糖尿病大鼠主动脉糖化终产物的免疫组化研究
作者：徐瑞生 姜宗来 赵庆
单位：
关键词：
中华内分泌代谢杂志990503 【摘要】 目的 探讨醛糖还原酶(AR)基因多态标记(AC)n与中国人2型糖尿病微血管并发症之间的关系。方法 用32P-引物末端标记法，经聚合酶链反应-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测362例中国人(217人为2型糖尿病，其中156人合并肾病或视网膜病变，145人为非糖尿病对照)AR基因的二核苷酸(AC)n串联重复序列多态标记，比较各组间的等位基因频率和基因型频率。结果 (1)在非糖尿病对照者和2型糖尿病患者中，见到七种AR基因的等位基因，其中以(AC)24(138bp)等位基因(Z)最常见。(2)同时合并肾病和视网膜病变的2型糖尿病组与无并发症的2型糖尿病组相比，Z+6等位基因频率显著减少(Fisher确切，P=0.038)，含Z+6等位基因的基因型频率也显著减少(P=0.004)。(3)无并发症的2型糖尿病组与对照组比较其Z+6等位基因频率显著增加(P=0.044)。(4)2型糖尿病合并肾病伴肾功能不全者与不伴有肾病的2型糖尿病者相比，Z-2等位基因频率显著增加(P=0.039)，同时含Z-2等位基因的基因型频率也呈增加趋势。结论 AR的Z-2等位基因是促进中国人2型糖尿病并发严重肾病(肾功能不全)的危险因子，而Z+6等位基因则是2型糖尿病患者发生肾病和视网膜并发症的保护因子。
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A study of association between polymorphism of aldose reductase gene and diabetic microangiopathy
LIU Limei,XIANG Kunsan,ZHENG Taishan
Department of Endocrinology and Metabolism,Diabetes Research Laboratory and Medical Genetics Research Laboratory,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai,200233
【Abstract】 Objective To investigate the association between dinucleotide repeat polymorphism at 5' end of aldose reductase (AR) gene and diabetic microangiopathy in Chinese. Methods A case-control study for 362 Chinese subjects (including 217 type 2 diabetes mellitus with or without nephropathy or retinopathy and 145 non-diabetes control) was performed. The number of (AC)n dinucleotide of AR gene was determined by PCR-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Results Tandem (AC) repeats of the AR gene were highly polymorphic and 7 alleles were observed in type 2 diabetes mellitus and control. The most prevalent allele was 24 times in (AC) repeat and was designated as Z allele. In type 2 diabetes mellitus with both nephropathy and retinopathy, a decreased frequency of Z+6 allele was found in comparison with type 2 diabetes mellitus without microangiopathy (Fisher's exact, P=0.038). In addition, an elevated frequency of Z-2 allele was observed in type 2 diabetes mellitus with severe nephropathy (renal insufficiency) as compared with type 2 diabetes mellitus without nephropathy (Fisher's exact, P=0.039). Conclusion AR gene alleles are associated with the development of diabetic microangiopathy. The Z-2 allele of the AR gene may be a risk factor for developing severe nephropathy in type 2 diabetes mellitus.Whereas, the Z+6 allele may protect against the development and progression of diabetic nephropathy and retinopathy in Chinese subjects.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes mellitus, type 2 Aldose reductase Gene Nephropathy Retinopathy
