睾酮与雄性大鼠骨质疏松关系的实验研究
作者：黄洪 田成功
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志990511 【摘要】 目的 研究高浓度胰岛素、葡萄糖对HepG2细胞蛋白激酶C(PKC)活性的影响。方法建立具胰岛素抵抗特性受体下调的HepG2(DR-HepG2)细胞模型，测定10-7mol/L胰岛素、25 mmol/L葡萄糖对未处理HepG2(NDR-HepG2)细和DR-HepG2细胞膜PKC、胞浆PKC活性的影响。结果DR-HepG2细胞未受高浓度胰岛素、葡萄糖刺激时膜和胞浆PKC活性均高于NDR-HepG2细胞(P<0.05)。10-7mol/L胰岛素刺激NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞，30秒和5～10分时膜PKC活性增高，胞浆PKC活性降低(P<0.01)。25mmol/L葡萄糖引起二种不同状态下HepG2细胞膜PKC活性二相增高，胞浆PKC活性增高(NDR-HepG2细胞)或降低(DR-HepG2细胞)(P<0.01)。10-7mol/L胰岛素和25 mmol/L葡萄糖同时刺激细胞，膜和胞浆PKC活性的变化与25mmol/L葡萄糖单独刺激时基本一致。结论 PKC上调与DR-HepG2细胞的胰岛素抵抗状态有关。10-7mol/L胰岛素或25 mmol/L葡萄糖刺激二种不同状态下的HepG2细胞，引起膜PKC活性二相增高，但对胞浆PKC活性的影响不完全相同；二者同时刺激主要通过葡萄糖介导的机制激活PKC。
, 百拇医药
Effects of high concentrations of insulin and glucose on the protein kinase C activities of HepG2 cells
YE Juan,LI Guo,CHEN Jialun
Shanghai Institute of Endocrinology,Shanghai,200025
【Abstract】 Objective To study the effec?s of high concentrations of insulin and glucose on the prot?in kinase C (PKC) activities of HepG2 cells. Methods A model of receptor down-regulated HepG2 (DR-HepG2) cells with characteristics of insulin resistance was developed. The membrane and cytosolic PKC activities of NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells stimulated by 10-7mol/L insulin and 25mmol/L glucose were measured. Results Without stimulation by 10-7mol/L insulin or 25mmol/L glucose, the PKC activities of membrane and cytosol of the DR-HepG2 cells were higher than those observed in NDR-HepG2 cells (P<0.05). 10-7mol/L insulin induced biphasic increases of membrane PKC activities by NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells (P<0.01), the initial increase being at 30 sec and the secondary at 5～10min. Meanwhile, the activities of cytosolic PKC reduced markedly. 25mmol/L glucose induced biphasic increases of the membrane PKC activities by NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells (P<0.01). At the same time the activities of cytosolic PKC increased slightly by NDR-HepG2 cells or decreased by DR-HepG2 cells. The effects of 25mmol/L glucose were parallel to those when 10-7mol/L insulin and 25mmol/L glucose were treated simultaneously. Conclusion The up-regulation of PKC may be related to the insulin resistance of DR-HepG2 cells. 10-7mol/L insulin or 25mmol/L glucose induced biphasic increases of membrane PKC activities of NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells. But the effects on cytosolic PKC were different. PKC may be activated through the glucose-induced mechanisms mainly when insulin and glucose were treated s multaneously.
, 百拇医药
【Key words】 Protein kinase C Insulin Glucose HepG2 cells
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:294-297)
蛋白激酶C(PKC)是一族普遍存在于细胞内的专一性蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶，广泛参与细胞生长分化、基因表达调控、激素和神经递质的分泌、跨膜信号传递、受体失敏和介导免疫反应等〔1〕。胰岛素、葡萄糖或其它激动剂通过二酰甘油(diacylglycerol, DG)途径激活PKC，后者通过其蛋白质磷酸化作用产生一系列生物效应。但是，一种或多种PKC亚型的过度激活可导致胰岛素受体信号传递的减弱，如磷酸化胰岛素受体β亚单位丝氨酸/苏氨酸残基使其酪氨酸激酶活性降低、抑制糖原合成酶活性等，与胰岛素抵抗密切相关〔2，3〕；过度激活的PKC还可能通过增加肾小球内皮细胞通透性、刺激肾系膜细胞合成基质蛋白等机制参与糖尿病肾病的病理改变〔4〕；高糖介导的PKC激活可改变一些与血管功能有关的酶或蛋白质的活性和基因表达，导致大小血管功能紊乱，是糖尿病慢性并发症的发病因素之一〔5，6〕。
