毛细管区带电泳测定伸筋丹胶囊中士的宁和马钱子碱的含量
作者：姜舜尧 金瓯 黄宗玉 田颂九
单位：姜舜尧 金 瓯 黄宗玉 浙江省药品检验所(杭州 310004)；田颂九 中国药品生物制品检定所
关键词：毛细管区带电泳；伸筋丹胶囊；士的宁；马钱子碱
毛细管区带电泳测定伸筋丹胶囊中 士的宁和马钱子碱的含量 摘 要 应用毛细管区带电泳法，对伸筋丹胶囊中的士的宁和马钱子碱成分进行了分离研究。采用pH=6.0的0.2 mol/L tris-磷酸溶液作为缓冲液；运行电压20 kV；检测波长为260 nm，被测成分可得到较好分离。用内标法测定其含量，结果表明，在0.02～0.15 mg/mL范围内，士的宁和马钱子碱均与内标峰面积之比呈良好线性关系，平均回收率分别为95.1%(RSD=2.8%)和96.4%(RSD=3.0%)。
Determination of Strychnine and Brucine in Shenjindan Capsule
, http://www.100md.com
by Capillary Zone Electrophoresis
Jiang Shunyao, Tian Songjiu, Jin Ou, et al.
(Zhejiang Institute for Drug Control, Hangzhou 310004)
Abstract A capillary zone electrophoresis method was established for the determination of strychnine and brucine in Shenjindan capsule, a preparation composed of 8 different TCM including Semen Strychni and dried earthworm for relieving rigidity of muscles by promoting blood circulation to remove blood stasis. 0.2 mol/L tris-H3PO4(pH=6.0) was used as running buffer, running voltage was 20 kV, and UV absorbance detection was set at 260 nm, This method can give a good separation for the determination of strychnine and brucine. By using internal standard the calibration curve showed good linearity for strychnine and brucine, average recovery was 95.1% for strychnine and 96.4% for burcine.
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Key words capillary zone electrophonesis Shenjindan capsule strychnine brucine
伸筋丹胶囊由马钱子、地龙等8味中药组成，具舒筋通络、活血去瘀、消肿止痛的功效[1]。其中的马钱子有剧毒，一般要求对马钱子中所含的有效成分士的宁和马钱子碱进行定量控制。报道士的宁和马钱子碱的含量测定方法有比色法、紫外分光光度法、薄层色谱扫描和高效液相色谱法等[2]，药品质量标准则多采用薄层色谱扫描法[3]。我们运用毛细管区带电泳对伸筋丹胶囊中的士的宁和马钱子碱进行了分离研究，并采用内标法测定了其含量，为测定中药制剂中士的宁和马钱子碱的含量提供了一种新的方法。
1 仪器、试剂和药品
Beckman P/ACE 5500 型高效毛细管电泳仪(配备二极管阵列检测器)，System Gold软件。
, http://www.100md.com
对照品士的宁、马钱子碱由中国药品生物制品检定所提供；盐酸伊托必利(itopride hydrochloride)；伸筋丹胶囊三批(山东A公司生产，批号：980301 980303，浙江B厂生产，批号：980426)；三羟基甲基氨基甲烷(tris)为优级纯；甲醇、氯仿、氨水、磷酸均为分析醇；水为二次重蒸馏水。
2 实验方法和结果
2.1 测定条件：石英毛细管柱内径50 μm,总长度47 cm，有效长度40 cm，毛细管柱控温23℃；波长260 nm；运行缓冲液为0.2 mol/L tris 溶液(用磷酸调节pH至6.0)；进样方式：压力进样，进样时间10 s，进样后再用50%的甲醇溶液进1 s；运行电压20 kV(运行电流约59 μA)；柱清洗：每次进样前分别用水、缓冲液各冲洗3 min。