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:263-266)
糖尿病(DM)慢性微血管并发症特别是DM肾病和DM视网膜病是DM患者致死、致残的主要原因。DM患者病程长和代谢控制不良是DM肾病和DM视网膜病变发展中的重要危险因素〔1〕。近年来的研究表明，多元醇途径的激活，参与了DM微血管病变的发生及发展〔2〕。有些研究见到DM视网膜病变、肾病变者血细胞的醛糖还原酶(AR)活性增高〔3，4〕。另外，醛糖还原酶抑制剂(ARI)投予实验诱发的DM动物，能够抑制或减少DM微血管并发症的发生。而且ARI在临床应用的探讨上，也显示了一定的效果〔5，6〕。AR是多元醇代谢途径的限速酶，该酶基因表达异常或酶活性改变，势必影响DM微血管并发症的发生。人的功能性AR基因位于染色体7q35，由跨越18kb的10个外显子组成〔7〕。最近的研究显示，位于AR基因5’端转录起 始点上游2.1 kb处存在(AC)n二核苷酸重复序列多态标记，该标记与血AR活性水平相关。应用此标记见到AR基因与香港人的2型DM早期视网膜病变及英国白种人群的1型DM肾病关联〔8，9〕。关于AR基因多态性与中国人2型DM肾病(DN)，及同时伴有DM视网膜病变(DR)是否相关?国内外尚未见报道。本文就此进行研究。
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对象和方法
一、对象(表1)
表1 非DM及2型DM伴及不伴肾病或视网膜病变患者的临床参数
Tab 1 Clinical parameters of non-diabetics and type 2 diabetic patients with or without nephropathy or retinopathy 项目
Item
非DM
Non-DM
(n=145)
DN(-)(n=100)
, 百拇医药
DN-1
(n=91)
DN-2
(n=26)
DR(-)
(n=139)
DR(+)
(n=78)
年龄(岁)
Age(years)
55.6±11.5
58.3±12.7
, 百拇医药
58.7±12.4
61.2±11.7
57.8±12.5
60.7±12.2
性别
(男/女)
Sex(M/F)
91/54
45/55
54/37
20/6
83/56
, 百拇医药
36/42
BMI
(kg/m2)
22.9±2.9
23.7±3.5
22.2±4.0
23.4±2.4
23.4±3.9
22.3±3.0
病程(年)
Duration
(years)
, 百拇医药
-
6.0±6.7
5.2±6.0
6.5±7.8
3.9±4.9
8.9±7.8**
注：与DR(+)相比, Student's t检验 vs DR(+), Student's t test,**P<0.001
365例无血缘关系的上海地区中国汉族人，选自上海市第六人民医院内分泌科中国人DNA标本库。其中2型糖尿病患者217例，皆来自本院住院患者，并在本院糖尿病门诊长期随访；非糖尿病对照组145例，为本院职工或居民。
, 百拇医药
1.2型糖尿病患者根据同时伴(+)与不伴(-)DN与DR(由24小时尿白蛋白含量、血尿素氮、肌酐测定及专职眼科医生对患者进行彩色眼底拍片确定)分为四组：DN-/DR-组，DN-/DR+组，DN+/DR-组，DN+/DR+组。
2.DN进一步分为以下亚组：无肾病期DN(-)组，2次测尿白蛋白<28.8 mg/24h或尿蛋白<200 mg/24h；蛋白尿肾病期DN-1组，2次测尿白蛋白≥28.8 mg/24h或尿蛋白≥200 mg/24h；肾功能不全期DN-2组，有蛋白尿伴2次血Cr≥110 μmol/L。
二、方法
1.DNA提取：取周围静脉血6～10 ml，蛋白酶K处理后用酚氯仿法提取基因组DNA。
2.AR等位基因测定：5’及3’端引物分别为AR-Pr1：5’-GAATCTAACATGCTCTGAACC-3’，AR-Pr2：5’-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3’〔8〕。以γ-32P(3 000 ci/mmol)(美国Amersham)-T4聚核苷酸激酶法(美国New England, Biolabs)标记AR-Pr1，用PCR扩增仪(美国Perkin Elmers Cetus)进行反应，初期变性94℃5分钟，继之30个周期，每个周期中变性94℃1分钟，退火-延伸68℃2分钟。用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物后放射自显影。
, 百拇医药
3.确定AR等位基因多态标记(AC)n的重复数目：将等位基因为纯合子的个体DNA标本行PCR后，以纯化后的扩增片段为测定模板，以γ-32P-ATP标记AR-Pr1，与模板各1 pmol/L进行循环DNA序列分析(Hot Tub DNA序列分析系统，美国Amersham)。
三、统计分析
1.从放射自显影图上直接判读个体基因型，计算样本等位基因频率和基因型频率。确认其符合Hardy-Weinberg平衡，计算多态信息含量(PIC)和杂合度观察值。
2.两组间临床特征的比较，使用不配对student's t test检验。组间频率比较用Fisher's双侧确切检验。结 果
一、中国人AR基因(AC)n重复序列多态标记的特点
, 百拇医药
本组样本中见到七种AR等位基因。将最常见的等位基因命名为Z，其纯合子样本DNA测序结果为(AC)24，与国外所用命名一致。将(AC)n中的n为21、22、23及25、26、27，分别命名为Z-6、Z-4、Z-2、Z+2、Z+4、Z+6等位基因。各等位基因间长度差异为2bp，亦即由Z-6等位基因至Z+6等位基因长度为132bp～144bp。2型糖尿病患者中共见23种基因型，非DM者中共见20种基因型，二者均以基因型Z/Z+2为最多见。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，PIC与杂合度观察值分别为0.77及0.73。
