食管鳞状细胞癌中p16蛋白的表达及其临床意义
作者：张惠忠 李海刚 沈溪明 董书坤 张 华 熊利华
单位：张惠忠 张 华 熊利华 中山医科大学孙逸仙纪念医院 胸心外科；李海刚 沈溪明 董书坤 病理科(510120)
关键词：食管肿瘤；p16蛋白；免疫组织化学
广东医学990507 摘要：目的 研究p16蛋白与食管鳞状细胞癌(ESC)生物学行为的关系。方法 应用LSAB免疫组织化学方法检测65例ESC中p16蛋白表达的情况，探讨它与病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移和预后的关系。结果 64例ESC中p16蛋白的阳性率为47.7%，在53例癌旁鳞状上皮的阳性率为67.9%；高、中、低分化ESC中p16蛋白的阳性率分别为64.8%、45.5%和25.0%；在早中期和晚期ESC中p16蛋白阳性率分别为84.6%和38.5%；20例伴淋巴结转移的病例p16蛋白的阳性率为25.0%，而45例不伴淋巴结转移病例p16蛋白的阳性率为60.0%；生存期1 a及以上组p16蛋白阳性率为63.0%，显著高于1 a以下组的26.7%(P<0.05)。结论 p16基因的丢失或突变与ESC发生关系密切，而且p16蛋白与ESC的病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移和预后有关。p16蛋白的检测可作为ESC生物学行为和预后评价的参考指标。
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Significance of p16 protein expression in human esophageal squamous cell carcinoma
Zhang Huizhong, Li Haigang, Shen Ximing, et al.
Department of Cardiothoracic Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
Abstract Objective To investigate the expression of p16 protein in human esophageal squamous cell carcinoma(ESC) and its significance. Methods The expression of p16 protein in 65 cases of ESC was detected by immunohistochemical (S-P) method.Results The positive rate of p16 protein in ESC and squamous epithelium beside carcinoma tissue was 47.7% and 67.9% respectively. In well, mediate and low differentiated ESC, the rate was 64.85%, 45.5% and 25.0%, in early-middle and late stage was 84.6% and 38.5%, in with and without lymph node metastasis was 25.0% and 60.0%, in the group of the survival time over 1 year and below that period was 63.0% and 26.7% (P<0.05).Conclusions The deletion or mutation of p16 gene plays deep affection in the genesis and development of esophageal carcinoma, and p16 protein could be considered as a predictor of malignant potential and prognosis.
, 百拇医药
Key words Esophageal neoplasms p16 protein Immunohistochemistry
p16基因是新近鉴定的肿瘤抑制基因，又称MTS1(multiple tumor suppressor 1)。人类的95%癌细胞株有p16基因的缺失或突变[1]。为探讨p16基因与ESC病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移和预后的关系，我们采用LSAB免疫组化方法，检测了65例ESC组织及53例癌旁组织的p16蛋白表达的情况。
1 材料与方法
1.1 材料 我院外科1984～1996年2月手术切除ESC的标本65例，其中42例有随访资料，其中早期5例，中期8例，晚期52例。全部病例术前均未经化疗、放疗。标本由10%福尔马林固定、石蜡包埋切片，厚4 μm。
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1.2 方法 p16单克隆抗体(F165)和LSAB试剂盒均购自广州基因公司。抗体滴度均为1∶50。按LSAB法进行操作，DAB显色。经微波炉作抗原修复处理，已知阳性的组织切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断 染色信号呈棕黄色。每张切片选取10个阳性细胞密集的视野(×400倍)，按阳性细胞所占的比例进行分级：(+++)：>70%，(++)：30%～70%，(+)：<30%，(-)：没有或几乎没有阳性细胞。