, 百拇医药
受体下调HepG2(DR-HepG2)细胞既具有肝细胞的代谢特点，又有胰岛素受体和受体后功能缺陷〔7，8〕，是研究糖尿病及胰岛素抵抗的理想细胞模型。本研究以未处理HepG2(ND-HepG2)细胞和(DR-HepG2)细胞为研究对象，观察10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖及二者同时刺激对二种不同状态下HepG2细胞膜和胞浆PKC活性的影响，探讨PKC在糖尿病和胰岛素抵抗中的潜用。
材料和方法
一、材料
HepG2细胞株购于日本筑波细胞库。Ac-MBP(4-14)、PKC(19-36)、PMA、磷酸纤维素薄膜等购于Gibco公司。32P-ATP、14C-葡萄糖购于Dupont公司。125I-胰岛素购于Amersham公司。其余试剂购于Sigma公司。
, 百拇医药
主要仪器：超净工作台(苏州净化设备厂)；CO2温箱(Napco,5410型)；超速离心机(Beckman,Optima)等。
二、方法
1.细胞培养：HepG2细胞培养于细胞培养板，10%小牛血清的DMEM培养液、37℃、5%CO2温箱中孵育。(DR-HepG2)细胞模型的建立：单层贴壁HepG2细胞置于含10-7mol/L胰岛素的DMEM培养液中孵育24小时。弃培养液，于4℃条件下用预冷的pH 4.0的DMEM培养液和0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)分别洗涤细胞5次，即成为DR-HepG2细胞。
2.残余125I-胰岛素结合率测定：NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞置于含10-9mol/L或10-7mol/L胰岛素的DMEM培养液中孵育24小时。弃培养液，于4℃条件下，用预冷的p4.0的DMEM培养液及0.01mol/L PBS分别冲洗5次。每孔中加2ml含3μCi125I-胰岛素的DMEM培养液，4℃孵育3小时。弃培养液用0.01mol/L PBS 冲洗5次，每孔中加入0.25%胰酶1ml，室温消化25分钟，用含15%小牛清的DMEM培养液终止反应。吹打细胞并移入测试管中，用1ml PBS洗5次，洗液一并加入测试管中，2000rpm离心10分钟。弃上清，测沉淀物放射计数。用10-7mol/L胰岛素与125I-胰岛素竞争结合后的残余125I-胰岛素结合量作为非特异性结合。未用胰岛素刺激的HepG2细胞残余125I-胰岛素结合作为对照。
, 百拇医药
3.14C-葡萄糖掺入试验：NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞置于含3%小牛血清的DMEM培养液中孵育24小时或48小时。弃培养液后每孔中加入3μCi14C-葡萄糖及2ml含10-9mol/L或10-7 mol/L胰岛素的DMEM培养液，孵育24小时后弃培养液，用0.01mol/L PBS洗5次。每孔中加入1 ml NaOH，37℃裂解细胞2小时。取裂解液200μl加入10ml闪烁液中，混匀过夜，测放射性计数。
4.PKC活性测定：按照Gibco公司的PKC测试系统及Yasuda等〔9〕报道的PKC活性测定原理与方法。含10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖或10-7mol/L胰岛素+25mmol/L葡萄糖的DMEM培养液刺激NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞，时间分别为0，30秒，1分，3分，5分，10分，15分。(1)超速离心法分离胞浆及膜部分PKC粗提物。(2)PKC活性测定：Ac-MBP(4-14)是髓鞘磷脂基质蛋白的一个合成片段，其中8号氨基酸为丝氨酸残基，是PKC的特异性磷酸化底物。测定反应产物的32P掺入量来反映PKC活性。PKC(19-36)是PKC磷酸化反应的特异性抑制剂，其存在时测得的结果作为非特异性反应。(3)计算结果并以粗提物的A280值校正。
, 百拇医药
5.统计学方法：数据以x±s表示；两两比较用t检验。
结 果
一、残余125I-胰岛素结合率
超生理浓度(10-7mol/L)和生理浓度(10-9mol/L)胰岛素刺激24小时后，DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率明显低于NDR-HepG2细胞，前者为(434±233)cpm，(835±230)cpm，后者为(818±153)cpm,(1018±201)cpm(P<0.01)。随着胰岛素浓度的增高，NDR-HepG2细胞和DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率降低。
二、14C-葡萄糖掺入试验
, 百拇医药 10-9 mol/L和10-7mol/L胰岛素刺激24小时后，DR-HepG 2细胞14C-葡萄糖掺入量明显低于NDR-HepG2细胞。前者为(1477±360)cpm，(700±314)cpm，后者为(3128±233)cpm，(1396±201)cpm(P<0.01)。48小时后的DR-HepG2细胞14C-葡萄糖掺入量轻度增加，仍明显低于NDR-HepG2细胞，前者为(1610±187)cpm，(891±154)cpm，后者为(3128±233)cpm，(1396±201)cpm(P<0.01)。
三、高浓度胰岛素、葡萄糖对NDR-HepG2细胞PKC活性的影响(表1)
表1 高浓度胰岛素、葡萄糖对NDR-HepG2细胞PKC活性的影响
Tab 1 The effects of high concentrations of insulin and glucose on PKC activities of NDR-HepG2 cells 浓度
, 百拇医药
Concentration
时间Time
膜PKC
Membrane PKC
(pmol.min-1.A280-1)
胞浆PKC
Cytosolic PKC/td>
(pmol.min-1.A280-1)
基础状态
, http://www.100md.com
Basic status
(n=18)
0
10.12±6.57
31.53±8.69
10-7mol/L Insulin
(n=6)
30″
26.59±8.44*
29.09±8.69
1′
, http://www.100md.com
10.81±4.07
32.51±4.56
3′
13.38±4.97
29.50±5.64
5′
28.71±5.47*
38.58±8.77
10′
17.67±4.29*
