环磷酰胺对大鼠早期胚胎发育里程的影响*
作者：朱卡林 洪缨 楼宜嘉
单位：杭州 310031 浙江大学药学院药理教研室
关键词：环磷酰胺；胚泡；发育毒性；药源性异常
中国现代应用药学990501摘要 目的：为探索烷化剂对哺乳动物早期胚胎发育里程的影响及其可能的机制。方法：孕大鼠第3天ip环磷酰胺(Cyc 10、20、40mg/kg)，孕第4天评价胚胎的胚胎化作用，胚胎发育时相，及蜕变胚胎率；同时显微外科分离胚胎内细胞团及滋养层细胞，评价两群细胞受损情况。结果：在Cyc 10mg/kg时，胚胎的胚泡化作用，胚胎发育时相均未受明显影响；40mg/kg时，蜕变胚胎率明显提高。胚泡化率及胚胎细胞数呈剂量依赖性减少，其中内细胞团细胞减少尤甚。结论：Cyc在未引起早期胚胎蜕变率显著增加时，可影响细胞周期，但不影响发育里程；高剂量时，显著影响发育里程并伴蜕变率显著增加。
, 百拇医药 Effects of cyclophosphamide on early rat embryo developmental landmark
Zhu Kalin(Zhu KL),Hong Ying(Hong Y),Lou Yijia(Lou YJ)
School of pharmacy,Zhejiang university hubin campus,Hangzhou 310006
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effects of alkylate on the developmental mileage of early mammal embryos and the possible mechanism.METHOD：Pregnant rats on d3 of gestation were given ip cyclophosphamide(Cyc)10,20,40mg/kg.On d4,the blastulation,the developmental phase of embryos and the frequency of degenerated blastocysts were evaluated.Inner cell mass(ICM)and trophectoderm(TE)were isolated by immunosurgery and the damages on the two cell lineages were evaluated.RESULTS：In Cyc 10mg/kg group,no significant difference were observed on the blastulation and the developmental phase of embryos.In Cyc 40mg/kg group,the frequency of degenerated blastocysts was markedly increased,while the frequency of blastulation and the cell number of blastocysts were decreased in a dose-dependent manner.The reduction was more severe in ICM.CONCLUSION：When Cyc had not induced no significant increase in the frequency of degenerated blastocysts,the cell cycle was influenced by Cyc,but the developmental landmark was not changed.Marked effect on the developmental mileage and marked increase in the frequecy of degenerated blastocysts were obviously observed in Cyc 40mg/kg.
, 百拇医药
KEY WORDS cyclophosphamide,blastocyst,developmental toxicity,drug-induced abnormalities
近年来，抗肿瘤药对早期胚胎的发育毒性及其机制研究，日益引起关注[1～3]。因为抗肿瘤药大多具有细胞毒性与遗传毒性，而早期胚胎蕴藏的细胞信号和遗传信息量很大，早期损伤可给胚胎后期发育带来较大的损害[3]。本文研究妊娠大鼠孕第3天给环磷酰胺(cyclophosphamide,Cyc)，对早期胚胎发育里程的影响，为育龄妇女烷化剂化疗后，对胚胎可能存在的潜在危害提供实验依据。