2.2 对照品溶液和内标溶液的配制和测定：精密称取对照品士的宁、马钱子碱适量，加甲醇制成每毫升各含0.5 mg的混合对照品溶液；另取内标盐酸伊托必利适量，加水制成每毫升含0.5 mg的内标溶液。使用时取混合对照品溶液1 mL，内标溶液1 mL，加0.2 mol/L磷酸溶液0.5 mL，甲醇1.5 mL，加水适量定容至5 mL，进样测定，分离图谱见图1。
, 百拇医药
1-内标 2-士的宁 3-马钱子碱
图1 对照品和内标分离图谱
2.3 供试品溶液的制备和测定：取本品内容物1 g，精密称定，加浓氨试液2 mL，氯仿-乙醇(10∶1)溶液40 mL，超声处理10 min，静置24 h，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇温热使溶解，定容于5 mL量瓶中。取溶液2 mL，加内标溶液1 mL，0.2 mol/L磷酸溶液0.5 mL，甲醇0.5 mL，加水适量定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液进样测定，分离图谱见图2。
1-内标 2-士的宁 3-马钱子碱
图2 供试品分离图谱
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2.4 空白对照实验：模拟处方制得缺马钱子空白对照液，按供试品溶液的制备方法制备，测定，分离图谱见图3，结果表明空白无干扰。
图3 空白对照分离图谱
2.5 线性范围：分别量取混合对照品溶液0.2、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL至5 mL量瓶中，各加入内标溶液1 mL，加入0.2 mol/L磷酸溶液0.5 mL，加水和甲醇适量稀释至刻度(甲醇浓度为50%)，按选定的方法测定，所得的士的宁峰面积与内标峰面积的比值(Y1)、马钱子碱峰面积与内标峰面积的比值(Y2)，分别和混合对照品溶液中的士的宁浓度(X1，mg/mL)、马钱子碱浓度(X2，mg/mL)作回归处理，线形范围均为0.020～0.15 mg/mL，回归方程分别为：
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Y1=11.49X1+0.717×10-4,r=0.9992
Y2=7.66X2+4.522×10-4，r=0.9994
2.6 精密度及方法的重现性：对同一份对照品溶液重复进样6次，测定其士的宁、马钱子碱峰面积与内标峰面积的比值，计算RSD分别为0.5%和1.0%(n=6)；精密称取同批样品各6份，按选定的方法测定士的宁和马钱子碱含量，计算RSD分别为2.4%和3.0%(n=6)。
2.7 回收实验：采用加样回收法，取已知含量的样品加入定量的士的宁和马钱子碱对照品各6份，测定，结果平均回收率分别为95.1%和96.4%，RSD分别为2.85%和3.05%(n=6)。
2.8 样品测定结果：按上述选定方法测定3批伸筋丹胶囊中士的宁和马钱子碱的含量，结果见表1。
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表1 伸筋丹胶囊中士的宁和马钱子碱含量测定结果
批号
士的宁含量(mg/g)
马钱子碱含量(mg/g)
980301
1.56
1.26
980303
1.29
1.13
980426
0.67
, 百拇医药
0.48
3 讨论
3.1 缓冲液：缓冲液的pH值、浓度对样品分离均有影响。考虑士的宁的pka为8.26，马钱子碱的pk1为6.04(pk2为11.7)[4],所以对tris缓冲液在pH6～8范围作了考察(0.2 mol/L tris溶液用磷酸调节pH值)，结果以缓冲液pH 6.0的分离效果最佳，缓冲液pH对士的宁、马钱子碱的μep(electrophoresis mobility)[5]的影响见图4。对不同浓度的tris缓冲液进行比较，结果表明随着缓冲液浓度的增加，分离情况渐好，0.2 mol/L tris缓冲液可得到较为满意的分离。另用磷酸盐(80 mmol/L，pH=6.0)作为缓冲液进行了试验，结果分离效果差。tris缓冲液不同浓度、磷酸缓冲液与运行电流值的关系及对士的宁、马钱子碱之间分离度(R)的影响见表2。
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1-士的宁的μep 2-马钱子的μep
图4 缓冲液pH对士的宁和马钱子碱μep的影响
表2 缓冲液(mmol/L)与电流的关系及对分离度(R)影响(电压=0.2 kV)
缓冲液
50
100
