原发性肝细胞癌多染色体杂合性丢失研究
作者：邵建永 李晓明 侯景辉 曾木圣 吴秋良 刘宗石
单位：
邵建永 侯景辉 吴秋良，中山医科大学肿瘤防治中心病理科(广州，510060)；曾木圣，中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤研究所；李晓明 刘宗石，香港中文大学病理解剖及细胞病理学系
关键词：肝细胞癌；杂合性丢失；染色体；肿瘤抑制基因
癌症990509
【摘 要】 目的：研究原发性肝细胞癌(HCC)5对染色体38个位点等位基因杂合性丢失(LOH)，LOH与肝癌的临床病理改变和肝炎病毒感染的关系。方法：用PCR微卫星多态性分析检测肝癌LOH。结果：发生高频率LOH的位点有染色体1p的D1S186(p31,48.1%)和D1S243(1p36.3,51.6%);染色体9p24的D9S54(61.8%)、9p21的D9S1747(52.4%)和DD9S1752(51.8%)位点；10号染色体10q23～24区D10S1223(53.3%)和D10S1225(38.7%)位点；16号染色体16q24区的D16S413位点LOH频率最高(70.8%)；17号染色体17p13上TP53(53.8%)和D17S520(56.8%)。各染色体LOH与肝癌的临床病理改变无明显关系；HCV和HBV复合感染与p53和p15INK4B基因的LOH有关。结论：肝癌的发生、发展与多染色体的LOH有关，在染色体1p31，1p36～p35，9p24和9p21，10q22～24，16q24和17p可能存在多个与HCC有关的TSG。肝炎病毒HBV和HCV合并感染与p53和p15INK4B基因位点的LOH发生有关。
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中图分类号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0520-04
Study of loss of heterozygosity (LOH) on multiple chromosome arms in hepatocellular carcinomas
SHAO Jian-yong,et al.
Department of Pathology,Cancer Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R.China
LI Xiao-ming, LIEW Choong-tsek
Department of Anatomical and Cellular Pathology, Faculty of Medicine,The Chinese University of Hong Kong,P.R China
, 百拇医药
【Abstract】 Objectives：Study of loss of heterozygosity (LOH) at 38 loci on five chromosomes in 38 cases of hepatocellular carcinoma,and the possible relations betwee the LOH and clinicopathologic changes and hepato-viral infection of the HCC. Methods：PCR based microsatellite polymorphism analysis technique was used to detect LOH in HCC. Results：High frequency of LOH was detected on chromosome 1p36 concentrated at locus D1S243 (51.6% )and 1p31 at locus D1S186 (48.1% ). On 9p24 at locus D9S54 (61.8% ) and 9p21 concentrated at loci D9S1747 (52.4% ) and D9S1752 (51.8% ),on chromosome 10, only locus D10S1223 (53.3% )on 10q23～ 24 showed high frequency of LOH. All 5 loci detected on chromosome 16 showed high frequency of LOH more than 50% ,with the highest frequency of LOH at locus D16S413 (70.8% ) on 16q 24. On chromosome 17, high frequency of LOH concentrated on 17p13 at TP53 gene locus (53.8% )and locus D17S520 (56.8% ). HBV and HCV coinfection in HCC is associated with LOH at TP53 locus and p15 gene locus. Conclusions：The results indicated that high frequency of LOH on multiple chromosome arms were involved in hepatocarcinogenesis, there may be more than one putative TSG harbored in these chromosome arms associated with HCC.Coinfection of HBV and HCV is closely associated with LOH at p53 and p15 gene loci.
