心脏手术中用不同剂量抑肽酶动脉过滤网的电镜观察
作者：曹新来 胡小琴
单位：曹新来 胡小琴 中国医学科学院，中国协和医科大学，心血管病研究所，阜外心血管病医院，麻醉体外循环研究室，北京市，100037
关键词：体外循环；抑肽酶；扫描电镜；白细胞
摘要 摘要：目的：通过扫描电镜观察体外循环(CPB)期间血细胞在动脉过滤网表面粘附、聚集及纤维蛋白沉积的情况，评价不同剂量抑肽酶的抗炎作用。
方法：12例双瓣膜置换病人随机双盲分为两组：抑肽酶(aprotinin)全剂量组(n=6)及抑肽酶半剂量组(n=6)。CPB结束时取动脉过滤网行扫描电镜观察。
结果：抑肽酶全剂量组动脉过滤网表面光洁，偶见白细胞粘附；抑肽酶半剂量组过滤网表面可见纤维蛋白沉积，大量白细胞粘附、细胞聚集、成簇，伴有多形态伪足。全剂量组粘附度为2.50±0.28，明显低于半剂量组5.30±0.51，两组粘附度计分有显著差异(P<0.05)。
, 百拇医药
结论：全剂量抑肽酶可减少白细胞在异物表面的粘附、聚集及纤维蛋白的沉积，抑制接触激活系统，减轻炎性反应；而半剂量抑肽酶效果不明显。
中图分类号：R542.5
文献标识码：A
文章编号：1000-3614(1999)05-0309-02
Observation of Arterial Filters by Scanning Election Microscopy when Different Dose Aprotinin was Used during Cardiopulmonary Bypass
Cao Xinlai,Hu Xiaoqin.
, 百拇医药 Research Laboratory of Anesthesiology and Cardiopulmonary Bypass,Cardiovascular Institute and
Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract Objective:To compare the anti-inflammatory effect of different doses aprotinin through observing the adhesion and aggregation of blood cells and the deposition of fibrin on the surface of arterial filters by scanning electron microscopy after CPB.
Methods:Twelve patients who underwent heart valves replacement were randomized into two groups:①full-dose group(n=6) and ②half-dose group(n=6).The surface of arterial filters were examined with scanning electron microscopy after CPB.
, 百拇医药
Results:Scanning electron micrographs demonstrated that the arterial filters in the full-dose group had relatively clean surface with only occasional leukocyte adhesion,and the arterial filters of the half-dose group had considerable surface coverage by adherent leukocytes and fibrin.Using an arbitrary adhesion score,statistically significant differences between the groups were noted,it was lower in the full-dose group(2.50±0.28)than in the half-dose group(5.30±0.51,p<0.05).
, http://www.100md.com
Conclusions:The full-dose of aprotinin decreased cellular adhesion and diminished the inflammatory response.However,the effect of half-dose aprotinin was not significant.
Key words Cardiopulmonary bypass;Aprotinin;Scanning electron microscopy;Leukocyte
(Chinese Circulation Journal,1999,14:309.)