1 材料与方法
Cyc(Sigma产品)。Sprague-Dawley大鼠，♀9周龄，204±s 15g，♂成年，213±s17g(浙江大学湖滨校区实验动物中心提供，医动字第22-9601018号)，动物水食自由，12h明/12h暗，21℃，相对湿度55%，环境稳定2周后供用。
, 百拇医药
孕鼠处理。♀鼠阴道涂片有精子之日为孕(第0天)。孕第3天上午9：00，ipCyc10、20、40mg/kg，(Cyc于临用前以生理盐水配制)。对照组ip同容量生理盐水。
早期胚胎发育里程显微形态观察。第4天13：00～15：00，孕鼠颈椎脱臼处死。取子宫，以生理盐水洗涤后，每侧子宫用1ml生理盐水灌注，收集胚胎于96孔细胞培养板(NUNU,Nulcon,Denmark)，每孔置一胚胎。光学显微镜下(X100)观察胚胎形态。以具有滋养层、内细胞团及胚泡腔的胚胎，定义为胚泡，作为早期胚胎的一个发育里程指标[4，5]；以未见胚泡腔的致密化细胞团定义为桑椹胚，以呈大小不一空泡状，未致密化的细胞团作为蜕变胚胎[2]，桑椹胚及蜕变胚胎均列为未达胚泡化发育里程。
胚泡显微外科及其细胞学评价。经显微形态评价后，胚泡化胚胎分成两部分。一部分行胚泡显微外科术，分离胚泡滋养层细胞和内细胞团(ICM)细胞，作细胞学评价；另一部分作全胚胎细胞学评价。
, http://www.100md.com
按文献[2]制备多克隆抗体，以M2营养液1：5 V：V稀释。将胚胎置该抗体中预处理后，以补体溶解滋养层细胞，显微分离ICM。
胚泡及经显微外科分离的ICM，分别在0.7%枸橼酸钠中低渗处理，空气干燥，Giemsa染色，核象图在油镜下(X1000)作细胞计数。
为比较母体Cyc染毒对胚泡及ICM发育的抑制程度差异，以胚泡细胞数(cell number of per blastocyst,CNPB)和ICM细胞数(cell number of ICM,ICMCN)占对照组CNPB和CNICM的百分率表示，并比较其差异的显著性。
统计处理。胚泡化率和未胚泡化率用x2检验，细胞数用t检验，各剂量组细胞数占对照组细胞数百分率用u检验，进行显著性检验。
2 结 果
, 百拇医药
Cyc对胚泡发育里程的影响。大鼠孕第3天ipCyc胚泡化率与剂量呈负相关性，当剂量达40mg/kg时，着床前胚胎的胚泡化作用(blastulation)明显受阻，呈蜕变状胚胎显著增多(p<0.01)。非胚泡化率与Cyc剂量呈正相关性，但其中桑椹胚给药组与溶剂对照组间无显著性差异。蜕变胚胎率呈剂量依赖性增高(r=0.986)(见表1)，为早期胚胎非胚泡化率提高的主要原因，提示Cyc对早期胚胎发育里程影响的宏观环节不在桑椹胚进入胚泡这一步，而是由于某种微观的原因蜕变而致。
表1 孕第3天ip环磷酰胺(Cyc)对大鼠孕第4天胚胎发育里程的影响(n=8～10,
±s) Cyc/mg.kg-1
, 百拇医药 胚泡/n
胚泡化率/%
未胚泡化/%
蜕变胚泡/%
桑椹胚/%
0
44
88.6(39/44)
11.4(5/44)
0(0/44)
11.4(5/44)
10
60
, 百拇医药
88.3(53/60)
11.7(7/60)
1.7(1/60)
10.0(6/60)
20
67
80.6(54/76)
19.4(13/67)
8.9*1(6/67)
10.4(7/67)
40
78
, 百拇医药
66.7*2(52/78)
33.3*2(26/78)
20.5*3(16/78)
12.8(10/78)
注：*1P<0.05，*2P<0.01，*3P<0.001，vs control
Cyc对胚泡及ICM的细胞学影响。大鼠孕第3天ip Cyc可见CNPB及CNICM均呈剂量依赖性减少，其抑制百分率与对数剂量呈负相关性(r=-0.993)，但两者减少不呈平行关系，以CNICM减少更甚(见图1)。
, 百拇医药
图1 孕第3天ipCyc对大鼠孕第4天胚胎泡细胞数
CNPB(○)和内细胞团细胞数ICMCN(●)的影响
1-胚泡细胞数%对照组；2-内细胞团细胞数%对照组
3 讨 论
近年来，对药源性早期胚胎损伤的研究已受到关注。文献报道[6]，抗肿瘤药甲基亚硝基脲可改变小鼠胚泡发育程序，并由此影响移植胚胎出生后幼仔的远期损伤。提示抗肿瘤药对早期胚胎损伤具有潜在危害。前文报道[2]，烷化剂Cyc可导致大鼠早期胚胎遗传物质损伤，且主要影响胚泡的内细胞团。