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Key words：Hepatocellular carcinoma;Loss of heterozygosity;Tumor suppressor gene;Chromosome
分子遗传学研究发现恶性肿瘤的发生与原癌基因活化和肿瘤抑制基因(Tumor suppressor gene,TSG)失活有关〔1～2〕。TSG失活的重要表现形式之一就是一条等位基因的突变和另一条等位基因的丢失，即杂合性丢失(Loss of heterozygosity,LOH)。研究发现肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)在染色体1，4q,5q,9p,11p,13q,16q和17p发生LOH〔5～8〕。有关中国人肝癌多染色体等位基因LOH的研究尚未见报告。本研究对38例伴HBV和/或HCV感染的HCC进行微卫星多态性分析，检测5对染色体上38个微卫星位点LOH，以了解本地区肝癌发生与LOH的关系及LOH与肝癌的临床病理改变和肝炎病毒感染的可能关系。
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1 材料与方法
1.1 标本来源
38例HCC取自本科存档的病例，选取肿瘤和癌旁肝组织蜡块，部分病例蜡块肿瘤和正常肝组织混杂，组织片用显微切割技术剔除肝组织以纯化肿瘤组织。病人年龄40～79岁，平均63岁。其中男34例，女4例。所有病人在住院期间均作了HBV血清5项(HBsAg,HBsAb,HBcAg,HBcAg和HBeAb)和HCV血清抗体检测。
1.2 DNA抽提
选取瘤细胞保存较好的肿瘤和癌旁肝组织蜡块，分别切取肿瘤组织和癌旁肝组织，用PCR模板纯化试剂盒(宝灵曼公司，德国)抽提DNA，方法参照文献报道〔7〕DNA最终浓度稀释至100ng/μl。
1.3 微卫星多态性分析
, 百拇医药
38个微卫星引物购自ResearchGenetic公司(美国)或由OligiosInc公司(美国)合成。引物基本资料见表1。每对引物正链在T4多聚核苷酸合成酶(PNK)催化下标记r-32-P-ATP(Armersham Corporation,英国)。PCR反应条件及PCR结果分析方法见文献报道〔7〕。
表1 用于微卫星多态性分析的标记物资料一览表 Markers
染色体
扩增片
Markers
染色体
扩增片段
位点
, 百拇医药
长度(bp)
位点
长度(bp)
D1S160
1p36.2
150
D9S126
9p21
238～248
D1S165
1p36
156～177
D10S674
, 百拇医药
10p
218～254
D1S170
1p36.1
217
D10S1220
10q
236～245
D1S186
1p31
82～106
D10S1223
10q
, 百拇医药
269～296
D1S214
1p36.2
120～142
D10S1225
10q
181～193
D1S228
1p36
117～129
D10S1432
10q
, 百拇医药 165～185
D1S234
1p31
226～238
D10S2327
10q
204～228
D1S243
1p36.3
142～170
D10S1239
10q
160～184
, 百拇医药
D1S482
1p35
177～189
D10S677
10q23
197～225
D9S450
1p36
243～267
D16S407
16p13.13
150～170
, 百拇医药
D9S54
9p24
110～126
D16S413
16q24
131～149
D9S162
9p22
172～196
D16S539
16q24
148～172
, 百拇医药 IFNA
9p21
138～150
D16S393
16q24
143
D9S1751
9p21
150～170
TP53
19p13.1
204～228
D9S1749
, 百拇医药
9p21
120～160
D17S520
17p13～12
130～144
D9S1751
9p21
120～140
D17S950
17q
174～198
D9S1747
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9p21
130～150
D17S785
17q12～14
148～174
D9S1752
9p21
150～162
D17S798
17q12～14
207～229
MPO
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17q21.3
171～187
1.4 统计学分析
肝癌LOH与临床病理改变和肝炎病毒感染之间的关系用x2检验。
2 结果
2.1 本组HCC在各个染色体发生LOH的频率
正常组织杂合状态下等位基因有两条电泳带，当肿瘤组织等位DNA两条带中的一条较正常等位基因带明显减弱(>70%)则认定为LOH(图1)。本组肝癌各染色体发生LOH的频率见图2。LOH频率>30%的有染色体的1p(84.2%)，9p(81.6%),10q(76.3%),16p(52%),16q(73%),17p(65.8%),17q(52.6%)。染色体1p发生高频率LOH区域主要位于1p36区D1S243(51.6%)位点1p31区D1S186(48.1%)位点。染色体9p24区D9S54(61.8%)，9p21的D9S1747(52.4%)和D9S1752(51.8%)位点。10号染色体10q的D10S1223(53.3%)位点；在染色体16q24区的D16S413(70.8%)；在17号染色体，高频率LOH主要位于17p13区TP53基因位点(14/26，53.8%)和D17S520(21/37，56.8%)位点。
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图1 肝癌肿瘤组织等位基因杂合性丢失图例。
方框下方示微卫星Marker名称，上方N-癌旁正常
肝组织，T-肿瘤组织，箭头
示肿瘤组织DNA其中一条
等位基因条带丢失或明显减弱，即发生LOH。图示1号
HCC病人在D10S1220，D10S1223，D10S2327和D16S539
等位点发生LOH，35号病例在D1S482，D1S165，D16S2624和D16S413等位点发生LOH。
2.2 肝癌各染色体LOH与肝癌临床病理改变的关系