13.30±5.14*
, 百拇医药
15′
10.53±6.19
21.72±5.89*
25mmol/L Glucose
(n=6)
30″
31.71±5.21*
36.77±3.93*
1′
10.63±5.63
32.04±6.91
, http://www.100md.com
3′
13.39±5.32
35.01±4.44
5′
27.23±12.53*
49.06±10.98*
10′
12.50±4.16
30.04±3.88
15′
12.25±4.18
, http://www.100md.com 26.32±5.29
10-7mol/L Insulin+
25mmol/L Glucose
(n=6)
30′
30.29±7.55*
36.05±7.41*
1′
17.16±5.80
33.66±5.25
5′
, http://www.100md.com
13.27±5.08
33.96±11.53
10′
23.03±5.75*
42.92±6.42*
15′
17.25±5.45
35.90±5.56
注：与基础状态(即未受高浓度胰岛素葡萄糖刺激)时相比 Compared with basic status (without stimulating by high concentration of insulin and glucose)，*P<0.01
, http://www.100md.com
10-7mol/L胰岛素刺激NDR-HepG2细胞，膜PKC活性表现为二相增高。第一相为30秒时，第二相为5～10分钟时，明显高于基础状态。胞浆PKC活性在30秒时略有降低，10分钟时明显降低。
25mmol/L葡萄糖刺激NDR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和5分钟时增高，与10-7 mol/L胰岛素刺激时不同的是胞浆PKC活性同时增高。
10-7mol/L胰岛素和25mmol/L葡萄糖同时刺激NDR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和5～10分钟时增高，胞浆PKC活性同时增高。
四、高浓度胰岛素、葡萄糖对DR-HepG2细胞PKC活性的影响(表2)
表2 高浓度胰岛素、葡萄糖对DR-HepG2细胞PKC活性的影响
, 百拇医药
Tab 2 The effects of high concentrations of insulin and glucose on PKC activities of D-HepG2 cells 浓度
Concentration
时间Time
膜PKC
Membrane PKC
(pmol.min-1.A280-1)
胞浆PKC
Cytosolic PKC/td>
, http://www.100md.com
(pmol.min-1.A280-1)
基础状态
Basic status
(n=18)
0
12.89±4.17
35.38±9.18
10-7mol/L Insulin
(n=6)
30′
, 百拇医药 29.84±5.73*
34.16±11.78
1′
10.32±3.14
40.19±8.42
3′
14.88±4.87
28.35±9.43
5′
17.43±5.92*
32.79±7.78
, http://www.100md.com 10′
24.92±4.85*
24.61±8.67**
15′
11.57±2.82
32.89±4.65
25mmol/L Glucose
(n=6)
30′
31.05±6.69*
35.20±6.43
, 百拇医药
1′
13.75±7.16
38.25±8.57
3′
12.09±2.66
33.31±4.41
5′
12.55±3.10*
39.01±6.08
10′
28.01±7.54*
24.99±6.55*
, http://www.100md.com
15′
12.83±3.49
25.13±7.49
10-7mol/L Insulin+
25mmol/L Glucose
(n=6)
30′
31.62±9.55*
41.18±5.64*
1′
14.39±3.14
, 百拇医药
35.91±4.04
3′
15.35±4.81
35.36±5.47
5′
17.77±7.78
37.79±5.62
10′
31.45±8.18*
30.85±5.01*
15′
, 百拇医药 18.53±7.34*
29.54±7.80*
注：与基础状态(即未受高浓度胰岛素葡萄糖刺激)时相比 Compared with basic status (without stimulating by high concentration of insulin and glucose)，*P<0.01
DR-HepG2细胞未受高浓度胰岛素或葡萄糖刺激时，膜PKC活性和胞浆PKC活性均高于NDR-HepG2细胞。提示10-7mol/L胰岛素刺激24小时后，DR-HepG2细胞发生PKC上调。
10-7mol/L胰岛素刺激DR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和10分钟时增高，同时胞浆PKC活性降低，与10-7mol/L胰岛素刺激NDR-HepG2细胞时的变化基本一致。
, 百拇医药
25mmol/L葡萄糖刺激DR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和10分钟明显增高，胞浆PKC活性在10分钟和15分钟显著降低。
10-7mol/L胰岛素和25mmol/L葡萄糖同时刺激DR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和10分钟时增高，胞浆PKC活性在30秒时增高，10分钟时略有降低。
讨 论
HepG2细胞来源于人肝胎瘤细胞，保留了肝细胞的许多特性。DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率降低，提示细胞表面胰岛素受体数目减少，同时14C-葡萄糖掺入量明显下降，48小时后仍未恢复细胞对胰岛素刺激的正常糖代谢反应。Jeffrey等人认为DR-HepG2细胞的胰岛素受体和受体后功能有一定缺陷，受体自身磷酸化功能和胰岛素刺激的糖、脂、蛋白质代谢功能降低，表现为胰岛素抵抗〔7，8〕。
, http://www.100md.com
实验结果表明，10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖引起NDR-HepG2细胞和DR-HepG2细胞膜PKC活性二相增高，第一相在30秒，第二相在5～10分钟。研究表明第一相PKC增高与磷脂酰肌醇由磷脂酰肌醇特异的磷脂酶(PI-PLC)水解生成DG有关；第二相增高与磷脂酰胆碱由磷脂酰胆碱特异的磷脂酶(PC-PLC)水解生成DG、磷脂酸-DG全程合成、糖原磷脂酰肌醇水解生成DG等有关〔10〕。
