表凋亡细胞。
图3 As2O31、2、5μmol/L作用GLC-82细
胞48小时提取基因组DNA“梯状”
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图谱.C为未处理对照组细胞.M
为分子量marker,M1,X174 DNA/
HaeⅢ,M2,λDNA/HindⅢ.
DNA凝胶电泳显示，用不同浓度的As2O3处理GLC-82细胞2d后，基因组DNA显现凋亡细胞典型的梯状图谱，这是DNA在核小体间成180-200bp整倍断裂的结果。图3所示，即使在1μmol/L2d时，GLC-82细胞也可见到明显的梯状电泳带，而随着浓度的加大，条带变得更为清楚。
TUNEL检测结果显示，经5μmol/LAs2O3处理2d的细胞大部分呈现表示凋亡细胞的绿色或黄绿色荧光，未经As2O3处理的GLC-82细胞仅呈现红色荧光。
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2.5 As2O3对GLC-82细胞基因表达的影响
RT-PCR分析发现，GLC-82细胞经As2O35μmol/L处理24h、2μmol/L处理48h，c-myc基因转录水平的表达即开始急剧下降，在72h时，已几乎检测不到c-myc基因的表达(图4A、B)；Westernblot的结果同样表明，As2O3降调节c-myc蛋白表达，而且随着时间延长，降调节作用愈明显(图4C)。经As2O3处理12h后，p53基因表达成倍增加，而到24h后，表达又呈下降趋势，表现为有时间阶段性的升调节作用(图4D)。GLC-82细胞内p16基因原有表达水平很低，经As2O3作用24h后表达增加，lμmol/LAs2O3就能够显著增加p16基因的表达，且几乎接近2μmol/L和5μmol/L时的表达水平(图4E)。
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图4 RT-PCR检测As2O3处理的GLC-细胞中c-myc(A,B),p53(D),p16(E),Bcl-X(F)基因的表
达.β-actin(600bp),α-tubulin(295bp)作为内对照，C，control;M，фx174DNA/HaeⅢ.
Westernblotting检测As2O3处理的GLC-82细胞中c-myc(C)蛋白的表达.
As2O3对bcl-2家族基因表达的影响结果表明：As2O3处理对GLC-82细胞bcl-2和Bax基因转录水平的表达几乎没有什么影响(资料未显示)。而对Bcl-XL，Bc1-XS表达的影响则有相似之处，均在12h表达开始增加，到24h达到高峰，而到72h时几乎检测不到两基因的表达(图4F)。
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3 讨论
As2O3对白血病以外的实体瘤的疗效，经本室在动物体内、外的实验结果表明，As2O3对多种动物移植性肿瘤有效，并能抑制多种体外培养的人肿瘤细胞的生长。本研究发现As2O3处理人肺腺癌GLC-82能降低细胞的存活和克隆形成能力，细胞呈现明显的凋亡形态，流式细胞仪分析显示G1期前面出现低于二倍体的凋亡峰，凝胶电泳检测到DNA核小体间整倍断裂的梯状图谱，TUNEL检测到DNA断裂，因此，同对APL细胞一样，As2O3也能引起GLC-82细胞的凋亡。
细胞凋亡是一个多基因参与的复杂的生命过程，以Bcl2家族在细胞凋亡中的作用备受人们关注，其家族成员具备双重功能，其中Bcl-2，Bcl-XL等抑制细胞凋亡的产生，而Bax，Bcl-XS等促进细胞凋亡。Bcl-XL和Bcl-XS分别为Bcl-X的两种型式。Bax通过与自身组成同源二聚体或与Bcl-2，Bcl-XL组成异源二聚体抑制Bcl-2或Bcl-XL的活性而发挥促进细胞凋亡的功能。因此，细胞中Bcl-XL或Bcl-2与Bax的比例将决定细胞的生死命运〔8〕。本研究发现经As2O3处理后对GLC-82细胞Bcl-2表达的影响不大。表明As2O3诱导凋亡可能不通过Bcl-2途径，这一点与As2O3显著降低NB4细胞Bcl-2的表达不同〔2〕。但是我们发现As2O2处理的GLC-82细胞，Bcl-XL和Bcl-XS均表现为时间阶段性的升调节，Bcl-XS在诱导凋亡过程中表达量升高符合其促进细胞凋亡的报道，表明其有可能参与了As2O3诱导的GLC-82的凋亡。而Bcl-XL作为一抑制凋亡基因的升调节相对难以解释。可能的解释是As2O3诱导凋亡过程中Bcl-XS的表达增加，而细胞为了自稳定的需要，Bcl-XL也随之升调节，当然，具体的机理还需要证实。也有报道Bcl-XL在骨髓样组织细胞凋亡的早期随Bax一起升调节〔9〕。