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合并HBV和HCV感染的病例较单独HBV感染的HCC在以下列位点LOH频率增高(P<0.05)，分别是D9S1752，D16S393，和TP53基因位点，但其意义有待阐明。肝癌LOH与肿瘤的体积大小、肿瘤分级、临床分期、癌旁肝组织肝硬化的发生、和血AFP水平无明显关系。
染色体臂(P-短臂，q-长臂)
图2 各染色体臂LOH频率一览
图2 肝癌各染色体LOH频率比较。本组HCC在染色
体1p、9p、101、16q和17p发生高频率LOH，P-染色体
短臂，q-染色体长臂。
3 讨论
, 百拇医药
3.1 肝癌各染色体等位基因杂合性缺失
本研究发现肝癌在染色体1p31和1p35～36,9p24和9p21,10q23～24,16q24,和17p13等区域发生高频率LOH，并首次发现肝癌在染色体9p24，10q23～24和16q24区发生高频率LOH。
3.1.1 1号染色体：国外研究报告神经母细胞瘤、乳腺癌、肝细胞癌和肝母细胞瘤等在染色体1p32和1p35～36区发生等位基因缺失〔8～11〕。本研究在1p上选取的10个位点LOH频率均>30%，LOH频率最高的位点是D1S243(1p36.3)，1p36区其它4个位点LOH频率介于33.3%至46.1%；在染色体1p35和1p31区LOH频率也接近50%。Yeh等〔10〕报道在台湾地区30%的肝癌在1p35～36区发生LOH。Krause等〔11〕发现22%肝母细胞胞瘤在1p36.3区发生LOH。提示肝癌主要在染色体1p35～36和1p31区发生LOH，在这些区域可能存在与肝癌有关的TSG。
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3.1.2 9号染色体：本研究检测染色体9p上9个位点微卫星多态性，发现81.6%(31/37)的肝癌发生LOH，主要丢失区位于D9S54(9p24,61.8%)，9p21区D9S1747(52.4%)和D9S1752(51.8%)，在9p21区所选的其它5个位点发生LOH的频率均>30%(34.4%～42.9%)。肝癌在染色体9p24和9p21区多位点发生高频率LOH，提示这些区域可能存在与多个与肝癌发生有关的TSG。P16基因位于D9S1747和D9S1748两个位点之间，D9S1747和D9S1748的丢失可能包含p16基因的丢失，p15基因包含了D9S1752位点，该位点的高频率LOH提示p15基因发生高频率LOH。本组HCC在9p21区多个位点包括D9S1747和D9S1752位点发生高频率LOH，提示p16和p15基因很可能在肝癌发生发展过程中起重要作用。
3.1.3 10号染色体：对10号染色体8个位点进行分析，首次发现在10q23～24区D10S1223(57.1%)和D10S1225(35.5%)两个位点LOH频率>30%，提示在10q23～24区可能存在与肝癌有关的TSG。在染色体10q区，存在两个候选TSG，即MMAC/PTEN基因(10q23.3)和MXI1基因(10q24～25)〔12，13〕。这两个基因应作为HCC相关的候选TSG研究，进一步研究应该在该两个基因附近选取更多的位点进行LOH分析。
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3.1.4 16号染色体：国外报道肝癌在16号染色体发生高频率LOH的位点是10q22～23的HP位点、CTRB位点和TAT位点〔14，15〕。本研究发现在16号染色体5个位点LOH频率均>50%，其中3个位点位于16q24，一个位点位于16q22.1～23.1(D16S624)。在16q24区的3个位点中，D16S413位点LOH频率最高(70%)。本研究首次发现肝癌在16q24区也发生高频率LOH，提示在16q24区可能存在与肝癌有关的TSG。进一步研究应该在16q24区选取更多位点进行LOH分析。
3.1.5 17号染色体：P53基因定位在17p13.1,有报道指肝癌组织中p53基因发生率频率LOH〔16，17〕。本研究在17p上两个位点TP53(53.8%)和D17S520(17p12～13，56.8%)LOH频率都>50%，但在17q上所选4个位点仅D17S950发生高频率LOH(40.6%)。本研究发现53.8%的HCC出现p53基因LOH，国外结果基本一致〔3，16～17〕，提示p53基因的LOH可能是肝癌发生的重要因素之一。HBVDNA整合于p53基因附近区域，本组HCC在p53基因附近的位点D17S520也发生高频率LOH，提示该位点附近可能存在另一个与HCC相关的TSG。
, 百拇医药
本研究结果提示肝癌的发生、发展可能与多染色体LOH有关，可能有多个TSG参与HCC的癌变，进一步研究应该对早期肝癌进行LOH定位，以确定与肝癌发生有关的TSG。
3.2 肝癌多染色体LOH与临床病理改变和肝炎病毒感染的关系
肝癌组织多染色体LOH与肝癌的肿瘤体积大小、肿瘤细胞的分化、肿瘤的临床分期、血清AFP浓度水平和癌旁肝组织肝硬化的有无均没有明显联系。这一结果与其它研究结果基本一致〔17〕。肝癌的发生与HBV感染密切相关，HCV感染也可能增加患HCC的危险性〔18〕。由于本组HCC病人94.7%存在HBV感染，我们不能肯定本组HCC多染色体LOH是否与HBV感染有关，但是，我们发现合并HBV和HCV感染的HCC组，其LOH发生率在大多数位点都高于单独HBV感染的HCC组，且在TP53基因位点，D9S1752(p15基因)和D16S393位点有明显统计学差异(P<0.05，χ2检验)。提示HBV和HCV合并感染与p53和p15基因的LOH的发生有关；HCV感染可能在肝癌的基因变化过程中起重要作用，也支持了HCV感染能够提高致HCC的危险性的推断。
, 百拇医药
本研究结果提示肝癌的发生、发展与多染色体的LOH有关；可能有多TSG参与了肝癌的发生。肝癌多染色体LOH与肝癌的临床病理改变无明显关系，肝炎病毒HBV和HCV合并感染与p53和p15INK4B基因位点的LOH发生有关。
基金项目：香港政府科学研究基金资助，基金号：CU95661/UPG
〔参考文献〕
〔1〕 Vogelstein B,Fearon ER,Hamilton SR,et al. Genetic alterations during colorectal tumor development〔J〕. N Eng J Med,1988,319：525～532.