10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖对二种不同状态HepG2细胞胞浆PKC活性的影响不完全相同，可能二者通过不同的途径和机制调节膜和胞浆PKC活性〔10，11〕。而10-7mol/L胰岛素和25mmol/L葡萄糖同时刺激NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞，PKC活性的变化与25mmol/L葡萄糖单独刺激时基本一致。二者对PKC活性的影响没有累加或消减作用。二者同时刺激时葡萄糖介导的PKC激活机制占优势。
, http://www.100md.com
DR-HepG2细胞基础状态下膜和胞浆PKC活性均高于NDR-HepG2细胞，提示PKC上调可能与其胰岛素抵抗状态有关。从胰岛素受体到糖原合成酶和葡萄糖转运系统的信号传递的损害是胰岛素抵抗的重要因素。PKC可直接磷酸化胰岛素受体β亚单位的丝氨酸/苏氨酸残基，导致受体酪氨酸激酶活性降低，使受体失敏〔12〕。PKC过度激活可能通过激活酪氨酸磷酸酶影响胰岛素刺激的磷脂酰肌醇3(PI3)-激酶活性和降低胰岛素受体底物-1(IRS-1)、Shc等蛋白质磷酸化，减弱胰岛素受体信号传递〔5〕。PKC还可通过磷酸化作用抑制糖原合成酶活性、降低GLUT4转运，从而损害葡萄糖转运代谢〔2〕。因此DR-HepG2细胞14C-葡萄糖掺入量的显著下降与PKC活性增高有关。过度激活的PKC在胰岛素受体和受体后水平损害胰岛素信号传递，是导致胰岛素抵抗的重要因素之一。
DG-PKC的过度激活亦被认为是糖尿病慢性并发症的发病因素之一。高糖通过激活PKC而激活磷脂酶A2(cPLA2)，降低Na+-K+-ATP酶活性，并调节与血管功能有关的蛋白质的基因表达，导致大小血管功能紊乱〔5，6〕。因此，合理地控制血糖水平是减少慢性并发症的重要措施。另外，胰岛素增敏剂曲格列酮能通过阻断高葡萄糖介导的PKC激活，从而改善胰岛素抵抗〔5〕。
, 百拇医药
高浓度胰岛素和葡萄糖引起HepG2细胞膜和胞浆PKC活性改变，是胰岛素抵抗和糖尿病慢性并发症的致病因素之一。进一步深入研究将有助于阐明糖尿病发病机制及各种病理改变，对治疗亦有积极意义。
*本课题为教育部留学回国人员科研启动基金资助项目
参考文献
1 Alexandra N. Protein kinase C: structure, function and r⑥gulation. J Biol Chem, 1995,270:28495-28498.
2 Shmueli E, Alberti KGMM, Record CO. Diacylglycerol/protein kinase C signalling: a mechanism for insulin resistance? J Inter Med, 1993,234:397-400.
, http://www.100md.com
3 Schmitz-priffer C, Browne CL, Biden TJ, et al. Alterations in the expression and cellular localization of protein kinase C isozymes ε and θ are associated with insulin resistance in skeletal muscle of the high-fat-fed rat. Diabetes, 1997,46:169-178.
4 Derubertis FR, Craven PA. Activation of protein kinase C in glomerular cells in diabetes. Mechanisms and potential links to the pathogenesis of diabetic glomerulopathy. Diabetes, 1994,43:1-8.
, 百拇医药
5 King GL, Brownlee M. The cellular and molecular mechanisms of diabetic complications. Endocrin Metab Clin N Am, 1996,25:255-270.
6 Williams B. Glucose-induced vascular smooth muscle dysfunction: the role of protein kinase C. Hypertention, 1995,13:477-486.
7 Amatruda JM, Chang CI. Insulin induced alterations in insulin binding and insulin action in primary cultures of rat hepatocytes. Diabetes, 1982,31:145-148.
, http://www.100md.com
8 Williams JF, Olefsky JM. Defective insulin receptor function in down-regulated HepG2 cell. Endocrinology 1990,127:1706-1717.
9 Yasuda I, Kishimoto A, Nishizuka Y, et al. A synthetic peptide substrate for selective assay of protein kinase C. Biochem Biophy Res Commun, 1990,166:1220-1227.
10 Hoffman JM, Ishizuka T, Farese RB. Interrelated effects of insulin and glucose on diacylglycerol -protein kinase C signalling in rat adipocytes and solei muscle in vitro and in vivo in diabetic rats. Endocrinology, 1991,128:2937-2948.
, 百拇医药
11 Cooper DR, Hernandez H, Farese RV, et al. Insulin icreases the synthesis of phospholipid and diacylglycerol and prot in kinase C activity in rat hepatocytes. Arch Biochem Biophy, 1990,276:486-494.
12 Schubert C, Carel K, Drazuin B, et al. Interaction of protein kinase C with insulin signalling. J Biol Chem, 1996,271:15311-15314.