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GLC-82细胞，经As2O3处理后，c-myc基因在mRNA和蛋白水平的表达均被明显抑制。c-myc原癌基因己证明与许多癌症的发生有关，c-myc基因在非AIDS病Burkitt’s淋巴瘤中可因染色体移位而活化〔10〕，相似的是近年来发现在人肺腺癌GLC-82以及肺癌组织中存在c-myc基因的移位〔11〕，因此As2O3对c-myc移位蛋白的降调节作用，可能是其引起GLC-82细胞恶性表型逆转，走向凋亡的关键原因之一。
p53基因是一个公认的细胞凋亡的诱导子〔12〕。本研究发现，经As2O3处理的GLC-82细胞，p53基因在24h即被激活表达,而24h到后期表达又逐渐下降。这表明p53基因参与了As2O3诱导的GLC-82细胞凋亡的早期过程，而后期的凋亡过程可能由p53激活的下游基因参与。
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p16抑癌基因是一个细胞周期的抑制因子，关于p16基因参与细胞凋亡的报道很少，最近发现用p16基因转染人癌细胞也能诱导凋亡〔13〕。本实验发现As2O3处理而GLC-82细胞中p16基因被激活，意味着p16可能参与了As2O3诱导的GLC-82细胞的凋亡。
As2O3体外作用的剂量，直接关系到今后临床应用的价值，我们发现1μmol/LAs2O3作用2天时，即可导致GLC-82细胞出现典型的凋亡特征，这一剂量十分接近As2O3作用APL细胞系NB4的有效剂量(0.25～2μmol/L)；当As2O3剂量增加到5μmol/L时，诱导GLC-82细胞凋亡更明显，这个浓度在临床治疗APL病人As2O3的血浆峰值浓度(4.2～6.7μmol/L)范围内〔2〕，由此可以推测，在人体中使用治疗APL的As2O3剂量，也有可能对肺腺癌有效。
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总之，本研究表明As2O3抑制人肺癌细胞GLC-82生长，诱导细胞凋亡及其相关基因的表达变化，为深入认清As2O3作用机制和进一步的临床应用积累了资料。
〔参考文献〕
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收稿日期：1998-12-15；修回日期：1999-04-20, 百拇医药
单位：邓友平 肖培根，中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所(北京，100094)；林晨※ 张雪艳 陈洁平 吴旻，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室(北京，100021) ※通讯作者
关键词：三氧化二砷；人肺腺癌GLC-82细胞；细胞凋亡；基因表达
癌症990517 【摘 要】 目的：探讨As2O3对人肺腺癌GLC-82细胞系抑制生长、诱导凋亡的生物学效应及作用机制。方法：通过MTT还原法检测As2O3对该细胞系生长的影响；用光学显微镜、流式细胞仪、DNA凝胶电泳和细胞凋亡原位检测(TUNEL)研究As2O3诱导细胞凋亡的情况；用RT-PCR、Northern blot或Western blot分析As2O3对c-myc、p53、p16和bcl-X等基因表达的影响。结果：As2O3能抑制GLC-82细胞的生长。As2O3处理GLC-82细胞后，光学显微镜下可见到明显的凋亡细胞，细胞周期的G1期前有低于2倍体的凋亡峰，DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征：DNA有规律断裂形成的梯状图谱，蛋白水平的检测表明As2O3可使细胞c-myc基因表达下降，p16和p53表达升高。结论：As2O3能显著抑制GLC-82细胞生长、诱导细胞凋亡，并主要通过调节c-myc，p16和p53等基因的表达来实现。
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中图分类号：R73-361 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0545-05
Studies on arsenic trioxide induced human pulmonary adenocarcinoma GLC-82 cell apoptosis and its molecular mechanisms
DENG You-ping,LIN Chen,ZHANG Xue-yan,et al.