体外循环(CPB)可引起脏器功能失调，这些功能改变与全身炎性反应密切相关。CPB开始血液与CPB异物表面接触，相互作用可诱发一系列变化，包括补体、激肽释放酶、凝血、纤溶等血浆系统及白细胞、血小板的激活[1]。抑肽酶(aprotinin)作为丝氨酸蛋白酶抑制剂已证实除可减少手术失血外，还可减轻CPB炎性级联反应[2]。本研究通过扫描电镜观察CPB期间应用不同剂量抑肽酶对血细胞在动脉过滤网表面粘附、聚集的影响，从这一侧面评价抑肽酶的抗炎作用及其与剂量的关系。
, 百拇医药
1 材料和方法
选自1998年5月～10月12例双瓣膜置换术病人，年龄40～65岁，心功能[美国麻醉师协会(ASA)分级]Ⅱ～Ⅲ级，肝、肾功能及出、凝血功能无异常。随机双盲分为两组：①抑肽酶全剂量组(n=6)：CPB前静脉滴注抑肽酶200万KIU，随后每小时持续静脉滴注50万KIU至关胸结束；预充液中加入抑肽酶200万KIU。②抑肽酶半剂量组(n=6)：CPB前静脉滴注抑肽酶100万KIU，随后每小时持续静脉滴注25万KIU至关胸结束；预充液中加入抑肽酶100万KIU。
两组应用统一的术式、麻醉和CPB方法。采用德国Stocker人工心肺机，进口膜式氧合器及国产动脉微栓过滤器。CPB以1 000～1 200 ml乳酸盐林格液、1 000 ml血定安、2 000 IU肝素实施无血预充。CPB结束后，迅速取出动脉过滤网，经生理盐水浸泡后以3%戊二醛磷酸盐缓冲液固定，继以30%至100%的乙醇梯度脱水各15分钟，置醋酸异戊脂中过夜，在临界干燥器中吹入二氧化碳(CO2)气体以干燥样本，扫描前真空喷金，最后以日立S-800型扫描电镜观察。
, http://www.100md.com
扫描电镜观察采用十度计分法来评定，其标准为1度：过滤网表面洁净，无血液有形成份形态学变化；3度：过滤网表面有少量细胞粘附，细胞有少许伪足，偶见纤维蛋白纤维；6度：白细胞有大量多形态伪足，血小板、白细胞聚集成簇；10度：粘附极其明显，有大量的沉积物，团块内的细胞难以区分，此外，可见大量纤维蛋白纤维。每个扫描样本随机取20个观察点，记录各观察点的粘附度，以平均值作为各个样本的最后粘附度。
统计学处理：利用SPSS软件包，采用Mann-Whitney U检验进行统计学分析，数据以
±s表示，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
两组患者在年龄、体重、CPB时间上无明显差异。
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抑肽酶全剂量组动脉过滤网表面光洁、无大量血细胞粘附及纤维蛋白沉积，只偶见白细胞(图1)，其粘附度计分为2.50±0.28。抑肽酶半剂量组动脉过滤网表面可见纤维蛋白沉积，大量白细胞粘附、细胞聚集、成簇，伴有多形态的伪足(图2)，其粘附度计分为5.30±0.51。两组粘附度计分比较有显著差异(P<0.05)。
图1、2 心脏手术中用不同剂量抑肽酶动脉过滤网电镜观察 图1 抑肽酶全剂量组扫描电镜照片(粘附度=2， ×1 000)
图2 抑肽酶半剂量组扫描电镜照片(粘附度=8， ×1 000)
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3 讨论
CPB激活血细胞，激活的白细胞可聚集、隔离、脱颗粒和释放蛋白水解酶、产生氧自由基产物，与术后器官功能失调密切相关。本实验扫描电镜显示，全剂量抑肽酶可明显减轻白细胞的激活，而半剂量抑肽酶效果不佳。CPB期间，CPB回路内血液—异物表面接触，触发接触途径激活。在接触途径中有4种重要成分：凝血因子XII、凝血因子XI、激肽释放酶原、高分子激肽原(HMWK)参与级联反应，凝血因子XII首先在带负电荷的异物表面激活， 形成凝血因子XIIa。凝血因子XIIa可激活凝血因子XI、于是放大内源性凝血级联反应，导致凝血酶的形成；且可使激肽释放酶原转化为激肽释放酶。激肽释放酶通过正反馈作用，可加速凝血因子XII的激活，且使纤溶酶原转化为纤溶酶，并加速白细胞的激活、聚集及脱颗粒，此外尚引起补体的激活。接触途径激活的结果势必引起纤维蛋白沉积，且增加激活的白细胞与CPB装置粘附的趋势。
, 百拇医药 抑制血液—异物表面接触诱发炎性反应有两种基本方法[3]：一是在异物表面应用生物相容性材料。二是使用药物抑制接触途径酶(凝血因子XIIa及激肽释放酶)。抑肽酶为一从牛肺中提取的天然广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、纤溶酶、激肽释放酶、FXIIa及凝血酶等可产生抑制作用，有效抑制纤溶酶、血浆激肽释放酶所需的抑肽酶浓度分别应达至125 KIU/ml及250 KIU/ml。Diego[4]证实全剂量抑肽酶可达至抑制激肽释放酶的血浆水平，从而可抑制其参与的接触激活级联反应，减少白细胞的激活、粘附及纤维蛋白的沉积，减轻炎性反应；而半剂量抑肽酶不足以抑制CPB诱发的炎性级联反应；全剂量、半剂量抑肽酶在减少失血方面有相同的作用[5]，但只有全剂量抑肽酶才具备充分的抗炎作用。本实验采用电镜观察从形态学上进一步论证了该观点。对动脉过滤网行扫描电镜观察，有取材方便、样本充足及避免其它检测方法所致的体外激活之特点，为观察体内白细胞激活、纤维蛋白沉积的好方法[6]。
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本实验表明，全剂量抑肽酶可减少CPB期间白细胞在异物表面的粘附、聚集及纤维蛋白的沉积，抑制接触激活系统，减轻炎性反应；而半剂量抑肽酶作用不明显。