二、非DM者及2型糖尿病者同时伴有、不伴有肾病，视网膜病变患者的AR等位基因频率的分布情况
DN-/DR-组与非DM组相比，Z+6等位基因频率显著增高，其Z+6/Z+6或Z+6/X的基因型(X指除Z+6以外的其它等位基因型)频率与X/X基因型频率之比显著增高。而DN+/DR+组与DN-/DR-组相比，Z+6等位基因频率显著减少，Z+6/Z+6或Z+6/X的基因型频率与X/X基因型频率之比也显著减少(表2，表3)。
, 百拇医药
表2 非DM及2型糖尿病同时伴或不伴肾病、视网膜病变患者的AR基因(AC)n多态等位基因的分布情况
Tab 2 Distribution of polymorphic (AC)n alleles of AR gene in non-diabetics and type 2 diabetes mellitus patients with or without nephropathy or retinopathy 等位基因
Allele
非DM
Non-DM
(n=290)
DN-/DR-
, 百拇医药
(n=122)
DN-/DR+(n=76)
DN+/DR-
(n=152)
DN+/DR+
(n=84)
Z-6
0.003(1)
0.024(3)
0.000(0)
0.006(3)
0.024(2)
, 百拇医药
Z-4
0.052(15)
0.033(4)
0.053(4)
0.006(3)
0.071(6)
Z-2
0.069(20)
0.057(7)
0.079(6)
0.092(14)
0.083(7)
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Z
0.307(89)
0.303(37)
0.289(22)
0.309(47)
0.333(28)
Z+2
0.259(75)
0.221(27)
0.303(23)
0.250(38)
0.238(20)
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Z+4
0.190(62)
0.188(23)
0.184(14)
0.204(31)
0.178(15)
Z+6
0.097(28)
0.172(21)*
0.092(7)
0.105(16)
0.071(6)△
, 百拇医药
注：数据以等位基因频率(染色体数)表示 Data was expressed as allelic frequency (chromosome score). DN-/DR-组与非DM相比，Fisher's确切 Comparison of DN-/DR- group and non-DM group.Fisher's exact,*P=0.044；DN+/DR+与DN-/DR-相比，Fisher's确切 Comparison of DN+/DR+group and DN-/DR- group, Fisher's exact,△P=0.038，OR=2.70表3 在非DM及2型糖尿病同时伴或不伴肾病、视网膜病变中含Z+6等位基因的基因型频率分布情况
Tab 3 Distribution of frequencies of genotypes containing Z+6 allele in non-diabetics and type 2 diabetes mellitus patients with or without nephropathy or retinopathy 基因型
, 百拇医药
Genotype
DN-/DR-
(n=61)
DN+/DR-
(n=76)
DN-/DR+
(n=38)
DN+/DR+
(n=42)
非DM
DNNon-DM
(n=145)
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Z+6/Z+6
0.016(1)
0(0)
0(0)
0(0)
0.007(1)
Z+6/X
0.311(19)
0.184(7)
0.210(16)
0.071(3)
0.179(26)
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X/X
0.672(41)*
0.816(31)
0.789(60)
0.921(39)**
0.814(118)
注：数据以基因型频率(人数)表示，DN-/DR-与非DM组相比，Z+6/Z+6和Z+6/X比X/X，Fisher's确切Data was expressed as genotype frequency (subject number). Comparison of Z+6/Z+6, Z+6/X vs X/X, Fisher's exact,*P=0.047 (DN-/DR- vs non-DM)**P=0.0043(DN+/DR+ vs DN-/DR-)
, 百拇医药
三、非DM及2型糖尿病肾病亚组，视网膜病变亚组的AR等位基因分布情况
与DN(-)组相比，DN-2组的Z-2等位基因频率显著增加(表4)，其基因型Z-2/Z-2与Z-2/X(X指等位基因Z-2以外其他等位基因)频率与XX基因型频率相比，亦可见到DN-2组含Z-2的基因型频率增加的趋势(表5)。
表4 非DM及2型糖尿病伴及不伴肾病、视网膜病变患者的AR基因(AC)n多态标志分布情况
Tab 4 Distribution of (AC)n polymorphism of AR gene in non-diabetics and type 2 diabetes mellitus patients with or without nephropathy or retinopathy 等位基因
, 百拇医药
Allele
非DM
Non-DM
(n=290)
DN(-)
(n=200)
DN-1
(n=182)
DN-2
(n=52)
DR(-)