鉴于胚胎的胚泡化作用是早期胚胎发育的一个重要发育里程，而且胚胎的蜕变现象则是早期胚胎受到致命性损伤的宏观指标之一[2]，因此，本研究观察孕后第3天ipCyc后，两者变化的差异及其与剂量的相关性。结果表明，大鼠早期胚胎的胚泡化作用与Cyc呈剂量负相关性。提示随着Cyc剂量的增高，大鼠早期胚胎发育明显受阻。其中给药组与溶剂组桑椹胚率无显著差异，而蜕变胚胎率都是剂量依赖的增高，中、高剂量组与溶剂对照组具有显著与极显著差异。提示蜕变胚胎率提高是非胚泡化率提高的主要原因。
, 百拇医药
为从细胞生物学角度评价Cyc对胚泡化作用可能存在的影响，本研究采用显微外科法，去除胚泡的滋养层细胞(着床后主要发育成胚外组织)，分别评价，Cyc对胚泡滋养层细胞及内细胞团(着床后主要发育成胚胎组织)细胞的影响及其损伤程度。
结果发现，Cyc对两群细胞均有影响，表现为细胞数呈剂量依赖性减少，但两者减少并不平行，内细胞团细胞减少尤甚。可见早期胚胎及其内细胞团细胞的显著减少并不完全影响桑椹胚的胚泡化作用，但可造成桑椹胚的蜕变。鉴于早期胚胎细胞数显著减少，一般与其细胞周期延长或微管或纺锤体功能损伤有关[7，8]推测蜕变胚胎可能与上述毒理作用有关。Cyc影响早期胚胎发育存在着毒性阈值，未达一定阈值，即使ICM细胞减少非常显著，仍可完成胚泡的发育里程，但若达到一定阈值，则桑椹胚不能生存，呈蜕变状。
综上所述，Cyc在不影响大鼠胚泡化作用时伴有ICM细胞明显减少，可能对胚胎发育远期毒理学意义。
, http://www.100md.com
注:国家自然科学基金资助课题NO.39470836，浙江省自然科学基金资助课题NO.398458
参考文献
1 Perez GI,Knudson CM,Keykin L,et al.Apoptosis-associated signaling pathways are required for chemotherapy-mediated female germ cell destruction.Nature Med,1997,3∶1228.
2 Lou YJ,Hong Y.Immunosurgical studies on cytological and cytogenetic toxicity analysis of rat blastocysts after in vivo exposure to cyclophosphamide.Acta Pharmacol Sin,1997,18∶259.
, http://www.100md.com
3 Fein A,Ben NO,Wengier N,et al.The effects of cyclophosphamide on rat blastocysts in vitro and their subsequent development following transfer to pseudopregnant rats.Isr J Med Sci,1996,32∶129.
4 Pampfer S,Hertogh RD,Vanderheyden I,et al.Decreasedinner cell mass proportion in blastocysts from diabetic rats.Diabetes,1990,39∶471.
5 Manson JM,Wise LD.Teratogens.In:Amdur MD,Doull J,Klaassen CD editors:Casarett and Doull's Toxicology.The basic science of poisons.4th.New York:Pergamon Press,1991∶226.
, 百拇医药
6 Rutledge JC.Developmental toxicity induced during early stages of mammalian embryogenesis.Mutat Res,1997,396∶113.
7 Gardener HG,Kaye PL.Insulin increases cell numbers and morphological development in mouse pre-implantation embryos in vitro.Reprod Fertil Dev,1991,3∶79.
8 Maro B,Gueth-Hallonet C,Ashion J,Antony C.Cell polarity and microtubule organization during mouse early embryogenesis.Dev suppl,1991,1∶17.