收稿：1998-09-22 修回：1999-07-16, 百拇医药
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志990511 【摘要】 目的 研究高浓度胰岛素、葡萄糖对HepG2细胞蛋白激酶C(PKC)活性的影响。方法建立具胰岛素抵抗特性受体下调的HepG2(DR-HepG2)细胞模型，测定10-7mol/L胰岛素、25 mmol/L葡萄糖对未处理HepG2(NDR-HepG2)细和DR-HepG2细胞膜PKC、胞浆PKC活性的影响。结果DR-HepG2细胞未受高浓度胰岛素、葡萄糖刺激时膜和胞浆PKC活性均高于NDR-HepG2细胞(P<0.05)。10-7mol/L胰岛素刺激NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞，30秒和5～10分时膜PKC活性增高，胞浆PKC活性降低(P<0.01)。25mmol/L葡萄糖引起二种不同状态下HepG2细胞膜PKC活性二相增高，胞浆PKC活性增高(NDR-HepG2细胞)或降低(DR-HepG2细胞)(P<0.01)。10-7mol/L胰岛素和25 mmol/L葡萄糖同时刺激细胞，膜和胞浆PKC活性的变化与25mmol/L葡萄糖单独刺激时基本一致。结论 PKC上调与DR-HepG2细胞的胰岛素抵抗状态有关。10-7mol/L胰岛素或25 mmol/L葡萄糖刺激二种不同状态下的HepG2细胞，引起膜PKC活性二相增高，但对胞浆PKC活性的影响不完全相同；二者同时刺激主要通过葡萄糖介导的机制激活PKC。
, 百拇医药
Effects of high concentrations of insulin and glucose on the protein kinase C activities of HepG2 cells
YE Juan,LI Guo,CHEN Jialun
Shanghai Institute of Endocrinology,Shanghai,200025
【Abstract】 Objective To study the effec?s of high concentrations of insulin and glucose on the prot?in kinase C (PKC) activities of HepG2 cells. Methods A model of receptor down-regulated HepG2 (DR-HepG2) cells with characteristics of insulin resistance was developed. The membrane and cytosolic PKC activities of NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells stimulated by 10-7mol/L insulin and 25mmol/L glucose were measured. Results Without stimulation by 10-7mol/L insulin or 25mmol/L glucose, the PKC activities of membrane and cytosol of the DR-HepG2 cells were higher than those observed in NDR-HepG2 cells (P<0.05). 10-7mol/L insulin induced biphasic increases of membrane PKC activities by NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells (P<0.01), the initial increase being at 30 sec and the secondary at 5～10min. Meanwhile, the activities of cytosolic PKC reduced markedly. 25mmol/L glucose induced biphasic increases of the membrane PKC activities by NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells (P<0.01). At the same time the activities of cytosolic PKC increased slightly by NDR-HepG2 cells or decreased by DR-HepG2 cells. The effects of 25mmol/L glucose were parallel to those when 10-7mol/L insulin and 25mmol/L glucose were treated simultaneously. Conclusion The up-regulation of PKC may be related to the insulin resistance of DR-HepG2 cells. 10-7mol/L insulin or 25mmol/L glucose induced biphasic increases of membrane PKC activities of NDR-HepG2 cells and DR-HepG2 cells. But the effects on cytosolic PKC were different. PKC may be activated through the glucose-induced mechanisms mainly when insulin and glucose were treated s multaneously.
, 百拇医药
【Key words】 Protein kinase C Insulin Glucose HepG2 cells
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:294-297)
蛋白激酶C(PKC)是一族普遍存在于细胞内的专一性蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶，广泛参与细胞生长分化、基因表达调控、激素和神经递质的分泌、跨膜信号传递、受体失敏和介导免疫反应等〔1〕。胰岛素、葡萄糖或其它激动剂通过二酰甘油(diacylglycerol, DG)途径激活PKC，后者通过其蛋白质磷酸化作用产生一系列生物效应。但是，一种或多种PKC亚型的过度激活可导致胰岛素受体信号传递的减弱，如磷酸化胰岛素受体β亚单位丝氨酸/苏氨酸残基使其酪氨酸激酶活性降低、抑制糖原合成酶活性等，与胰岛素抵抗密切相关〔2，3〕；过度激活的PKC还可能通过增加肾小球内皮细胞通透性、刺激肾系膜细胞合成基质蛋白等机制参与糖尿病肾病的病理改变〔4〕；高糖介导的PKC激活可改变一些与血管功能有关的酶或蛋白质的活性和基因表达，导致大小血管功能紊乱，是糖尿病慢性并发症的发病因素之一〔5，6〕。