〔2〕 Knudson AG. Antioncogenes and human cancer〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1993, 90：10914～10921.
, http://www.100md.com
〔3〕 Piao Z,Park C,Park JH,et al. Allelotype analysis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer,1998,75：29～33.
〔4〕 Fujimoto Y,Hampton LL,Wirth PJ,et al. Alterations of tumor suppressor genes and alleilic losses in human hepatocellular carcinomas in China〔J〕.Cancer Res,1994,54：281～285.
〔5〕 Ding SF,Habib NA,Dooley J,et al. Loss of constitutional heterozygosity on chromosome 5q in hepatocellular carcinoma without cirrhosis〔J〕.Br J Cancer,1991, 64：1083～1087.
, http://www.100md.com
〔6〕 邵建永，Liew Choong-Tsejk,梁小曼，等.原发性肝癌9号染色体等位基因杂合性丢失研究。癌症，1999，18(1)：16～19
〔7〕 邵建永，李晓明，刘宗石等.原发性肝细胞癌1号染色体杂合子丢失的初步研究.中华病理学杂志，1999，28(1)：28～30.
〔8〕 Schleiermacher G,Delattre O,Peter M,et al. Clinical relevance of loss of heterozygosity of the short arm of chromosome 1 in neuroblastoma: a single-institution study〔J〕. Int J Cancer,1996,69：73～78.
〔9〕 Bieche I,Champeme MH,Matifas F,et al. Two distinct regions involved in 1p deletion in human primary breast cancer〔J〕. Cancer Res,1993,53：1990～1994.
, http://www.100md.com
〔10〕 Yeh SH,Chen PJ,Chen HL,et al. Frequent genetic alterations at the distal region of chromosome 1p in human hepatocellular carcinomas〔J〕. Cancer Res 1994,54：4188～4192.
〔11〕 Kraus JA,Albrecht S,Wiestler OD,et al.Loss of heterozygosity on chromosome 1 in human hepatoblastoma〔J〕. Int J Cancer,1996,67：467～471.
〔12〕 Petersen S,Wolf G,Bockmuhl U,et al. Allelic loss on chromosome 10q in human lung cancer：association with tumor progression and metastatic phenotype〔J〕. Br J Cancer,1998,77：270～276.
, 百拇医药
〔13〕 Trybus TM,Burgess AC,Wojno KJ,et al.Distinct areas of allelic loss on chromosomal regions 10p and 10q in human prostate cancer〔J〕. Cancer Res,1996,56：2263～2267.
〔14〕 Tsuda H,Zhang WD,Shimosato Y,et al. Allele loss on chromosome 16 associated with progression of human hepatocellular carcinoma〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87：6791～ 6794.
〔15〕 Walker GJ,Hayward NK,Falvey S,et al. Loss of somatic heterozygosity in hepatocellulr carcinoma〔J〕. Cancer Res,1991,51：4367～4370.
, http://www.100md.com
〔16〕 Teramoto T,Satonaka K,Kitazawa S,et al.p53 gene abnormalities are closely related to hepatoviral infections and occur at the late stage of hepatocarcinogenesis〔J〕. Cancer Res,1994,54：231～235.
〔17〕 Piao Z,Kim H,Jeon BK,et al. Relationship between loss of heterozygosity of tumor suppressor genes and histologic differentiation in hepatocellular carcinoma〔J〕. Cancer,1997,80：865～872.
〔18〕 Benvegnu L,Fattovich G,Noventa F,et al. Concurrent hepatitis B and C virus infection and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis. A prospective study〔J〕. Cancer,1994,74：2442～2448.