收稿日期：1998-12-04, 百拇医药
单位：杭州 310031 浙江大学药学院药理教研室
关键词：环磷酰胺；胚泡；发育毒性；药源性异常
中国现代应用药学990501摘要 目的：为探索烷化剂对哺乳动物早期胚胎发育里程的影响及其可能的机制。方法：孕大鼠第3天ip环磷酰胺(Cyc 10、20、40mg/kg)，孕第4天评价胚胎的胚胎化作用，胚胎发育时相，及蜕变胚胎率；同时显微外科分离胚胎内细胞团及滋养层细胞，评价两群细胞受损情况。结果：在Cyc 10mg/kg时，胚胎的胚泡化作用，胚胎发育时相均未受明显影响；40mg/kg时，蜕变胚胎率明显提高。胚泡化率及胚胎细胞数呈剂量依赖性减少，其中内细胞团细胞减少尤甚。结论：Cyc在未引起早期胚胎蜕变率显著增加时，可影响细胞周期，但不影响发育里程；高剂量时，显著影响发育里程并伴蜕变率显著增加。
, 百拇医药 Effects of cyclophosphamide on early rat embryo developmental landmark
Zhu Kalin(Zhu KL),Hong Ying(Hong Y),Lou Yijia(Lou YJ)
School of pharmacy,Zhejiang university hubin campus,Hangzhou 310006
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effects of alkylate on the developmental mileage of early mammal embryos and the possible mechanism.METHOD：Pregnant rats on d3 of gestation were given ip cyclophosphamide(Cyc)10,20,40mg/kg.On d4,the blastulation,the developmental phase of embryos and the frequency of degenerated blastocysts were evaluated.Inner cell mass(ICM)and trophectoderm(TE)were isolated by immunosurgery and the damages on the two cell lineages were evaluated.RESULTS：In Cyc 10mg/kg group,no significant difference were observed on the blastulation and the developmental phase of embryos.In Cyc 40mg/kg group,the frequency of degenerated blastocysts was markedly increased,while the frequency of blastulation and the cell number of blastocysts were decreased in a dose-dependent manner.The reduction was more severe in ICM.CONCLUSION：When Cyc had not induced no significant increase in the frequency of degenerated blastocysts,the cell cycle was influenced by Cyc,but the developmental landmark was not changed.Marked effect on the developmental mileage and marked increase in the frequecy of degenerated blastocysts were obviously observed in Cyc 40mg/kg.
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KEY WORDS cyclophosphamide,blastocyst,developmental toxicity,drug-induced abnormalities
近年来，抗肿瘤药对早期胚胎的发育毒性及其机制研究，日益引起关注[1～3]。因为抗肿瘤药大多具有细胞毒性与遗传毒性，而早期胚胎蕴藏的细胞信号和遗传信息量很大，早期损伤可给胚胎后期发育带来较大的损害[3]。本文研究妊娠大鼠孕第3天给环磷酰胺(cyclophosphamide,Cyc)，对早期胚胎发育里程的影响，为育龄妇女烷化剂化疗后，对胚胎可能存在的潜在危害提供实验依据。