, 百拇医药
受体下调HepG2(DR-HepG2)细胞既具有肝细胞的代谢特点，又有胰岛素受体和受体后功能缺陷〔7，8〕，是研究糖尿病及胰岛素抵抗的理想细胞模型。本研究以未处理HepG2(ND-HepG2)细胞和(DR-HepG2)细胞为研究对象，观察10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖及二者同时刺激对二种不同状态下HepG2细胞膜和胞浆PKC活性的影响，探讨PKC在糖尿病和胰岛素抵抗中的潜用。
材料和方法
一、材料
HepG2细胞株购于日本筑波细胞库。Ac-MBP(4-14)、PKC(19-36)、PMA、磷酸纤维素薄膜等购于Gibco公司。32P-ATP、14C-葡萄糖购于Dupont公司。125I-胰岛素购于Amersham公司。其余试剂购于Sigma公司。
, 百拇医药
主要仪器：超净工作台(苏州净化设备厂)；CO2温箱(Napco,5410型)；超速离心机(Beckman,Optima)等。
二、方法
1.细胞培养：HepG2细胞培养于细胞培养板，10%小牛血清的DMEM培养液、37℃、5%CO2温箱中孵育。(DR-HepG2)细胞模型的建立：单层贴壁HepG2细胞置于含10-7mol/L胰岛素的DMEM培养液中孵育24小时。弃培养液，于4℃条件下用预冷的pH 4.0的DMEM培养液和0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)分别洗涤细胞5次，即成为DR-HepG2细胞。
2.残余125I-胰岛素结合率测定：NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞置于含10-9mol/L或10-7mol/L胰岛素的DMEM培养液中孵育24小时。弃培养液，于4℃条件下，用预冷的p4.0的DMEM培养液及0.01mol/L PBS分别冲洗5次。每孔中加2ml含3μCi125I-胰岛素的DMEM培养液，4℃孵育3小时。弃培养液用0.01mol/L PBS 冲洗5次，每孔中加入0.25%胰酶1ml，室温消化25分钟，用含15%小牛清的DMEM培养液终止反应。吹打细胞并移入测试管中，用1ml PBS洗5次，洗液一并加入测试管中，2000rpm离心10分钟。弃上清，测沉淀物放射计数。用10-7mol/L胰岛素与125I-胰岛素竞争结合后的残余125I-胰岛素结合量作为非特异性结合。未用胰岛素刺激的HepG2细胞残余125I-胰岛素结合作为对照。
, 百拇医药
3.14C-葡萄糖掺入试验：NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞置于含3%小牛血清的DMEM培养液中孵育24小时或48小时。弃培养液后每孔中加入3μCi14C-葡萄糖及2ml含10-9mol/L或10-7 mol/L胰岛素的DMEM培养液，孵育24小时后弃培养液，用0.01mol/L PBS洗5次。每孔中加入1 ml NaOH，37℃裂解细胞2小时。取裂解液200μl加入10ml闪烁液中，混匀过夜，测放射性计数。
4.PKC活性测定：按照Gibco公司的PKC测试系统及Yasuda等〔9〕报道的PKC活性测定原理与方法。含10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖或10-7mol/L胰岛素+25mmol/L葡萄糖的DMEM培养液刺激NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞，时间分别为0，30秒，1分，3分，5分，10分，15分。(1)超速离心法分离胞浆及膜部分PKC粗提物。(2)PKC活性测定：Ac-MBP(4-14)是髓鞘磷脂基质蛋白的一个合成片段，其中8号氨基酸为丝氨酸残基，是PKC的特异性磷酸化底物。测定反应产物的32P掺入量来反映PKC活性。PKC(19-36)是PKC磷酸化反应的特异性抑制剂，其存在时测得的结果作为非特异性反应。(3)计算结果并以粗提物的A280值校正。
, 百拇医药
5.统计学方法：数据以x±s表示；两两比较用t检验。
结 果
一、残余125I-胰岛素结合率
超生理浓度(10-7mol/L)和生理浓度(10-9mol/L)胰岛素刺激24小时后，DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率明显低于NDR-HepG2细胞，前者为(434±233)cpm，(835±230)cpm，后者为(818±153)cpm,(1018±201)cpm(P<0.01)。随着胰岛素浓度的增高，NDR-HepG2细胞和DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率降低。
二、14C-葡萄糖掺入试验
, 百拇医药 10-9 mol/L和10-7mol/L胰岛素刺激24小时后，DR-HepG 2细胞14C-葡萄糖掺入量明显低于NDR-HepG2细胞。前者为(1477±360)cpm，(700±314)cpm，后者为(3128±233)cpm，(1396±201)cpm(P<0.01)。48小时后的DR-HepG2细胞14C-葡萄糖掺入量轻度增加，仍明显低于NDR-HepG2细胞，前者为(1610±187)cpm，(891±154)cpm，后者为(3128±233)cpm，(1396±201)cpm(P<0.01)。
三、高浓度胰岛素、葡萄糖对NDR-HepG2细胞PKC活性的影响(表1)
表1 高浓度胰岛素、葡萄糖对NDR-HepG2细胞PKC活性的影响
Tab 1 The effects of high concentrations of insulin and glucose on PKC activities of NDR-HepG2 cells 浓度
, 百拇医药
Concentration
时间Time
膜PKC
Membrane PKC
(pmol.min-1.A280-1)
胞浆PKC
Cytosolic PKC/td>
(pmol.min-1.A280-1)
基础状态
, http://www.100md.com
Basic status
(n=18)
0
10.12±6.57
31.53±8.69
10-7mol/L Insulin
(n=6)
30″
26.59±8.44*
29.09±8.69
1′
, http://www.100md.com
10.81±4.07
32.51±4.56
3′
13.38±4.97
29.50±5.64
5′