(n=278)
DR(+)
, 百拇医药
(n=156)
Z-6
0.003(1)
0.015(3)
0.021(4)
0.019(1)
0.022(6)
0.013(2)
Z-4
0.052(15)
0.004(8)
0.033(6)
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0.058(3)
0.025(7)
0.064(10)
Z-2
0.069(20)
0.060(12)
0.071(13)
0.154(8)*
0.079(22)
0.077(12)
Z
0.307(89)
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0.300(60)
0.313(57)
0.346(18)
0.302(84)
0.320(50)
Z+2
0.259(75)
0.255(51)
0.258(47)
0.192(10)
0.237(66)
0.269(42)
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Z+4
0.190(62)
0.190(38)
0.198(36)
0.173(9)
0.201(56)
0.173(27)
Z+6
0.097(28)
0.140(28)
0.104(19)
0.058(3)
, 百拇医药
0.133(37)
0.083(13)
注：数据以等位基因频率(染色体数)表示，Z-2等位基因频率比较，Fisher's确切 Data was expressed as allelic frequency (chromosome score). Comparison of Z-2 allele. Fisher's exact,*P=0.039，OR=2.85〔DN-2 vs DN(-)〕表5 含Z-2等位基因的基因型频率分布情况
Tab 5 Distribution of frequencies of genotypes containing Z-2 allele 基因型
Genotype
非DM
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DN(-)
(n=100)
DN-1
(n=91)
DN-2
(n=26)
Non-DM
(n=145)
Z-2/Z-2
0(0)
0.011(1)
0.038(1)
, http://www.100md.com 0.007(1)
Z-2/X
0.12(12)
0.121(11)
0.231(6)
0.124(18)
X/X
0.88(88)*
0.868(79)
0.731(19)*
0.869(126)
, http://www.100md.com 注：数据以基因型频率(人数)表示，Z-2/Z-2和Z-2/X比X/X，Fisher's确切 Data was expressed as genotype frequency (subject number). Comparison of Z-2/Z-2,Z-2/X vs X/X, Fisher's exact,*P=0.059〔DN-2 vs DN(-)〕讨 论
肾功能不全DN-2组与无肾病的DN(-)组相比，AR的Z-2等位基因频率有显著增加(Fisher's确切P=0.039,OR=2.85)，提示AR的Z-2等位基因是促进早期2型糖尿病发生肾功能不全的风险因子。与无肾病的2型糖尿病相比，具有Z-2等位基因的2型糖尿病者，肾功能不全发生的风险率增加2.85倍。近年研究表明Z-2等位基因是2型糖尿病视网膜病变〔8〕、1型糖尿病早期肾病发病的危险因子〔9〕，我们的结果提示Z-2等位基因是2型糖尿病的严重肾病(肾功能不全)发病的危险因子。各家结果不尽相同，可能与研究对象、样本数及临床情况等不同有关，本组仅见Z-2等位基因与DN相关而未见与DR相关，可能有两个原因：(1)我们的研究组中DN(-)、DN-1及DN-2亚组的病程极为近似，而DR(-)组与DR(+)组病程有明显差别，后者明显长于前者，提示在本研究样本中病程以外的风险因素影响对DN较DR为突出；(2)本组DR者中因增生性视网膜病变较少，未能将DR行病情程度分组。但是各家结果可以得出一个共同结论：Z-2等位基因是促进糖尿病微血管病变的危险因子。最近的研究表明，AR的活性与AR基因多态性相关。含有Z-2等位基因的2型糖尿病视网膜病变患者，其AR活性显著增加，而呈现AR其它等位基因型者AR活性显著降低〔10〕。高血糖状态下AR被激活，葡萄糖经多元醇途径增多，导致细胞代谢和功能的障碍，促进DM微血管病变形成〔2〕。因此，我们不难理解多组研究者均见有微血管病变者Z-2等位基因频率显著增加。
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综合以前的报道和我们的结果，Z-2等位基因显然给无论1型还是2型DM微血管并发症带来易感性，而这种相关可以跨越种族而存在。这些结果强烈支持了运作于1型和2型DM微血管并发症的发病机制具有共同分子病因学基础。
在是否同时伴有肾病或视网膜病变的2型糖尿病的4个组与非DM对照组之间，我们发现非DM对照组与DM的DN-/DR-组相比，AR的Z+6等位基因显著减少，而DN-/DR-组与DN+/DR+组相比该等位基因显著增加(Fisher's双侧确切P=0.038,OR=2.70)。后者提示含有Z+6等位基因的2型糖尿病与无Z+6等位基因的2型糖尿病相比，同时并发DN和DR的发病风险率减少2.7倍。而Z+6等位基因频率显著增高的DN-/DR-组，很可能由于含Z+6等位基因的AR基因的AR活性低，尽管在高血糖状态下，也难以激活山梨醇旁路，因此很难发生2型糖尿病同时并发肾病和视网膜的病变。虽然非DM对照组的Z+6等位基因频率低于DN-/DR-组，与DN+/DR+无显著差异，但是我们可以推理，因非DM者血糖处于正常状态，AR在正常血糖状态下与葡萄糖的亲和力低〔11〕，不存在激活AR的机制，因此，即使是Z+6者亦不会引起AR活性升高，也就不存在发生糖尿病肾病和视网膜病变的病理生理基础。但是，这种有Z+6等位基因的非DM者一旦发生2型糖尿病，其发生肾病和视网膜病并发症的风险率可能会增加。