150
200
80
(pH=6.0)
, 百拇医药 (mmol/L tris磷酸)
电流值(μA)
19
34
48
59
56
分离度(R)
2.7
4.2
4.6
5.7
3.4
, 百拇医药
实验结果表明，采用pH=6.0的0.2 mol/L tris溶液可使内标峰、士的宁峰和马钱子碱峰之间及与邻近其它杂质峰得到比较好的分离。
3.2 电泳谱带展宽：沿用色谱的塔板高度概念，测得理论板数按士的宁峰计约为28万。3.3 供试品的溶解溶媒：实验发现，在供试品的溶解溶媒中加一定浓度的磷酸，则士的宁和马钱子碱的峰形变好，而且回收率高，表明磷酸对士的宁和马钱子碱的溶解性及其峰形有影响；而对含不同甲醇浓度的溶解溶媒(甲醇浓度分别为30%、50%、60%，均含有20 mmol/L磷酸)进行试验比较，则定量结果基本相同，分离的峰形均尚可。
3.4 供试品的提取和分离：实验发现样品直接用浓氨-氯仿提取则难以过滤，加入一定浓度的乙醇可使滤过顺利；因样品中含较多的脂溶性成分(乳香、没药等)，所以用甲醇溶解的样品提取物加入水后会有不溶物产生，应用微孔滤膜可滤去不溶物。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 中华人民共和国卫生部.药品标准中药成方制剂第十六册，1998：57
2 阴 健主编.中药现代研究与临床应用.北京：学苑出版社1995：118
3 中华人民共和国药典(1995年版).一部.北京：人民卫生出版社，372
4 Merck Index.12th ed.Merck,Rahway,NJ,1996：1512、237
5 Weiberger R.Practical Capillary Electrophoresis.Academic.press，NewYork,1993：22
(1998-09-23收稿), 百拇医药
单位：姜舜尧 金 瓯 黄宗玉 浙江省药品检验所(杭州 310004)；田颂九 中国药品生物制品检定所
关键词：毛细管区带电泳；伸筋丹胶囊；士的宁；马钱子碱
毛细管区带电泳测定伸筋丹胶囊中 士的宁和马钱子碱的含量 摘 要 应用毛细管区带电泳法，对伸筋丹胶囊中的士的宁和马钱子碱成分进行了分离研究。采用pH=6.0的0.2 mol/L tris-磷酸溶液作为缓冲液；运行电压20 kV；检测波长为260 nm，被测成分可得到较好分离。用内标法测定其含量，结果表明，在0.02～0.15 mg/mL范围内，士的宁和马钱子碱均与内标峰面积之比呈良好线性关系，平均回收率分别为95.1%(RSD=2.8%)和96.4%(RSD=3.0%)。
Determination of Strychnine and Brucine in Shenjindan Capsule
, http://www.100md.com
by Capillary Zone Electrophoresis
Jiang Shunyao, Tian Songjiu, Jin Ou, et al.
(Zhejiang Institute for Drug Control, Hangzhou 310004)
Abstract A capillary zone electrophoresis method was established for the determination of strychnine and brucine in Shenjindan capsule, a preparation composed of 8 different TCM including Semen Strychni and dried earthworm for relieving rigidity of muscles by promoting blood circulation to remove blood stasis. 0.2 mol/L tris-H3PO4(pH=6.0) was used as running buffer, running voltage was 20 kV, and UV absorbance detection was set at 260 nm, This method can give a good separation for the determination of strychnine and brucine. By using internal standard the calibration curve showed good linearity for strychnine and brucine, average recovery was 95.1% for strychnine and 96.4% for burcine.