1 材料与方法
Cyc(Sigma产品)。Sprague-Dawley大鼠，♀9周龄，204±s 15g，♂成年，213±s17g(浙江大学湖滨校区实验动物中心提供，医动字第22-9601018号)，动物水食自由，12h明/12h暗，21℃，相对湿度55%，环境稳定2周后供用。
, 百拇医药
孕鼠处理。♀鼠阴道涂片有精子之日为孕(第0天)。孕第3天上午9：00，ipCyc10、20、40mg/kg，(Cyc于临用前以生理盐水配制)。对照组ip同容量生理盐水。
早期胚胎发育里程显微形态观察。第4天13：00～15：00，孕鼠颈椎脱臼处死。取子宫，以生理盐水洗涤后，每侧子宫用1ml生理盐水灌注，收集胚胎于96孔细胞培养板(NUNU,Nulcon,Denmark)，每孔置一胚胎。光学显微镜下(X100)观察胚胎形态。以具有滋养层、内细胞团及胚泡腔的胚胎，定义为胚泡，作为早期胚胎的一个发育里程指标[4，5]；以未见胚泡腔的致密化细胞团定义为桑椹胚，以呈大小不一空泡状，未致密化的细胞团作为蜕变胚胎[2]，桑椹胚及蜕变胚胎均列为未达胚泡化发育里程。
胚泡显微外科及其细胞学评价。经显微形态评价后，胚泡化胚胎分成两部分。一部分行胚泡显微外科术，分离胚泡滋养层细胞和内细胞团(ICM)细胞，作细胞学评价；另一部分作全胚胎细胞学评价。
, http://www.100md.com
按文献[2]制备多克隆抗体，以M2营养液1：5 V：V稀释。将胚胎置该抗体中预处理后，以补体溶解滋养层细胞，显微分离ICM。
胚泡及经显微外科分离的ICM，分别在0.7%枸橼酸钠中低渗处理，空气干燥，Giemsa染色，核象图在油镜下(X1000)作细胞计数。
为比较母体Cyc染毒对胚泡及ICM发育的抑制程度差异，以胚泡细胞数(cell number of per blastocyst,CNPB)和ICM细胞数(cell number of ICM,ICMCN)占对照组CNPB和CNICM的百分率表示，并比较其差异的显著性。
统计处理。胚泡化率和未胚泡化率用x2检验，细胞数用t检验，各剂量组细胞数占对照组细胞数百分率用u检验，进行显著性检验。
2 结 果
, 百拇医药
Cyc对胚泡发育里程的影响。大鼠孕第3天ipCyc胚泡化率与剂量呈负相关性，当剂量达40mg/kg时，着床前胚胎的胚泡化作用(blastulation)明显受阻，呈蜕变状胚胎显著增多(p<0.01)。非胚泡化率与Cyc剂量呈正相关性，但其中桑椹胚给药组与溶剂对照组间无显著性差异。蜕变胚胎率呈剂量依赖性增高(r=0.986)(见表1)，为早期胚胎非胚泡化率提高的主要原因，提示Cyc对早期胚胎发育里程影响的宏观环节不在桑椹胚进入胚泡这一步，而是由于某种微观的原因蜕变而致。
表1 孕第3天ip环磷酰胺(Cyc)对大鼠孕第4天胚胎发育里程的影响(n=8～10,
±s) Cyc/mg.kg-1, 百拇医药 胚泡/n
胚泡化率/%
未胚泡化/%
蜕变胚泡/%
桑椹胚/%
0
44
88.6(39/44)
11.4(5/44)
0(0/44)
11.4(5/44)
10
60
, 百拇医药
88.3(53/60)
11.7(7/60)
1.7(1/60)
10.0(6/60)
20
67
80.6(54/76)
19.4(13/67)
8.9*1(6/67)
10.4(7/67)
40
78
, 百拇医药
66.7*2(52/78)
33.3*2(26/78)
20.5*3(16/78)
12.8(10/78)
注：*1P<0.05，*2P<0.01，*3P<0.001，vs control
Cyc对胚泡及ICM的细胞学影响。大鼠孕第3天ip Cyc可见CNPB及CNICM均呈剂量依赖性减少，其抑制百分率与对数剂量呈负相关性(r=-0.993)，但两者减少不呈平行关系，以CNICM减少更甚(见图1)。
, 百拇医药
图1 孕第3天ipCyc对大鼠孕第4天胚胎泡细胞数
CNPB(○)和内细胞团细胞数ICMCN(●)的影响
1-胚泡细胞数%对照组；2-内细胞团细胞数%对照组
3 讨 论
近年来，对药源性早期胚胎损伤的研究已受到关注。文献报道[6]，抗肿瘤药甲基亚硝基脲可改变小鼠胚泡发育程序，并由此影响移植胚胎出生后幼仔的远期损伤。提示抗肿瘤药对早期胚胎损伤具有潜在危害。前文报道[2]，烷化剂Cyc可导致大鼠早期胚胎遗传物质损伤，且主要影响胚泡的内细胞团。