, 百拇医药
本项研究显示AR基因的5’端领域(AC)n二核苷酸重复序列多态标记与2型糖尿病肾功能不全的发病及同时发生肾病和视网膜病变有显著相关。AR的Z-2等位基因是2型糖尿病发生肾功能不全并发症的危险因子，而Z+6等位基因则是2型糖尿病这二种并发症的保护因子。
*本课题为国家教委留学回国人员科研启动基金，上海市重点学科基金资助
参考文献
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收稿：1998-08-25 修回：1999-05-05, http://www.100md.com
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A study of association between polymorphism of aldose reductase gene and diabetic microangiopathy
LIU Limei,XIANG Kunsan,ZHENG Taishan
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【Abstract】 Objective To investigate the association between dinucleotide repeat polymorphism at 5' end of aldose reductase (AR) gene and diabetic microangiopathy in Chinese. Methods A case-control study for 362 Chinese subjects (including 217 type 2 diabetes mellitus with or without nephropathy or retinopathy and 145 non-diabetes control) was performed. The number of (AC)n dinucleotide of AR gene was determined by PCR-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Results Tandem (AC) repeats of the AR gene were highly polymorphic and 7 alleles were observed in type 2 diabetes mellitus and control. The most prevalent allele was 24 times in (AC) repeat and was designated as Z allele. In type 2 diabetes mellitus with both nephropathy and retinopathy, a decreased frequency of Z+6 allele was found in comparison with type 2 diabetes mellitus without microangiopathy (Fisher's exact, P=0.038). In addition, an elevated frequency of Z-2 allele was observed in type 2 diabetes mellitus with severe nephropathy (renal insufficiency) as compared with type 2 diabetes mellitus without nephropathy (Fisher's exact, P=0.039). Conclusion AR gene alleles are associated with the development of diabetic microangiopathy. The Z-2 allele of the AR gene may be a risk factor for developing severe nephropathy in type 2 diabetes mellitus.Whereas, the Z+6 allele may protect against the development and progression of diabetic nephropathy and retinopathy in Chinese subjects.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes mellitus, type 2 Aldose reductase Gene Nephropathy Retinopathy
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:263-266)
糖尿病(DM)慢性微血管并发症特别是DM肾病和DM视网膜病是DM患者致死、致残的主要原因。DM患者病程长和代谢控制不良是DM肾病和DM视网膜病变发展中的重要危险因素〔1〕。近年来的研究表明，多元醇途径的激活，参与了DM微血管病变的发生及发展〔2〕。有些研究见到DM视网膜病变、肾病变者血细胞的醛糖还原酶(AR)活性增高〔3，4〕。另外，醛糖还原酶抑制剂(ARI)投予实验诱发的DM动物，能够抑制或减少DM微血管并发症的发生。而且ARI在临床应用的探讨上，也显示了一定的效果〔5，6〕。AR是多元醇代谢途径的限速酶，该酶基因表达异常或酶活性改变，势必影响DM微血管并发症的发生。人的功能性AR基因位于染色体7q35，由跨越18kb的10个外显子组成〔7〕。最近的研究显示，位于AR基因5’端转录起 始点上游2.1 kb处存在(AC)n二核苷酸重复序列多态标记，该标记与血AR活性水平相关。应用此标记见到AR基因与香港人的2型DM早期视网膜病变及英国白种人群的1型DM肾病关联〔8，9〕。关于AR基因多态性与中国人2型DM肾病(DN)，及同时伴有DM视网膜病变(DR)是否相关?国内外尚未见报道。本文就此进行研究。