作者简介：曹新来(1964-)，男，主治医师，博士，主要从事体外循环炎性反应方面的研究
参考文献
1 Li-Chien Hsu.Biocompatibility in cardiopulmonary bypass.J Cardiothorac Vasc Anesth,1997,11:376—382.
2 Soeparwata R,Hartman AR,Frerichmann U,et al.Aprotinin diminishes inflammatory processes.Inter J Cardiol,1996,53(Suppl):S55—S63.
, http://www.100md.com
3 Usui A,Hiroura M,Kawamura M,et al.Nafamostat mesilate reduces blood-foreign surface reactions similar to biocompatible materials.Ann Thorac Surg,1996,62:1404—1411.
4 Diego RP.Methylprednisolone and full-dose aprotinin reduce reperfusion injury after cardiopulmonary bypass.J Cardiothorac Vasc Anesth,1997,11:29—31.
5 Stammers AH,Huffman S,Alonso A,et al.The antiinflammaory effect of aprotinin in patients undergoing cardio surgery with cardiopulmonary bypass.J Extra-corporeal Tech,1997,29:114—122.
6 Muehrcke DD,McCarthy PM.Biocompatibility of heparin-coated extacorporeal bypass circuits:a randomized,masked clinical trial.J Thorac Cardiovasc Surg,1996,112:472—483.
收稿：1999-01-15
修回：1999-06-02, 百拇医药
单位：曹新来 胡小琴 中国医学科学院，中国协和医科大学，心血管病研究所，阜外心血管病医院，麻醉体外循环研究室，北京市，100037
关键词：体外循环；抑肽酶；扫描电镜；白细胞
摘要 摘要：目的：通过扫描电镜观察体外循环(CPB)期间血细胞在动脉过滤网表面粘附、聚集及纤维蛋白沉积的情况，评价不同剂量抑肽酶的抗炎作用。
方法：12例双瓣膜置换病人随机双盲分为两组：抑肽酶(aprotinin)全剂量组(n=6)及抑肽酶半剂量组(n=6)。CPB结束时取动脉过滤网行扫描电镜观察。
结果：抑肽酶全剂量组动脉过滤网表面光洁，偶见白细胞粘附；抑肽酶半剂量组过滤网表面可见纤维蛋白沉积，大量白细胞粘附、细胞聚集、成簇，伴有多形态伪足。全剂量组粘附度为2.50±0.28，明显低于半剂量组5.30±0.51，两组粘附度计分有显著差异(P<0.05)。
, 百拇医药
结论：全剂量抑肽酶可减少白细胞在异物表面的粘附、聚集及纤维蛋白的沉积，抑制接触激活系统，减轻炎性反应；而半剂量抑肽酶效果不明显。
中图分类号：R542.5
文献标识码：A
文章编号：1000-3614(1999)05-0309-02
Observation of Arterial Filters by Scanning Election Microscopy when Different Dose Aprotinin was Used during Cardiopulmonary Bypass
Cao Xinlai,Hu Xiaoqin.
, 百拇医药 Research Laboratory of Anesthesiology and Cardiopulmonary Bypass,Cardiovascular Institute and
Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract Objective:To compare the anti-inflammatory effect of different doses aprotinin through observing the adhesion and aggregation of blood cells and the deposition of fibrin on the surface of arterial filters by scanning electron microscopy after CPB.
Methods:Twelve patients who underwent heart valves replacement were randomized into two groups:①full-dose group(n=6) and ②half-dose group(n=6).The surface of arterial filters were examined with scanning electron microscopy after CPB.