收稿日期：1998-11-24；修回日期：1999-01-25, 百拇医药
单位：
邵建永 侯景辉 吴秋良，中山医科大学肿瘤防治中心病理科(广州，510060)；曾木圣，中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤研究所；李晓明 刘宗石，香港中文大学病理解剖及细胞病理学系
关键词：肝细胞癌；杂合性丢失；染色体；肿瘤抑制基因
癌症990509
【摘 要】 目的：研究原发性肝细胞癌(HCC)5对染色体38个位点等位基因杂合性丢失(LOH)，LOH与肝癌的临床病理改变和肝炎病毒感染的关系。方法：用PCR微卫星多态性分析检测肝癌LOH。结果：发生高频率LOH的位点有染色体1p的D1S186(p31,48.1%)和D1S243(1p36.3,51.6%);染色体9p24的D9S54(61.8%)、9p21的D9S1747(52.4%)和DD9S1752(51.8%)位点；10号染色体10q23～24区D10S1223(53.3%)和D10S1225(38.7%)位点；16号染色体16q24区的D16S413位点LOH频率最高(70.8%)；17号染色体17p13上TP53(53.8%)和D17S520(56.8%)。各染色体LOH与肝癌的临床病理改变无明显关系；HCV和HBV复合感染与p53和p15INK4B基因的LOH有关。结论：肝癌的发生、发展与多染色体的LOH有关，在染色体1p31，1p36～p35，9p24和9p21，10q22～24，16q24和17p可能存在多个与HCC有关的TSG。肝炎病毒HBV和HCV合并感染与p53和p15INK4B基因位点的LOH发生有关。
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中图分类号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0520-04
Study of loss of heterozygosity (LOH) on multiple chromosome arms in hepatocellular carcinomas
SHAO Jian-yong,et al.
Department of Pathology,Cancer Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R.China
LI Xiao-ming, LIEW Choong-tsek
Department of Anatomical and Cellular Pathology, Faculty of Medicine,The Chinese University of Hong Kong,P.R China
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【Abstract】 Objectives：Study of loss of heterozygosity (LOH) at 38 loci on five chromosomes in 38 cases of hepatocellular carcinoma,and the possible relations betwee the LOH and clinicopathologic changes and hepato-viral infection of the HCC. Methods：PCR based microsatellite polymorphism analysis technique was used to detect LOH in HCC. Results：High frequency of LOH was detected on chromosome 1p36 concentrated at locus D1S243 (51.6% )and 1p31 at locus D1S186 (48.1% ). On 9p24 at locus D9S54 (61.8% ) and 9p21 concentrated at loci D9S1747 (52.4% ) and D9S1752 (51.8% ),on chromosome 10, only locus D10S1223 (53.3% )on 10q23～ 24 showed high frequency of LOH. All 5 loci detected on chromosome 16 showed high frequency of LOH more than 50% ,with the highest frequency of LOH at locus D16S413 (70.8% ) on 16q 24. On chromosome 17, high frequency of LOH concentrated on 17p13 at TP53 gene locus (53.8% )and locus D17S520 (56.8% ). HBV and HCV coinfection in HCC is associated with LOH at TP53 locus and p15 gene locus. Conclusions：The results indicated that high frequency of LOH on multiple chromosome arms were involved in hepatocarcinogenesis, there may be more than one putative TSG harbored in these chromosome arms associated with HCC.Coinfection of HBV and HCV is closely associated with LOH at p53 and p15 gene loci.