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对象和方法
一、对象(表1)
表1 非DM及2型DM伴及不伴肾病或视网膜病变患者的临床参数
Tab 1 Clinical parameters of non-diabetics and type 2 diabetic patients with or without nephropathy or retinopathy 项目
Item
非DM
Non-DM
(n=145)
DN(-)(n=100)
, 百拇医药
DN-1
(n=91)
DN-2
(n=26)
DR(-)
(n=139)
DR(+)
(n=78)
年龄(岁)
Age(years)
55.6±11.5
58.3±12.7
, 百拇医药
58.7±12.4
61.2±11.7
57.8±12.5
60.7±12.2
性别
(男/女)
Sex(M/F)
91/54
45/55
54/37
20/6
83/56
, 百拇医药
36/42
BMI
(kg/m2)
22.9±2.9
23.7±3.5
22.2±4.0
23.4±2.4
23.4±3.9
22.3±3.0
病程(年)
Duration
(years)
, 百拇医药
-
6.0±6.7
5.2±6.0
6.5±7.8
3.9±4.9
8.9±7.8**
注：与DR(+)相比, Student's t检验 vs DR(+), Student's t test,**P<0.001
365例无血缘关系的上海地区中国汉族人，选自上海市第六人民医院内分泌科中国人DNA标本库。其中2型糖尿病患者217例，皆来自本院住院患者，并在本院糖尿病门诊长期随访；非糖尿病对照组145例，为本院职工或居民。
, 百拇医药
1.2型糖尿病患者根据同时伴(+)与不伴(-)DN与DR(由24小时尿白蛋白含量、血尿素氮、肌酐测定及专职眼科医生对患者进行彩色眼底拍片确定)分为四组：DN-/DR-组，DN-/DR+组，DN+/DR-组，DN+/DR+组。
2.DN进一步分为以下亚组：无肾病期DN(-)组，2次测尿白蛋白<28.8 mg/24h或尿蛋白<200 mg/24h；蛋白尿肾病期DN-1组，2次测尿白蛋白≥28.8 mg/24h或尿蛋白≥200 mg/24h；肾功能不全期DN-2组，有蛋白尿伴2次血Cr≥110 μmol/L。
二、方法
1.DNA提取：取周围静脉血6～10 ml，蛋白酶K处理后用酚氯仿法提取基因组DNA。
2.AR等位基因测定：5’及3’端引物分别为AR-Pr1：5’-GAATCTAACATGCTCTGAACC-3’，AR-Pr2：5’-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3’〔8〕。以γ-32P(3 000 ci/mmol)(美国Amersham)-T4聚核苷酸激酶法(美国New England, Biolabs)标记AR-Pr1，用PCR扩增仪(美国Perkin Elmers Cetus)进行反应，初期变性94℃5分钟，继之30个周期，每个周期中变性94℃1分钟，退火-延伸68℃2分钟。用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物后放射自显影。
, 百拇医药
3.确定AR等位基因多态标记(AC)n的重复数目：将等位基因为纯合子的个体DNA标本行PCR后，以纯化后的扩增片段为测定模板，以γ-32P-ATP标记AR-Pr1，与模板各1 pmol/L进行循环DNA序列分析(Hot Tub DNA序列分析系统，美国Amersham)。
三、统计分析
1.从放射自显影图上直接判读个体基因型，计算样本等位基因频率和基因型频率。确认其符合Hardy-Weinberg平衡，计算多态信息含量(PIC)和杂合度观察值。
2.两组间临床特征的比较，使用不配对student's t test检验。组间频率比较用Fisher's双侧确切检验。结 果
一、中国人AR基因(AC)n重复序列多态标记的特点
, 百拇医药
本组样本中见到七种AR等位基因。将最常见的等位基因命名为Z，其纯合子样本DNA测序结果为(AC)24，与国外所用命名一致。将(AC)n中的n为21、22、23及25、26、27，分别命名为Z-6、Z-4、Z-2、Z+2、Z+4、Z+6等位基因。各等位基因间长度差异为2bp，亦即由Z-6等位基因至Z+6等位基因长度为132bp～144bp。2型糖尿病患者中共见23种基因型，非DM者中共见20种基因型，二者均以基因型Z/Z+2为最多见。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，PIC与杂合度观察值分别为0.77及0.73。
二、非DM者及2型糖尿病者同时伴有、不伴有肾病，视网膜病变患者的AR等位基因频率的分布情况
DN-/DR-组与非DM组相比，Z+6等位基因频率显著增高，其Z+6/Z+6或Z+6/X的基因型(X指除Z+6以外的其它等位基因型)频率与X/X基因型频率之比显著增高。而DN+/DR+组与DN-/DR-组相比，Z+6等位基因频率显著减少，Z+6/Z+6或Z+6/X的基因型频率与X/X基因型频率之比也显著减少(表2，表3)。
, 百拇医药
表2 非DM及2型糖尿病同时伴或不伴肾病、视网膜病变患者的AR基因(AC)n多态等位基因的分布情况
Tab 2 Distribution of polymorphic (AC)n alleles of AR gene in non-diabetics and type 2 diabetes mellitus patients with or without nephropathy or retinopathy 等位基因