28.71±5.47*
38.58±8.77
10′
17.67±4.29*
13.30±5.14*
, 百拇医药
15′
10.53±6.19
21.72±5.89*
25mmol/L Glucose
(n=6)
30″
31.71±5.21*
36.77±3.93*
1′
10.63±5.63
32.04±6.91
, http://www.100md.com
3′
13.39±5.32
35.01±4.44
5′
27.23±12.53*
49.06±10.98*
10′
12.50±4.16
30.04±3.88
15′
12.25±4.18
, http://www.100md.com 26.32±5.29
10-7mol/L Insulin+
25mmol/L Glucose
(n=6)
30′
30.29±7.55*
36.05±7.41*
1′
17.16±5.80
33.66±5.25
5′
, http://www.100md.com
13.27±5.08
33.96±11.53
10′
23.03±5.75*
42.92±6.42*
15′
17.25±5.45
35.90±5.56
注：与基础状态(即未受高浓度胰岛素葡萄糖刺激)时相比 Compared with basic status (without stimulating by high concentration of insulin and glucose)，*P<0.01
, http://www.100md.com
10-7mol/L胰岛素刺激NDR-HepG2细胞，膜PKC活性表现为二相增高。第一相为30秒时，第二相为5～10分钟时，明显高于基础状态。胞浆PKC活性在30秒时略有降低，10分钟时明显降低。
25mmol/L葡萄糖刺激NDR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和5分钟时增高，与10-7 mol/L胰岛素刺激时不同的是胞浆PKC活性同时增高。
10-7mol/L胰岛素和25mmol/L葡萄糖同时刺激NDR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和5～10分钟时增高，胞浆PKC活性同时增高。
四、高浓度胰岛素、葡萄糖对DR-HepG2细胞PKC活性的影响(表2)
表2 高浓度胰岛素、葡萄糖对DR-HepG2细胞PKC活性的影响
, 百拇医药
Tab 2 The effects of high concentrations of insulin and glucose on PKC activities of D-HepG2 cells 浓度
Concentration
时间Time
膜PKC
Membrane PKC
(pmol.min-1.A280-1)
胞浆PKC
Cytosolic PKC/td>
, http://www.100md.com
(pmol.min-1.A280-1)
基础状态
Basic status
(n=18)
0
12.89±4.17
35.38±9.18
10-7mol/L Insulin
(n=6)
30′
, 百拇医药 29.84±5.73*
34.16±11.78
1′
10.32±3.14
40.19±8.42
3′
14.88±4.87
28.35±9.43
5′
17.43±5.92*
32.79±7.78
, http://www.100md.com 10′
24.92±4.85*
24.61±8.67**
15′
11.57±2.82
32.89±4.65
25mmol/L Glucose
(n=6)
30′
31.05±6.69*
35.20±6.43
, 百拇医药
1′
13.75±7.16
38.25±8.57
3′
12.09±2.66
33.31±4.41
5′
12.55±3.10*
39.01±6.08
10′
28.01±7.54*
24.99±6.55*
, http://www.100md.com
15′
12.83±3.49
25.13±7.49
10-7mol/L Insulin+
25mmol/L Glucose
(n=6)
30′
31.62±9.55*
41.18±5.64*
1′
14.39±3.14
, 百拇医药
35.91±4.04
3′
15.35±4.81
35.36±5.47
5′
17.77±7.78
37.79±5.62
10′
31.45±8.18*
30.85±5.01*
15′
, 百拇医药 18.53±7.34*
29.54±7.80*
注：与基础状态(即未受高浓度胰岛素葡萄糖刺激)时相比 Compared with basic status (without stimulating by high concentration of insulin and glucose)，*P<0.01
DR-HepG2细胞未受高浓度胰岛素或葡萄糖刺激时，膜PKC活性和胞浆PKC活性均高于NDR-HepG2细胞。提示10-7mol/L胰岛素刺激24小时后，DR-HepG2细胞发生PKC上调。
10-7mol/L胰岛素刺激DR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和10分钟时增高，同时胞浆PKC活性降低，与10-7mol/L胰岛素刺激NDR-HepG2细胞时的变化基本一致。
, 百拇医药
25mmol/L葡萄糖刺激DR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和10分钟明显增高，胞浆PKC活性在10分钟和15分钟显著降低。
10-7mol/L胰岛素和25mmol/L葡萄糖同时刺激DR-HepG2细胞，膜PKC活性在30秒和10分钟时增高，胞浆PKC活性在30秒时增高，10分钟时略有降低。
讨 论
HepG2细胞来源于人肝胎瘤细胞，保留了肝细胞的许多特性。DR-HepG2细胞残余125I-胰岛素结合率降低，提示细胞表面胰岛素受体数目减少，同时14C-葡萄糖掺入量明显下降，48小时后仍未恢复细胞对胰岛素刺激的正常糖代谢反应。Jeffrey等人认为DR-HepG2细胞的胰岛素受体和受体后功能有一定缺陷，受体自身磷酸化功能和胰岛素刺激的糖、脂、蛋白质代谢功能降低，表现为胰岛素抵抗〔7，8〕。
, http://www.100md.com
实验结果表明，10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖引起NDR-HepG2细胞和DR-HepG2细胞膜PKC活性二相增高，第一相在30秒，第二相在5～10分钟。研究表明第一相PKC增高与磷脂酰肌醇由磷脂酰肌醇特异的磷脂酶(PI-PLC)水解生成DG有关；第二相增高与磷脂酰胆碱由磷脂酰胆碱特异的磷脂酶(PC-PLC)水解生成DG、磷脂酸-DG全程合成、糖原磷脂酰肌醇水解生成DG等有关〔10〕。