, 百拇医药
Results:Scanning electron micrographs demonstrated that the arterial filters in the full-dose group had relatively clean surface with only occasional leukocyte adhesion,and the arterial filters of the half-dose group had considerable surface coverage by adherent leukocytes and fibrin.Using an arbitrary adhesion score,statistically significant differences between the groups were noted,it was lower in the full-dose group(2.50±0.28)than in the half-dose group(5.30±0.51,p<0.05).
, http://www.100md.com
Conclusions:The full-dose of aprotinin decreased cellular adhesion and diminished the inflammatory response.However,the effect of half-dose aprotinin was not significant.
Key words Cardiopulmonary bypass;Aprotinin;Scanning electron microscopy;Leukocyte
(Chinese Circulation Journal,1999,14:309.)
体外循环(CPB)可引起脏器功能失调，这些功能改变与全身炎性反应密切相关。CPB开始血液与CPB异物表面接触，相互作用可诱发一系列变化，包括补体、激肽释放酶、凝血、纤溶等血浆系统及白细胞、血小板的激活[1]。抑肽酶(aprotinin)作为丝氨酸蛋白酶抑制剂已证实除可减少手术失血外，还可减轻CPB炎性级联反应[2]。本研究通过扫描电镜观察CPB期间应用不同剂量抑肽酶对血细胞在动脉过滤网表面粘附、聚集的影响，从这一侧面评价抑肽酶的抗炎作用及其与剂量的关系。
, 百拇医药
1 材料和方法
选自1998年5月～10月12例双瓣膜置换术病人，年龄40～65岁，心功能[美国麻醉师协会(ASA)分级]Ⅱ～Ⅲ级，肝、肾功能及出、凝血功能无异常。随机双盲分为两组：①抑肽酶全剂量组(n=6)：CPB前静脉滴注抑肽酶200万KIU，随后每小时持续静脉滴注50万KIU至关胸结束；预充液中加入抑肽酶200万KIU。②抑肽酶半剂量组(n=6)：CPB前静脉滴注抑肽酶100万KIU，随后每小时持续静脉滴注25万KIU至关胸结束；预充液中加入抑肽酶100万KIU。
两组应用统一的术式、麻醉和CPB方法。采用德国Stocker人工心肺机，进口膜式氧合器及国产动脉微栓过滤器。CPB以1 000～1 200 ml乳酸盐林格液、1 000 ml血定安、2 000 IU肝素实施无血预充。CPB结束后，迅速取出动脉过滤网，经生理盐水浸泡后以3%戊二醛磷酸盐缓冲液固定，继以30%至100%的乙醇梯度脱水各15分钟，置醋酸异戊脂中过夜，在临界干燥器中吹入二氧化碳(CO2)气体以干燥样本，扫描前真空喷金，最后以日立S-800型扫描电镜观察。
, http://www.100md.com
扫描电镜观察采用十度计分法来评定，其标准为1度：过滤网表面洁净，无血液有形成份形态学变化；3度：过滤网表面有少量细胞粘附，细胞有少许伪足，偶见纤维蛋白纤维；6度：白细胞有大量多形态伪足，血小板、白细胞聚集成簇；10度：粘附极其明显，有大量的沉积物，团块内的细胞难以区分，此外，可见大量纤维蛋白纤维。每个扫描样本随机取20个观察点，记录各观察点的粘附度，以平均值作为各个样本的最后粘附度。
统计学处理：利用SPSS软件包，采用Mann-Whitney U检验进行统计学分析，数据以
±s表示，P<0.05为有显著性差异。2 结果
两组患者在年龄、体重、CPB时间上无明显差异。
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抑肽酶全剂量组动脉过滤网表面光洁、无大量血细胞粘附及纤维蛋白沉积，只偶见白细胞(图1)，其粘附度计分为2.50±0.28。抑肽酶半剂量组动脉过滤网表面可见纤维蛋白沉积，大量白细胞粘附、细胞聚集、成簇，伴有多形态的伪足(图2)，其粘附度计分为5.30±0.51。两组粘附度计分比较有显著差异(P<0.05)。
图1、2 心脏手术中用不同剂量抑肽酶动脉过滤网电镜观察 图1 抑肽酶全剂量组扫描电镜照片(粘附度=2， ×1 000)