Allele
非DM
Non-DM
(n=290)
DN-/DR-
, 百拇医药
(n=122)
DN-/DR+(n=76)
DN+/DR-
(n=152)
DN+/DR+
(n=84)
Z-6
0.003(1)
0.024(3)
0.000(0)
0.006(3)
0.024(2)
, 百拇医药
Z-4
0.052(15)
0.033(4)
0.053(4)
0.006(3)
0.071(6)
Z-2
0.069(20)
0.057(7)
0.079(6)
0.092(14)
0.083(7)
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Z
0.307(89)
0.303(37)
0.289(22)
0.309(47)
0.333(28)
Z+2
0.259(75)
0.221(27)
0.303(23)
0.250(38)
0.238(20)
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Z+4
0.190(62)
0.188(23)
0.184(14)
0.204(31)
0.178(15)
Z+6
0.097(28)
0.172(21)*
0.092(7)
0.105(16)
0.071(6)△
, 百拇医药
注：数据以等位基因频率(染色体数)表示 Data was expressed as allelic frequency (chromosome score). DN-/DR-组与非DM相比，Fisher's确切 Comparison of DN-/DR- group and non-DM group.Fisher's exact,*P=0.044；DN+/DR+与DN-/DR-相比，Fisher's确切 Comparison of DN+/DR+group and DN-/DR- group, Fisher's exact,△P=0.038，OR=2.70表3 在非DM及2型糖尿病同时伴或不伴肾病、视网膜病变中含Z+6等位基因的基因型频率分布情况
Tab 3 Distribution of frequencies of genotypes containing Z+6 allele in non-diabetics and type 2 diabetes mellitus patients with or without nephropathy or retinopathy 基因型
, 百拇医药
Genotype
DN-/DR-
(n=61)
DN+/DR-
(n=76)
DN-/DR+
(n=38)
DN+/DR+
(n=42)
非DM
DNNon-DM
(n=145)
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Z+6/Z+6
0.016(1)
0(0)
0(0)
0(0)
0.007(1)
Z+6/X
0.311(19)
0.184(7)
0.210(16)
0.071(3)
0.179(26)
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X/X
0.672(41)*
0.816(31)
0.789(60)
0.921(39)**
0.814(118)
注：数据以基因型频率(人数)表示，DN-/DR-与非DM组相比，Z+6/Z+6和Z+6/X比X/X，Fisher's确切Data was expressed as genotype frequency (subject number). Comparison of Z+6/Z+6, Z+6/X vs X/X, Fisher's exact,*P=0.047 (DN-/DR- vs non-DM)**P=0.0043(DN+/DR+ vs DN-/DR-)
, 百拇医药
三、非DM及2型糖尿病肾病亚组，视网膜病变亚组的AR等位基因分布情况
与DN(-)组相比，DN-2组的Z-2等位基因频率显著增加(表4)，其基因型Z-2/Z-2与Z-2/X(X指等位基因Z-2以外其他等位基因)频率与XX基因型频率相比，亦可见到DN-2组含Z-2的基因型频率增加的趋势(表5)。
表4 非DM及2型糖尿病伴及不伴肾病、视网膜病变患者的AR基因(AC)n多态标志分布情况
Tab 4 Distribution of (AC)n polymorphism of AR gene in non-diabetics and type 2 diabetes mellitus patients with or without nephropathy or retinopathy 等位基因
, 百拇医药
Allele
非DM
Non-DM
(n=290)
DN(-)
(n=200)
DN-1
(n=182)
DN-2
(n=52)
DR(-)
(n=278)
DR(+)
, 百拇医药
(n=156)
Z-6
0.003(1)
0.015(3)
0.021(4)
0.019(1)
0.022(6)
0.013(2)
Z-4
0.052(15)
0.004(8)
0.033(6)
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0.058(3)
0.025(7)
0.064(10)
Z-2
0.069(20)
0.060(12)
0.071(13)
0.154(8)*
0.079(22)
0.077(12)
Z
0.307(89)
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0.300(60)
0.313(57)
0.346(18)
0.302(84)
0.320(50)
Z+2
0.259(75)
0.255(51)