10-7mol/L胰岛素或25mmol/L葡萄糖对二种不同状态HepG2细胞胞浆PKC活性的影响不完全相同，可能二者通过不同的途径和机制调节膜和胞浆PKC活性〔10，11〕。而10-7mol/L胰岛素和25mmol/L葡萄糖同时刺激NDR-HepG2细胞或DR-HepG2细胞，PKC活性的变化与25mmol/L葡萄糖单独刺激时基本一致。二者对PKC活性的影响没有累加或消减作用。二者同时刺激时葡萄糖介导的PKC激活机制占优势。
, http://www.100md.com
DR-HepG2细胞基础状态下膜和胞浆PKC活性均高于NDR-HepG2细胞，提示PKC上调可能与其胰岛素抵抗状态有关。从胰岛素受体到糖原合成酶和葡萄糖转运系统的信号传递的损害是胰岛素抵抗的重要因素。PKC可直接磷酸化胰岛素受体β亚单位的丝氨酸/苏氨酸残基，导致受体酪氨酸激酶活性降低，使受体失敏〔12〕。PKC过度激活可能通过激活酪氨酸磷酸酶影响胰岛素刺激的磷脂酰肌醇3(PI3)-激酶活性和降低胰岛素受体底物-1(IRS-1)、Shc等蛋白质磷酸化，减弱胰岛素受体信号传递〔5〕。PKC还可通过磷酸化作用抑制糖原合成酶活性、降低GLUT4转运，从而损害葡萄糖转运代谢〔2〕。因此DR-HepG2细胞14C-葡萄糖掺入量的显著下降与PKC活性增高有关。过度激活的PKC在胰岛素受体和受体后水平损害胰岛素信号传递，是导致胰岛素抵抗的重要因素之一。
DG-PKC的过度激活亦被认为是糖尿病慢性并发症的发病因素之一。高糖通过激活PKC而激活磷脂酶A2(cPLA2)，降低Na+-K+-ATP酶活性，并调节与血管功能有关的蛋白质的基因表达，导致大小血管功能紊乱〔5，6〕。因此，合理地控制血糖水平是减少慢性并发症的重要措施。另外，胰岛素增敏剂曲格列酮能通过阻断高葡萄糖介导的PKC激活，从而改善胰岛素抵抗〔5〕。
, 百拇医药
高浓度胰岛素和葡萄糖引起HepG2细胞膜和胞浆PKC活性改变，是胰岛素抵抗和糖尿病慢性并发症的致病因素之一。进一步深入研究将有助于阐明糖尿病发病机制及各种病理改变，对治疗亦有积极意义。
*本课题为教育部留学回国人员科研启动基金资助项目
参考文献
1 Alexandra N. Protein kinase C: structure, function and r⑥gulation. J Biol Chem, 1995,270:28495-28498.
2 Shmueli E, Alberti KGMM, Record CO. Diacylglycerol/protein kinase C signalling: a mechanism for insulin resistance? J Inter Med, 1993,234:397-400.
, http://www.100md.com
3 Schmitz-priffer C, Browne CL, Biden TJ, et al. Alterations in the expression and cellular localization of protein kinase C isozymes ε and θ are associated with insulin resistance in skeletal muscle of the high-fat-fed rat. Diabetes, 1997,46:169-178.
4 Derubertis FR, Craven PA. Activation of protein kinase C in glomerular cells in diabetes. Mechanisms and potential links to the pathogenesis of diabetic glomerulopathy. Diabetes, 1994,43:1-8.
, 百拇医药
5 King GL, Brownlee M. The cellular and molecular mechanisms of diabetic complications. Endocrin Metab Clin N Am, 1996,25:255-270.
6 Williams B. Glucose-induced vascular smooth muscle dysfunction: the role of protein kinase C. Hypertention, 1995,13:477-486.
7 Amatruda JM, Chang CI. Insulin induced alterations in insulin binding and insulin action in primary cultures of rat hepatocytes. Diabetes, 1982,31:145-148.
, http://www.100md.com
8 Williams JF, Olefsky JM. Defective insulin receptor function in down-regulated HepG2 cell. Endocrinology 1990,127:1706-1717.
9 Yasuda I, Kishimoto A, Nishizuka Y, et al. A synthetic peptide substrate for selective assay of protein kinase C. Biochem Biophy Res Commun, 1990,166:1220-1227.
10 Hoffman JM, Ishizuka T, Farese RB. Interrelated effects of insulin and glucose on diacylglycerol -protein kinase C signalling in rat adipocytes and solei muscle in vitro and in vivo in diabetic rats. Endocrinology, 1991,128:2937-2948.
, 百拇医药
11 Cooper DR, Hernandez H, Farese RV, et al. Insulin icreases the synthesis of phospholipid and diacylglycerol and prot in kinase C activity in rat hepatocytes. Arch Biochem Biophy, 1990,276:486-494.
12 Schubert C, Carel K, Drazuin B, et al. Interaction of protein kinase C with insulin signalling. J Biol Chem, 1996,271:15311-15314.
收稿：1998-09-22 修回：1999-07-16, 百拇医药