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Key words：Hepatocellular carcinoma;Loss of heterozygosity;Tumor suppressor gene;Chromosome
分子遗传学研究发现恶性肿瘤的发生与原癌基因活化和肿瘤抑制基因(Tumor suppressor gene,TSG)失活有关〔1～2〕。TSG失活的重要表现形式之一就是一条等位基因的突变和另一条等位基因的丢失，即杂合性丢失(Loss of heterozygosity,LOH)。研究发现肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)在染色体1，4q,5q,9p,11p,13q,16q和17p发生LOH〔5～8〕。有关中国人肝癌多染色体等位基因LOH的研究尚未见报告。本研究对38例伴HBV和/或HCV感染的HCC进行微卫星多态性分析，检测5对染色体上38个微卫星位点LOH，以了解本地区肝癌发生与LOH的关系及LOH与肝癌的临床病理改变和肝炎病毒感染的可能关系。
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1 材料与方法
1.1 标本来源
38例HCC取自本科存档的病例，选取肿瘤和癌旁肝组织蜡块，部分病例蜡块肿瘤和正常肝组织混杂，组织片用显微切割技术剔除肝组织以纯化肿瘤组织。病人年龄40～79岁，平均63岁。其中男34例，女4例。所有病人在住院期间均作了HBV血清5项(HBsAg,HBsAb,HBcAg,HBcAg和HBeAb)和HCV血清抗体检测。
1.2 DNA抽提
选取瘤细胞保存较好的肿瘤和癌旁肝组织蜡块，分别切取肿瘤组织和癌旁肝组织，用PCR模板纯化试剂盒(宝灵曼公司，德国)抽提DNA，方法参照文献报道〔7〕DNA最终浓度稀释至100ng/μl。
1.3 微卫星多态性分析
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38个微卫星引物购自ResearchGenetic公司(美国)或由OligiosInc公司(美国)合成。引物基本资料见表1。每对引物正链在T4多聚核苷酸合成酶(PNK)催化下标记r-32-P-ATP(Armersham Corporation,英国)。PCR反应条件及PCR结果分析方法见文献报道〔7〕。
表1 用于微卫星多态性分析的标记物资料一览表 Markers
染色体
扩增片
Markers
染色体
扩增片段
位点
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长度(bp)
位点
长度(bp)
D1S160
1p36.2
150
D9S126
9p21
238～248
D1S165
1p36
156～177
D10S674
, 百拇医药
10p
218～254
D1S170
1p36.1
217
D10S1220
10q
236～245
D1S186
1p31
82～106
D10S1223
10q
, 百拇医药
269～296
D1S214
1p36.2
120～142
D10S1225
10q
181～193
D1S228
1p36
117～129
D10S1432
10q
, 百拇医药 165～185
D1S234
1p31
226～238
D10S2327
10q
204～228
D1S243
1p36.3
142～170
D10S1239
10q
160～184
, 百拇医药
D1S482
1p35
177～189
D10S677
10q23
197～225
D9S450
1p36
243～267
D16S407
16p13.13
150～170
, 百拇医药
D9S54
9p24
110～126
D16S413
16q24
131～149
D9S162
9p22
172～196
D16S539
16q24
148～172
, 百拇医药 IFNA
9p21
138～150
D16S393
16q24
143
D9S1751
9p21
150～170
TP53
19p13.1
204～228
D9S1749
, 百拇医药
9p21
120～160
D17S520
17p13～12
130～144
D9S1751
9p21
120～140
D17S950
17q
174～198
D9S1747
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9p21
130～150
D17S785
17q12～14
148～174
D9S1752
9p21
150～162
D17S798
17q12～14
207～229
MPO
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17q21.3
171～187
1.4 统计学分析
肝癌LOH与临床病理改变和肝炎病毒感染之间的关系用x2检验。
2 结果
2.1 本组HCC在各个染色体发生LOH的频率
正常组织杂合状态下等位基因有两条电泳带，当肿瘤组织等位DNA两条带中的一条较正常等位基因带明显减弱(>70%)则认定为LOH(图1)。本组肝癌各染色体发生LOH的频率见图2。LOH频率>30%的有染色体的1p(84.2%)，9p(81.6%),10q(76.3%),16p(52%),16q(73%),17p(65.8%),17q(52.6%)。染色体1p发生高频率LOH区域主要位于1p36区D1S243(51.6%)位点1p31区D1S186(48.1%)位点。染色体9p24区D9S54(61.8%)，9p21的D9S1747(52.4%)和D9S1752(51.8%)位点。10号染色体10q的D10S1223(53.3%)位点；在染色体16q24区的D16S413(70.8%)；在17号染色体，高频率LOH主要位于17p13区TP53基因位点(14/26，53.8%)和D17S520(21/37，56.8%)位点。
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图1 肝癌肿瘤组织等位基因杂合性丢失图例。
方框下方示微卫星Marker名称，上方N-癌旁正常
肝组织，T-肿瘤组织，箭头
示肿瘤组织DNA其中一条等位基因条带丢失或明显减弱，即发生LOH。图示1号
HCC病人在D10S1220，D10S1223，D10S2327和D16S539
等位点发生LOH，35号病例在D1S482，D1S165，D16S2624和D16S413等位点发生LOH。
2.2 肝癌各染色体LOH与肝癌临床病理改变的关系