0.258(47)
0.192(10)
0.237(66)
0.269(42)
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Z+4
0.190(62)
0.190(38)
0.198(36)
0.173(9)
0.201(56)
0.173(27)
Z+6
0.097(28)
0.140(28)
0.104(19)
0.058(3)
, 百拇医药
0.133(37)
0.083(13)
注：数据以等位基因频率(染色体数)表示，Z-2等位基因频率比较，Fisher's确切 Data was expressed as allelic frequency (chromosome score). Comparison of Z-2 allele. Fisher's exact,*P=0.039，OR=2.85〔DN-2 vs DN(-)〕表5 含Z-2等位基因的基因型频率分布情况
Tab 5 Distribution of frequencies of genotypes containing Z-2 allele 基因型
Genotype
非DM
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DN(-)
(n=100)
DN-1
(n=91)
DN-2
(n=26)
Non-DM
(n=145)
Z-2/Z-2
0(0)
0.011(1)
0.038(1)
, http://www.100md.com 0.007(1)
Z-2/X
0.12(12)
0.121(11)
0.231(6)
0.124(18)
X/X
0.88(88)*
0.868(79)
0.731(19)*
0.869(126)
, http://www.100md.com 注：数据以基因型频率(人数)表示，Z-2/Z-2和Z-2/X比X/X，Fisher's确切 Data was expressed as genotype frequency (subject number). Comparison of Z-2/Z-2,Z-2/X vs X/X, Fisher's exact,*P=0.059〔DN-2 vs DN(-)〕讨 论
肾功能不全DN-2组与无肾病的DN(-)组相比，AR的Z-2等位基因频率有显著增加(Fisher's确切P=0.039,OR=2.85)，提示AR的Z-2等位基因是促进早期2型糖尿病发生肾功能不全的风险因子。与无肾病的2型糖尿病相比，具有Z-2等位基因的2型糖尿病者，肾功能不全发生的风险率增加2.85倍。近年研究表明Z-2等位基因是2型糖尿病视网膜病变〔8〕、1型糖尿病早期肾病发病的危险因子〔9〕，我们的结果提示Z-2等位基因是2型糖尿病的严重肾病(肾功能不全)发病的危险因子。各家结果不尽相同，可能与研究对象、样本数及临床情况等不同有关，本组仅见Z-2等位基因与DN相关而未见与DR相关，可能有两个原因：(1)我们的研究组中DN(-)、DN-1及DN-2亚组的病程极为近似，而DR(-)组与DR(+)组病程有明显差别，后者明显长于前者，提示在本研究样本中病程以外的风险因素影响对DN较DR为突出；(2)本组DR者中因增生性视网膜病变较少，未能将DR行病情程度分组。但是各家结果可以得出一个共同结论：Z-2等位基因是促进糖尿病微血管病变的危险因子。最近的研究表明，AR的活性与AR基因多态性相关。含有Z-2等位基因的2型糖尿病视网膜病变患者，其AR活性显著增加，而呈现AR其它等位基因型者AR活性显著降低〔10〕。高血糖状态下AR被激活，葡萄糖经多元醇途径增多，导致细胞代谢和功能的障碍，促进DM微血管病变形成〔2〕。因此，我们不难理解多组研究者均见有微血管病变者Z-2等位基因频率显著增加。
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综合以前的报道和我们的结果，Z-2等位基因显然给无论1型还是2型DM微血管并发症带来易感性，而这种相关可以跨越种族而存在。这些结果强烈支持了运作于1型和2型DM微血管并发症的发病机制具有共同分子病因学基础。
在是否同时伴有肾病或视网膜病变的2型糖尿病的4个组与非DM对照组之间，我们发现非DM对照组与DM的DN-/DR-组相比，AR的Z+6等位基因显著减少，而DN-/DR-组与DN+/DR+组相比该等位基因显著增加(Fisher's双侧确切P=0.038,OR=2.70)。后者提示含有Z+6等位基因的2型糖尿病与无Z+6等位基因的2型糖尿病相比，同时并发DN和DR的发病风险率减少2.7倍。而Z+6等位基因频率显著增高的DN-/DR-组，很可能由于含Z+6等位基因的AR基因的AR活性低，尽管在高血糖状态下，也难以激活山梨醇旁路，因此很难发生2型糖尿病同时并发肾病和视网膜的病变。虽然非DM对照组的Z+6等位基因频率低于DN-/DR-组，与DN+/DR+无显著差异，但是我们可以推理，因非DM者血糖处于正常状态，AR在正常血糖状态下与葡萄糖的亲和力低〔11〕，不存在激活AR的机制，因此，即使是Z+6者亦不会引起AR活性升高，也就不存在发生糖尿病肾病和视网膜病变的病理生理基础。但是，这种有Z+6等位基因的非DM者一旦发生2型糖尿病，其发生肾病和视网膜病并发症的风险率可能会增加。
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本项研究显示AR基因的5’端领域(AC)n二核苷酸重复序列多态标记与2型糖尿病肾功能不全的发病及同时发生肾病和视网膜病变有显著相关。AR的Z-2等位基因是2型糖尿病发生肾功能不全并发症的危险因子，而Z+6等位基因则是2型糖尿病这二种并发症的保护因子。
*本课题为国家教委留学回国人员科研启动基金，上海市重点学科基金资助
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收稿：1998-08-25 修回：1999-05-05, http://www.100md.com