图2 抑肽酶半剂量组扫描电镜照片(粘附度=8， ×1 000)
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3 讨论
CPB激活血细胞，激活的白细胞可聚集、隔离、脱颗粒和释放蛋白水解酶、产生氧自由基产物，与术后器官功能失调密切相关。本实验扫描电镜显示，全剂量抑肽酶可明显减轻白细胞的激活，而半剂量抑肽酶效果不佳。CPB期间，CPB回路内血液—异物表面接触，触发接触途径激活。在接触途径中有4种重要成分：凝血因子XII、凝血因子XI、激肽释放酶原、高分子激肽原(HMWK)参与级联反应，凝血因子XII首先在带负电荷的异物表面激活， 形成凝血因子XIIa。凝血因子XIIa可激活凝血因子XI、于是放大内源性凝血级联反应，导致凝血酶的形成；且可使激肽释放酶原转化为激肽释放酶。激肽释放酶通过正反馈作用，可加速凝血因子XII的激活，且使纤溶酶原转化为纤溶酶，并加速白细胞的激活、聚集及脱颗粒，此外尚引起补体的激活。接触途径激活的结果势必引起纤维蛋白沉积，且增加激活的白细胞与CPB装置粘附的趋势。
, 百拇医药 抑制血液—异物表面接触诱发炎性反应有两种基本方法[3]：一是在异物表面应用生物相容性材料。二是使用药物抑制接触途径酶(凝血因子XIIa及激肽释放酶)。抑肽酶为一从牛肺中提取的天然广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、纤溶酶、激肽释放酶、FXIIa及凝血酶等可产生抑制作用，有效抑制纤溶酶、血浆激肽释放酶所需的抑肽酶浓度分别应达至125 KIU/ml及250 KIU/ml。Diego[4]证实全剂量抑肽酶可达至抑制激肽释放酶的血浆水平，从而可抑制其参与的接触激活级联反应，减少白细胞的激活、粘附及纤维蛋白的沉积，减轻炎性反应；而半剂量抑肽酶不足以抑制CPB诱发的炎性级联反应；全剂量、半剂量抑肽酶在减少失血方面有相同的作用[5]，但只有全剂量抑肽酶才具备充分的抗炎作用。本实验采用电镜观察从形态学上进一步论证了该观点。对动脉过滤网行扫描电镜观察，有取材方便、样本充足及避免其它检测方法所致的体外激活之特点，为观察体内白细胞激活、纤维蛋白沉积的好方法[6]。
, http://www.100md.com
本实验表明，全剂量抑肽酶可减少CPB期间白细胞在异物表面的粘附、聚集及纤维蛋白的沉积，抑制接触激活系统，减轻炎性反应；而半剂量抑肽酶作用不明显。
作者简介：曹新来(1964-)，男，主治医师，博士，主要从事体外循环炎性反应方面的研究
参考文献
1 Li-Chien Hsu.Biocompatibility in cardiopulmonary bypass.J Cardiothorac Vasc Anesth,1997,11:376—382.
2 Soeparwata R,Hartman AR,Frerichmann U,et al.Aprotinin diminishes inflammatory processes.Inter J Cardiol,1996,53(Suppl):S55—S63.
, http://www.100md.com
3 Usui A,Hiroura M,Kawamura M,et al.Nafamostat mesilate reduces blood-foreign surface reactions similar to biocompatible materials.Ann Thorac Surg,1996,62:1404—1411.
4 Diego RP.Methylprednisolone and full-dose aprotinin reduce reperfusion injury after cardiopulmonary bypass.J Cardiothorac Vasc Anesth,1997,11:29—31.
5 Stammers AH,Huffman S,Alonso A,et al.The antiinflammaory effect of aprotinin in patients undergoing cardio surgery with cardiopulmonary bypass.J Extra-corporeal Tech,1997,29:114—122.
6 Muehrcke DD,McCarthy PM.Biocompatibility of heparin-coated extacorporeal bypass circuits:a randomized,masked clinical trial.J Thorac Cardiovasc Surg,1996,112:472—483.
收稿：1999-01-15
修回：1999-06-02, 百拇医药