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合并HBV和HCV感染的病例较单独HBV感染的HCC在以下列位点LOH频率增高(P<0.05)，分别是D9S1752，D16S393，和TP53基因位点，但其意义有待阐明。肝癌LOH与肿瘤的体积大小、肿瘤分级、临床分期、癌旁肝组织肝硬化的发生、和血AFP水平无明显关系。
染色体臂(P-短臂，q-长臂)
图2 各染色体臂LOH频率一览
图2 肝癌各染色体LOH频率比较。本组HCC在染色
体1p、9p、101、16q和17p发生高频率LOH，P-染色体
短臂，q-染色体长臂。
3 讨论
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3.1 肝癌各染色体等位基因杂合性缺失
本研究发现肝癌在染色体1p31和1p35～36,9p24和9p21,10q23～24,16q24,和17p13等区域发生高频率LOH，并首次发现肝癌在染色体9p24，10q23～24和16q24区发生高频率LOH。
3.1.1 1号染色体：国外研究报告神经母细胞瘤、乳腺癌、肝细胞癌和肝母细胞瘤等在染色体1p32和1p35～36区发生等位基因缺失〔8～11〕。本研究在1p上选取的10个位点LOH频率均>30%，LOH频率最高的位点是D1S243(1p36.3)，1p36区其它4个位点LOH频率介于33.3%至46.1%；在染色体1p35和1p31区LOH频率也接近50%。Yeh等〔10〕报道在台湾地区30%的肝癌在1p35～36区发生LOH。Krause等〔11〕发现22%肝母细胞胞瘤在1p36.3区发生LOH。提示肝癌主要在染色体1p35～36和1p31区发生LOH，在这些区域可能存在与肝癌有关的TSG。
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3.1.2 9号染色体：本研究检测染色体9p上9个位点微卫星多态性，发现81.6%(31/37)的肝癌发生LOH，主要丢失区位于D9S54(9p24,61.8%)，9p21区D9S1747(52.4%)和D9S1752(51.8%)，在9p21区所选的其它5个位点发生LOH的频率均>30%(34.4%～42.9%)。肝癌在染色体9p24和9p21区多位点发生高频率LOH，提示这些区域可能存在与多个与肝癌发生有关的TSG。P16基因位于D9S1747和D9S1748两个位点之间，D9S1747和D9S1748的丢失可能包含p16基因的丢失，p15基因包含了D9S1752位点，该位点的高频率LOH提示p15基因发生高频率LOH。本组HCC在9p21区多个位点包括D9S1747和D9S1752位点发生高频率LOH，提示p16和p15基因很可能在肝癌发生发展过程中起重要作用。
3.1.3 10号染色体：对10号染色体8个位点进行分析，首次发现在10q23～24区D10S1223(57.1%)和D10S1225(35.5%)两个位点LOH频率>30%，提示在10q23～24区可能存在与肝癌有关的TSG。在染色体10q区，存在两个候选TSG，即MMAC/PTEN基因(10q23.3)和MXI1基因(10q24～25)〔12，13〕。这两个基因应作为HCC相关的候选TSG研究，进一步研究应该在该两个基因附近选取更多的位点进行LOH分析。
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3.1.4 16号染色体：国外报道肝癌在16号染色体发生高频率LOH的位点是10q22～23的HP位点、CTRB位点和TAT位点〔14，15〕。本研究发现在16号染色体5个位点LOH频率均>50%，其中3个位点位于16q24，一个位点位于16q22.1～23.1(D16S624)。在16q24区的3个位点中，D16S413位点LOH频率最高(70%)。本研究首次发现肝癌在16q24区也发生高频率LOH，提示在16q24区可能存在与肝癌有关的TSG。进一步研究应该在16q24区选取更多位点进行LOH分析。
3.1.5 17号染色体：P53基因定位在17p13.1,有报道指肝癌组织中p53基因发生率频率LOH〔16，17〕。本研究在17p上两个位点TP53(53.8%)和D17S520(17p12～13，56.8%)LOH频率都>50%，但在17q上所选4个位点仅D17S950发生高频率LOH(40.6%)。本研究发现53.8%的HCC出现p53基因LOH，国外结果基本一致〔3，16～17〕，提示p53基因的LOH可能是肝癌发生的重要因素之一。HBVDNA整合于p53基因附近区域，本组HCC在p53基因附近的位点D17S520也发生高频率LOH，提示该位点附近可能存在另一个与HCC相关的TSG。
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本研究结果提示肝癌的发生、发展可能与多染色体LOH有关，可能有多个TSG参与HCC的癌变，进一步研究应该对早期肝癌进行LOH定位，以确定与肝癌发生有关的TSG。
3.2 肝癌多染色体LOH与临床病理改变和肝炎病毒感染的关系
肝癌组织多染色体LOH与肝癌的肿瘤体积大小、肿瘤细胞的分化、肿瘤的临床分期、血清AFP浓度水平和癌旁肝组织肝硬化的有无均没有明显联系。这一结果与其它研究结果基本一致〔17〕。肝癌的发生与HBV感染密切相关，HCV感染也可能增加患HCC的危险性〔18〕。由于本组HCC病人94.7%存在HBV感染，我们不能肯定本组HCC多染色体LOH是否与HBV感染有关，但是，我们发现合并HBV和HCV感染的HCC组，其LOH发生率在大多数位点都高于单独HBV感染的HCC组，且在TP53基因位点，D9S1752(p15基因)和D16S393位点有明显统计学差异(P<0.05，χ2检验)。提示HBV和HCV合并感染与p53和p15基因的LOH的发生有关；HCV感染可能在肝癌的基因变化过程中起重要作用，也支持了HCV感染能够提高致HCC的危险性的推断。
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本研究结果提示肝癌的发生、发展与多染色体的LOH有关；可能有多TSG参与了肝癌的发生。肝癌多染色体LOH与肝癌的临床病理改变无明显关系，肝炎病毒HBV和HCV合并感染与p53和p15INK4B基因位点的LOH发生有关。
基金项目：香港政府科学研究基金资助，基金号：CU95661/UPG
〔参考文献〕
〔1〕 Vogelstein B,Fearon ER,Hamilton SR,et al. Genetic alterations during colorectal tumor development〔J〕. N Eng J Med,1988,319：525～532.