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Key words capillary zone electrophonesis Shenjindan capsule strychnine brucine
伸筋丹胶囊由马钱子、地龙等8味中药组成，具舒筋通络、活血去瘀、消肿止痛的功效[1]。其中的马钱子有剧毒，一般要求对马钱子中所含的有效成分士的宁和马钱子碱进行定量控制。报道士的宁和马钱子碱的含量测定方法有比色法、紫外分光光度法、薄层色谱扫描和高效液相色谱法等[2]，药品质量标准则多采用薄层色谱扫描法[3]。我们运用毛细管区带电泳对伸筋丹胶囊中的士的宁和马钱子碱进行了分离研究，并采用内标法测定了其含量，为测定中药制剂中士的宁和马钱子碱的含量提供了一种新的方法。
1 仪器、试剂和药品
Beckman P/ACE 5500 型高效毛细管电泳仪(配备二极管阵列检测器)，System Gold软件。
, http://www.100md.com
对照品士的宁、马钱子碱由中国药品生物制品检定所提供；盐酸伊托必利(itopride hydrochloride)；伸筋丹胶囊三批(山东A公司生产，批号：980301 980303，浙江B厂生产，批号：980426)；三羟基甲基氨基甲烷(tris)为优级纯；甲醇、氯仿、氨水、磷酸均为分析醇；水为二次重蒸馏水。
2 实验方法和结果
2.1 测定条件：石英毛细管柱内径50 μm,总长度47 cm，有效长度40 cm，毛细管柱控温23℃；波长260 nm；运行缓冲液为0.2 mol/L tris 溶液(用磷酸调节pH至6.0)；进样方式：压力进样，进样时间10 s，进样后再用50%的甲醇溶液进1 s；运行电压20 kV(运行电流约59 μA)；柱清洗：每次进样前分别用水、缓冲液各冲洗3 min。
2.2 对照品溶液和内标溶液的配制和测定：精密称取对照品士的宁、马钱子碱适量，加甲醇制成每毫升各含0.5 mg的混合对照品溶液；另取内标盐酸伊托必利适量，加水制成每毫升含0.5 mg的内标溶液。使用时取混合对照品溶液1 mL，内标溶液1 mL，加0.2 mol/L磷酸溶液0.5 mL，甲醇1.5 mL，加水适量定容至5 mL，进样测定，分离图谱见图1。
, 百拇医药
1-内标 2-士的宁 3-马钱子碱
图1 对照品和内标分离图谱
2.3 供试品溶液的制备和测定：取本品内容物1 g，精密称定，加浓氨试液2 mL，氯仿-乙醇(10∶1)溶液40 mL，超声处理10 min，静置24 h，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇温热使溶解，定容于5 mL量瓶中。取溶液2 mL，加内标溶液1 mL，0.2 mol/L磷酸溶液0.5 mL，甲醇0.5 mL，加水适量定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液进样测定，分离图谱见图2。
1-内标 2-士的宁 3-马钱子碱
图2 供试品分离图谱
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2.4 空白对照实验：模拟处方制得缺马钱子空白对照液，按供试品溶液的制备方法制备，测定，分离图谱见图3，结果表明空白无干扰。
图3 空白对照分离图谱
2.5 线性范围：分别量取混合对照品溶液0.2、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL至5 mL量瓶中，各加入内标溶液1 mL，加入0.2 mol/L磷酸溶液0.5 mL，加水和甲醇适量稀释至刻度(甲醇浓度为50%)，按选定的方法测定，所得的士的宁峰面积与内标峰面积的比值(Y1)、马钱子碱峰面积与内标峰面积的比值(Y2)，分别和混合对照品溶液中的士的宁浓度(X1，mg/mL)、马钱子碱浓度(X2，mg/mL)作回归处理，线形范围均为0.020～0.15 mg/mL，回归方程分别为：
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Y1=11.49X1+0.717×10-4,r=0.9992