National Laboratory of Molecular Oncology,Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, Beijing 100021,P.R. China
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【Abstract】 Objective：To study the biological effect of As2O3 on human pulmonary adenocarcinoma GLC-82 cells and its mechanisms. Methods：MTT reduction assay,morphology investigation,flowcytometric analysis,DNA gel electrophoresis and TUNEL,RT-PCR,Northern blot, Western blot methods were perfomed. Results：As2O3 inhibited the growth of GLC-82 cell line. The cells treated with As2O3 showed a typical apoptotic morphology and hypodiploid peak before G1 phase. DNA of treated GLC-82 cells appeared a ladder pattern characteristic of apoptosis. In situ cell death detection analysis also revealed the DNA fragmentation. Besides,As2O3 inhibited c-myc gene expression and increased p53 and p16 gene expression. Conclusion：As2O3 can induce GLC-82 cell apoptosis mainly with regulation of c-myc,p53 and p16 gene expression.
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Key words：Arsenic trioxide;Human pulmonary adenocarcinoma GLC-82 cells;apoptosis;Gene expression
三氧化二砷(As2O3)对急性早幼粒白血病(APL)〔1,2〕具有良好疗效，并认为As2O3抗APL的机制是诱导细胞凋亡，调节Bcl-2基因的表达与PML-RARa融合蛋白有关〔2〕，从而备受关注。我室动物体内的抗肿瘤药效学研究证实，As2O3不仅对白血病有效，而且对其它肿瘤如小鼠肝癌和S180实体肿瘤有效〔3〕。为了寻找新的治疗肺癌的有效药物，本文以人肺腺癌GLC-82细胞为模型，研究As2O3对其生物学效应及作用机制。
1 材料和方法
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1.1 材料
As2O3购自Sigma公司，用生理盐水配成1mmol/L的贮存液，使用前用完全培养基稀释到所需浓度。四氮唑蓝(MTT)，购自Sigma公司。细胞系：人肺腺癌GLC-82细胞，由昆明医学院梁明达教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 MTT还原试验：细胞接种于96孔板后加入不同浓度As2O3，培养l、3、5、7d后，参考文献方法进行MTT试验〔4〕。用自动酶标检测仪(Biokinetics Reader，Microplate EL312eM美国)在540nm处检测96孔的光吸收值OD，以(用药组OD/对照组OD)×100%计算细胞的存活率。
1.2.2 克隆形成试验：参考文献〔5〕方法进行。接种细胞后，加入不同浓度As2O3，24h后换液，继续培养3周，计数克隆数，计算克隆形成率。
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1.2.3 流式细胞仪检测：参考文献〔6〕方法进行。收集不同浓度As203：处理不同时间的细胞，70%冷乙醇固定18h，RNA酶10μg/ml，37℃温育30min，加PI20μg/ml，用流式细胞仪(Coulter，Epicus ELITE，ESP，美国)检测，数据用multicycle分析软件处理。
1.2.4 DNA提取和凝胶电泳：按照文献〔7〕的方法略加改进。
1.2.5 细胞凋亡的TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)检测：按细胞凋亡检测试剂盒(Boehringer mannheim公司产)方法略加改进进行。
1.2.6 半定量逆转录-PCR(RT-PCR)分析：按照GIBC0 BRL提供的TRIZ0L试剂盒的说明提取RNA，定量后按照Life Technologies Inc.逆转录试剂盒的说明，略加改进进行逆转录。取cDNA产物在PE-2400热循环仪上，按下列条件进行PCR：(1)95℃，5min；(2)95℃，lmin；55-57℃，lmin；72℃，l～2min；25～30个循环；(3)72℃，7min。引物序列见表1，PCR产物用1.5%～2.0%琼脂糖凝胶电泳。紫外灯下检测DNA并照相。
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1.2.7 Western Blot分析：提取细胞总蛋白，BCA Protein Assay Kit定量，80μg蛋白用10%SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维膜(Bio-Rad公司)上，按ECLWestern blotting Kit方法杂交。