〔2〕 Knudson AG. Antioncogenes and human cancer〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1993, 90：10914～10921.
, http://www.100md.com
〔3〕 Piao Z,Park C,Park JH,et al. Allelotype analysis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer,1998,75：29～33.
〔4〕 Fujimoto Y,Hampton LL,Wirth PJ,et al. Alterations of tumor suppressor genes and alleilic losses in human hepatocellular carcinomas in China〔J〕.Cancer Res,1994,54：281～285.
〔5〕 Ding SF,Habib NA,Dooley J,et al. Loss of constitutional heterozygosity on chromosome 5q in hepatocellular carcinoma without cirrhosis〔J〕.Br J Cancer,1991, 64：1083～1087.
, http://www.100md.com
〔6〕 邵建永，Liew Choong-Tsejk,梁小曼，等.原发性肝癌9号染色体等位基因杂合性丢失研究。癌症，1999，18(1)：16～19
〔7〕 邵建永，李晓明，刘宗石等.原发性肝细胞癌1号染色体杂合子丢失的初步研究.中华病理学杂志，1999，28(1)：28～30.
〔8〕 Schleiermacher G,Delattre O,Peter M,et al. Clinical relevance of loss of heterozygosity of the short arm of chromosome 1 in neuroblastoma: a single-institution study〔J〕. Int J Cancer,1996,69：73～78.
〔9〕 Bieche I,Champeme MH,Matifas F,et al. Two distinct regions involved in 1p deletion in human primary breast cancer〔J〕. Cancer Res,1993,53：1990～1994.
, http://www.100md.com
〔10〕 Yeh SH,Chen PJ,Chen HL,et al. Frequent genetic alterations at the distal region of chromosome 1p in human hepatocellular carcinomas〔J〕. Cancer Res 1994,54：4188～4192.
〔11〕 Kraus JA,Albrecht S,Wiestler OD,et al.Loss of heterozygosity on chromosome 1 in human hepatoblastoma〔J〕. Int J Cancer,1996,67：467～471.
〔12〕 Petersen S,Wolf G,Bockmuhl U,et al. Allelic loss on chromosome 10q in human lung cancer：association with tumor progression and metastatic phenotype〔J〕. Br J Cancer,1998,77：270～276.
, 百拇医药
〔13〕 Trybus TM,Burgess AC,Wojno KJ,et al.Distinct areas of allelic loss on chromosomal regions 10p and 10q in human prostate cancer〔J〕. Cancer Res,1996,56：2263～2267.
〔14〕 Tsuda H,Zhang WD,Shimosato Y,et al. Allele loss on chromosome 16 associated with progression of human hepatocellular carcinoma〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87：6791～ 6794.
〔15〕 Walker GJ,Hayward NK,Falvey S,et al. Loss of somatic heterozygosity in hepatocellulr carcinoma〔J〕. Cancer Res,1991,51：4367～4370.
, http://www.100md.com
〔16〕 Teramoto T,Satonaka K,Kitazawa S,et al.p53 gene abnormalities are closely related to hepatoviral infections and occur at the late stage of hepatocarcinogenesis〔J〕. Cancer Res,1994,54：231～235.
〔17〕 Piao Z,Kim H,Jeon BK,et al. Relationship between loss of heterozygosity of tumor suppressor genes and histologic differentiation in hepatocellular carcinoma〔J〕. Cancer,1997,80：865～872.
〔18〕 Benvegnu L,Fattovich G,Noventa F,et al. Concurrent hepatitis B and C virus infection and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis. A prospective study〔J〕. Cancer,1994,74：2442～2448.
收稿日期：1998-11-24；修回日期：1999-01-25, 百拇医药