Y2=7.66X2+4.522×10-4，r=0.9994
2.6 精密度及方法的重现性：对同一份对照品溶液重复进样6次，测定其士的宁、马钱子碱峰面积与内标峰面积的比值，计算RSD分别为0.5%和1.0%(n=6)；精密称取同批样品各6份，按选定的方法测定士的宁和马钱子碱含量，计算RSD分别为2.4%和3.0%(n=6)。
2.7 回收实验：采用加样回收法，取已知含量的样品加入定量的士的宁和马钱子碱对照品各6份，测定，结果平均回收率分别为95.1%和96.4%，RSD分别为2.85%和3.05%(n=6)。
2.8 样品测定结果：按上述选定方法测定3批伸筋丹胶囊中士的宁和马钱子碱的含量，结果见表1。
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表1 伸筋丹胶囊中士的宁和马钱子碱含量测定结果
批号
士的宁含量(mg/g)
马钱子碱含量(mg/g)
980301
1.56
1.26
980303
1.29
1.13
980426
0.67
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0.48
3 讨论
3.1 缓冲液：缓冲液的pH值、浓度对样品分离均有影响。考虑士的宁的pka为8.26，马钱子碱的pk1为6.04(pk2为11.7)[4],所以对tris缓冲液在pH6～8范围作了考察(0.2 mol/L tris溶液用磷酸调节pH值)，结果以缓冲液pH 6.0的分离效果最佳，缓冲液pH对士的宁、马钱子碱的μep(electrophoresis mobility)[5]的影响见图4。对不同浓度的tris缓冲液进行比较，结果表明随着缓冲液浓度的增加，分离情况渐好，0.2 mol/L tris缓冲液可得到较为满意的分离。另用磷酸盐(80 mmol/L，pH=6.0)作为缓冲液进行了试验，结果分离效果差。tris缓冲液不同浓度、磷酸缓冲液与运行电流值的关系及对士的宁、马钱子碱之间分离度(R)的影响见表2。
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1-士的宁的μep 2-马钱子的μep
图4 缓冲液pH对士的宁和马钱子碱μep的影响
表2 缓冲液(mmol/L)与电流的关系及对分离度(R)影响(电压=0.2 kV)
缓冲液
50
100
150
200
80
(pH=6.0)
, 百拇医药 (mmol/L tris磷酸)
电流值(μA)
19
34
48
59
56
分离度(R)
2.7
4.2
4.6
5.7
3.4
, 百拇医药
实验结果表明，采用pH=6.0的0.2 mol/L tris溶液可使内标峰、士的宁峰和马钱子碱峰之间及与邻近其它杂质峰得到比较好的分离。
3.2 电泳谱带展宽：沿用色谱的塔板高度概念，测得理论板数按士的宁峰计约为28万。3.3 供试品的溶解溶媒：实验发现，在供试品的溶解溶媒中加一定浓度的磷酸，则士的宁和马钱子碱的峰形变好，而且回收率高，表明磷酸对士的宁和马钱子碱的溶解性及其峰形有影响；而对含不同甲醇浓度的溶解溶媒(甲醇浓度分别为30%、50%、60%，均含有20 mmol/L磷酸)进行试验比较，则定量结果基本相同，分离的峰形均尚可。
3.4 供试品的提取和分离：实验发现样品直接用浓氨-氯仿提取则难以过滤，加入一定浓度的乙醇可使滤过顺利；因样品中含较多的脂溶性成分(乳香、没药等)，所以用甲醇溶解的样品提取物加入水后会有不溶物产生，应用微孔滤膜可滤去不溶物。
参 考 文 献
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1 中华人民共和国卫生部.药品标准中药成方制剂第十六册，1998：57
2 阴 健主编.中药现代研究与临床应用.北京：学苑出版社1995：118
3 中华人民共和国药典(1995年版).一部.北京：人民卫生出版社，372
4 Merck Index.12th ed.Merck,Rahway,NJ,1996：1512、237
5 Weiberger R.Practical Capillary Electrophoresis.Academic.press，NewYork,1993：22
(1998-09-23收稿), 百拇医药