表1 引物序列表 引物名称
引物序列
扩增片段长度(bp)
Bcl-2
上游
5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’
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280
Bcl-x
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311
p53
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5’-CTTAGCACCTGAAGGGTGAAATATTC-3’
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β-actin
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, 百拇医药 5’-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACC-3’
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α-tubulin
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2 结果
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2.1 三氧化二砷(As2O3)降低肺腺癌GLC-82细胞的存活率
As2O3明显抑制GLC-82细胞的存活，随着浓度和时间增加，细胞的存活率逐渐降低，2μmol/L作用ld即可抑制细胞的存活，在相对较高浓度的情况下，5～7d可以杀死绝大多数的细胞。
2.2 三氧化二砷(As2O3)降低肺腺癌GLC-82细胞的克隆形成能力
三氧化二砷(As2O3)可显著降低肺腺癌GLC-82细胞的克隆形成能力，1、2、5、10μmol/LAs2O3处理GLC-82细胞的克隆形成率分别为68.4%、48.1%、24.8%、和8.1%，呈明显剂量依赖关系。
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2.3 As2O3对肺腺癌GLC-82细胞形态的影响
As2O3处理GLC-82细胞后，在相差显微镜下观察其形态变化，5μmol/LAs2O3处理ld的GLC-82细胞即有少数细胞开始变圆，2d时GLC-82细胞染色质和细胞质浓缩，细胞膜弯曲有由核碎裂形成的凋亡小体，显现典型的凋亡细胞形态；到第3天凋亡的细胞数进一步增加，多数细胞脱落而悬浮于细胞培养基中，有少数细胞体积增大，细胞破裂，而呈细胞坏死状(图1)。
2.4 As2O3诱导GLC-82细胞凋亡
图2可见As2O3处理GLC-82细胞后，在2μmol/L2d以及1μmol/L3d的情况下，即可出现明显的位于二倍体峰前的凋亡峰，而且随着用药浓度和时间的延长，凋亡峰值逐渐加大，表明凋亡细胞数量逐渐增多。而0.5μmol/L时凋亡峰不明显。
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图1 相差显微镜下AsS03处理GLC-82细胞的形态变化
A.处理前的对照组细胞，B～D5μmol/L分别处理24h,48h和72h的细胞
图2 AS2O3处理的GLC-82细胞流式细胞仪检测
DNA含量分布图。AP代表凋亡细胞。
图3 As2O31、2、5μmol/L作用GLC-82细
胞48小时提取基因组DNA“梯状”
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图谱.C为未处理对照组细胞.M
为分子量marker,M1,X174 DNA/
HaeⅢ,M2,λDNA/HindⅢ.
DNA凝胶电泳显示，用不同浓度的As2O3处理GLC-82细胞2d后，基因组DNA显现凋亡细胞典型的梯状图谱，这是DNA在核小体间成180-200bp整倍断裂的结果。图3所示，即使在1μmol/L2d时，GLC-82细胞也可见到明显的梯状电泳带，而随着浓度的加大，条带变得更为清楚。
TUNEL检测结果显示，经5μmol/LAs2O3处理2d的细胞大部分呈现表示凋亡细胞的绿色或黄绿色荧光，未经As2O3处理的GLC-82细胞仅呈现红色荧光。
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2.5 As2O3对GLC-82细胞基因表达的影响
RT-PCR分析发现，GLC-82细胞经As2O35μmol/L处理24h、2μmol/L处理48h，c-myc基因转录水平的表达即开始急剧下降，在72h时，已几乎检测不到c-myc基因的表达(图4A、B)；Westernblot的结果同样表明，As2O3降调节c-myc蛋白表达，而且随着时间延长，降调节作用愈明显(图4C)。经As2O3处理12h后，p53基因表达成倍增加，而到24h后，表达又呈下降趋势，表现为有时间阶段性的升调节作用(图4D)。GLC-82细胞内p16基因原有表达水平很低，经As2O3作用24h后表达增加，lμmol/LAs2O3就能够显著增加p16基因的表达，且几乎接近2μmol/L和5μmol/L时的表达水平(图4E)。
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图4 RT-PCR检测As2O3处理的GLC-细胞中c-myc(A,B),p53(D),p16(E),Bcl-X(F)基因的表
达.β-actin(600bp),α-tubulin(295bp)作为内对照，C，control;M，фx174DNA/HaeⅢ.
Westernblotting检测As2O3处理的GLC-82细胞中c-myc(C)蛋白的表达.