鉴于胚胎的胚泡化作用是早期胚胎发育的一个重要发育里程，而且胚胎的蜕变现象则是早期胚胎受到致命性损伤的宏观指标之一[2]，因此，本研究观察孕后第3天ipCyc后，两者变化的差异及其与剂量的相关性。结果表明，大鼠早期胚胎的胚泡化作用与Cyc呈剂量负相关性。提示随着Cyc剂量的增高，大鼠早期胚胎发育明显受阻。其中给药组与溶剂组桑椹胚率无显著差异，而蜕变胚胎率都是剂量依赖的增高，中、高剂量组与溶剂对照组具有显著与极显著差异。提示蜕变胚胎率提高是非胚泡化率提高的主要原因。
, 百拇医药
为从细胞生物学角度评价Cyc对胚泡化作用可能存在的影响，本研究采用显微外科法，去除胚泡的滋养层细胞(着床后主要发育成胚外组织)，分别评价，Cyc对胚泡滋养层细胞及内细胞团(着床后主要发育成胚胎组织)细胞的影响及其损伤程度。
结果发现，Cyc对两群细胞均有影响，表现为细胞数呈剂量依赖性减少，但两者减少并不平行，内细胞团细胞减少尤甚。可见早期胚胎及其内细胞团细胞的显著减少并不完全影响桑椹胚的胚泡化作用，但可造成桑椹胚的蜕变。鉴于早期胚胎细胞数显著减少，一般与其细胞周期延长或微管或纺锤体功能损伤有关[7，8]推测蜕变胚胎可能与上述毒理作用有关。Cyc影响早期胚胎发育存在着毒性阈值，未达一定阈值，即使ICM细胞减少非常显著，仍可完成胚泡的发育里程，但若达到一定阈值，则桑椹胚不能生存，呈蜕变状。
综上所述，Cyc在不影响大鼠胚泡化作用时伴有ICM细胞明显减少，可能对胚胎发育远期毒理学意义。
, http://www.100md.com
注:国家自然科学基金资助课题NO.39470836，浙江省自然科学基金资助课题NO.398458
参考文献
1 Perez GI,Knudson CM,Keykin L,et al.Apoptosis-associated signaling pathways are required for chemotherapy-mediated female germ cell destruction.Nature Med,1997,3∶1228.
2 Lou YJ,Hong Y.Immunosurgical studies on cytological and cytogenetic toxicity analysis of rat blastocysts after in vivo exposure to cyclophosphamide.Acta Pharmacol Sin,1997,18∶259.
, http://www.100md.com
3 Fein A,Ben NO,Wengier N,et al.The effects of cyclophosphamide on rat blastocysts in vitro and their subsequent development following transfer to pseudopregnant rats.Isr J Med Sci,1996,32∶129.
4 Pampfer S,Hertogh RD,Vanderheyden I,et al.Decreasedinner cell mass proportion in blastocysts from diabetic rats.Diabetes,1990,39∶471.
5 Manson JM,Wise LD.Teratogens.In:Amdur MD,Doull J,Klaassen CD editors:Casarett and Doull's Toxicology.The basic science of poisons.4th.New York:Pergamon Press,1991∶226.
, 百拇医药
6 Rutledge JC.Developmental toxicity induced during early stages of mammalian embryogenesis.Mutat Res,1997,396∶113.
7 Gardener HG,Kaye PL.Insulin increases cell numbers and morphological development in mouse pre-implantation embryos in vitro.Reprod Fertil Dev,1991,3∶79.
8 Maro B,Gueth-Hallonet C,Ashion J,Antony C.Cell polarity and microtubule organization during mouse early embryogenesis.Dev suppl,1991,1∶17.
收稿日期：1998-12-04, 百拇医药