As2O3对bcl-2家族基因表达的影响结果表明：As2O3处理对GLC-82细胞bcl-2和Bax基因转录水平的表达几乎没有什么影响(资料未显示)。而对Bcl-XL，Bc1-XS表达的影响则有相似之处，均在12h表达开始增加，到24h达到高峰，而到72h时几乎检测不到两基因的表达(图4F)。
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3 讨论
As2O3对白血病以外的实体瘤的疗效，经本室在动物体内、外的实验结果表明，As2O3对多种动物移植性肿瘤有效，并能抑制多种体外培养的人肿瘤细胞的生长。本研究发现As2O3处理人肺腺癌GLC-82能降低细胞的存活和克隆形成能力，细胞呈现明显的凋亡形态，流式细胞仪分析显示G1期前面出现低于二倍体的凋亡峰，凝胶电泳检测到DNA核小体间整倍断裂的梯状图谱，TUNEL检测到DNA断裂，因此，同对APL细胞一样，As2O3也能引起GLC-82细胞的凋亡。
细胞凋亡是一个多基因参与的复杂的生命过程，以Bcl2家族在细胞凋亡中的作用备受人们关注，其家族成员具备双重功能，其中Bcl-2，Bcl-XL等抑制细胞凋亡的产生，而Bax，Bcl-XS等促进细胞凋亡。Bcl-XL和Bcl-XS分别为Bcl-X的两种型式。Bax通过与自身组成同源二聚体或与Bcl-2，Bcl-XL组成异源二聚体抑制Bcl-2或Bcl-XL的活性而发挥促进细胞凋亡的功能。因此，细胞中Bcl-XL或Bcl-2与Bax的比例将决定细胞的生死命运〔8〕。本研究发现经As2O3处理后对GLC-82细胞Bcl-2表达的影响不大。表明As2O3诱导凋亡可能不通过Bcl-2途径，这一点与As2O3显著降低NB4细胞Bcl-2的表达不同〔2〕。但是我们发现As2O2处理的GLC-82细胞，Bcl-XL和Bcl-XS均表现为时间阶段性的升调节，Bcl-XS在诱导凋亡过程中表达量升高符合其促进细胞凋亡的报道，表明其有可能参与了As2O3诱导的GLC-82的凋亡。而Bcl-XL作为一抑制凋亡基因的升调节相对难以解释。可能的解释是As2O3诱导凋亡过程中Bcl-XS的表达增加，而细胞为了自稳定的需要，Bcl-XL也随之升调节，当然，具体的机理还需要证实。也有报道Bcl-XL在骨髓样组织细胞凋亡的早期随Bax一起升调节〔9〕。
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GLC-82细胞，经As2O3处理后，c-myc基因在mRNA和蛋白水平的表达均被明显抑制。c-myc原癌基因己证明与许多癌症的发生有关，c-myc基因在非AIDS病Burkitt’s淋巴瘤中可因染色体移位而活化〔10〕，相似的是近年来发现在人肺腺癌GLC-82以及肺癌组织中存在c-myc基因的移位〔11〕，因此As2O3对c-myc移位蛋白的降调节作用，可能是其引起GLC-82细胞恶性表型逆转，走向凋亡的关键原因之一。
p53基因是一个公认的细胞凋亡的诱导子〔12〕。本研究发现，经As2O3处理的GLC-82细胞，p53基因在24h即被激活表达,而24h到后期表达又逐渐下降。这表明p53基因参与了As2O3诱导的GLC-82细胞凋亡的早期过程，而后期的凋亡过程可能由p53激活的下游基因参与。
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p16抑癌基因是一个细胞周期的抑制因子，关于p16基因参与细胞凋亡的报道很少，最近发现用p16基因转染人癌细胞也能诱导凋亡〔13〕。本实验发现As2O3处理而GLC-82细胞中p16基因被激活，意味着p16可能参与了As2O3诱导的GLC-82细胞的凋亡。
As2O3体外作用的剂量，直接关系到今后临床应用的价值，我们发现1μmol/LAs2O3作用2天时，即可导致GLC-82细胞出现典型的凋亡特征，这一剂量十分接近As2O3作用APL细胞系NB4的有效剂量(0.25～2μmol/L)；当As2O3剂量增加到5μmol/L时，诱导GLC-82细胞凋亡更明显，这个浓度在临床治疗APL病人As2O3的血浆峰值浓度(4.2～6.7μmol/L)范围内〔2〕，由此可以推测，在人体中使用治疗APL的As2O3剂量，也有可能对肺腺癌有效。
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总之，本研究表明As2O3抑制人肺癌细胞GLC-82生长，诱导细胞凋亡及其相关基因的表达变化，为深入认清As2O3作用机制和进一步的临床应用积累了资料。
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收稿日期：1998-12-15；修回日期：1999-04-20, 百拇医药