1.4 病例临床分期 早期：癌组织位于粘膜下层以上，不管是否有局部淋巴结转移；中期：癌组织侵及肌层；晚期：癌组织侵及外膜和外膜外组织。
1.5 统计学分析 采用χ2检验或四格表确切概率法。
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2 结果
65例ESC组织中，有31例p16蛋白呈阳性，阳性率为47.7%；在53例癌旁组织中，有36例呈阳性，阳性率为67.9%；两组比较，差异有显著性(χ2=4.87,P<0.05)。高、中、低分化ESC中p16蛋白的阳性率分别为64.8%、45.5%和25.0%；3组病例比较差异有非常显著性(χ2=24.67,P<0.001)。在早中期和晚期ESC中p16蛋白的阳性率分别为84.6%和38.5%；两组比较，差异有显著性(χ2=8.88,P<0.01)。20例伴淋巴结转移的病例p16蛋白的阳性率为25.0%；而45例不伴淋巴结转移病例p16蛋白的阳性率为60.0%，两组比较差异有显著性(χ2=6.79,P<0.01)。在42例有随访资料的ESC病例中，1 a及以上生存期组p16蛋白阳性率为63.0%，显著高于生存期1 a以下组的26.7%(χ2=5.08,P<0.05)。
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3 讨论
p16基因是新近鉴定的肿瘤抑制基因，又称为MTS1(multiple tumor suppressor 1)，它定位于9p21，整个基因由三个外显子和2个内含子构成，126 bp外显子1和307 bp的外显子2构成了该基因的97%编码区，其编码产物p16蛋白是CDK4的抑制因子，直接参与细胞周期调节，是细胞G1期重要的负调节蛋白[1]。在体内p16蛋白与蛋白竞争结合CDK4和CDK6，并抑制其催化Rb蛋白磷酸化的活性进而阻止细胞周期进展。当p16蛋白基因因失活而表达缺失时，失去了对CDK4和CDK6的抑制作用，CDK4和CDK6与蛋白结合而被活化，促使Rb磷酸化而失活，导致细胞失控性增殖而有利于肿瘤形成[2]。在人类原发性肿瘤如横纹肌肉瘤、食管癌、胃癌、黑色素瘤、恶性间皮瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤等都有高频率纯合性缺失和突变[2～4]。
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食管癌死亡率高，在我国占肿瘤死亡的第2位。食管癌在组织学上以鳞癌为主。研究表明，ESC可被检出多种细胞和分子遗传学方面的改变，如染色体数目结构畸变、抑瘤基因的突变和丢失、瘤基因突变和扩增、DNA修复基因受抑制等[5]。郑杰等[3]通过Southern杂交、Northern杂交和免疫组化技术检测了21对食管癌和其相邻的癌旁组织，提示p16基因异常参与食管癌的发生且其功能失活是较晚的分子改变。吕有勇等[4]对胃癌组织和细胞株的研究也提示p16基因异常是胃癌癌变的晚期事件，可能与胃癌转移有关。
本文65例ESC标本中p16蛋白阳性率为47.7%；53例癌旁组织中p16蛋白阳性率为67.9%，两组比较p16蛋白表达差异有显著性(P<0.05)。提示p16基因的缺失和突变与ESC的发生有密切关系。在65例ESC组织， 37例高分化、8例中度分化和5例低分化鳞癌组织p16蛋白的阳性率分别为64.8%、45.5%和25.0%，三者比较差异有高度显著性(P<0.001)，说明p16基因表达与ESC恶性程度呈负相关，随着ESC分化程度的降低而明显下降。在52例晚期和13例早中期ESC组织中，p16蛋白阳性率分别为38.7%和84.6%，两组比较差异有显著性(P<0.01)，支持p16基因突变是ESC较晚的分子改变的观点。在45例无淋巴结转移的ESC组织中p16阳性率为60.0%，在20例伴淋巴结转移的ESC组织中p16蛋白阳性率为25.0%，两组比较有明显差异(P<0.01)。在42例有随访资料的ESC病例中，1 a及以上生存期组p16蛋白阳性率为63.0%，显著高于生存期1 a以下组的26.7%(P<0.05)。我们认为，p16蛋白表达异常和ESC生物学行为密切相关，p16蛋白低表达是该肿瘤进入晚期、淋巴结转移和预后差的表现。p16蛋白的检测可作为判断ESC生物学行为和自然病程的参考指标。
, 百拇医药
参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver FJ, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor tyopes. Science, 1994,264:436
2 高志安.横纹肌肉瘤组织中p16基因及其蛋白表达的研究.中华病理学杂志，1998，27(4)：290
3 郑 杰，侯 萍，周传农，等.CDKN2(p16 INK/MTS1)基因丢失和cyclin D1扩增在食管癌发生中的意义.中华肿瘤杂志，1996，6(18)：408
4 吕有勇，高崇峰，崔建涛，等.胃癌中MTS 1/p16基因丢失及表达异常的研究.中华肿瘤杂志，1996，3(18)：189
5 吴 文，肖 枫，王秀琴.人食管癌的细胞和分子遗传学研究.中华肿瘤杂志，1996，18(1)：73, 百拇医药
单位：张惠忠 张 华 熊利华 中山医科大学孙逸仙纪念医院 胸心外科；李海刚 沈溪明 董书坤 病理科(510120)
关键词：食管肿瘤；p16蛋白；免疫组织化学
广东医学990507 摘要：目的 研究p16蛋白与食管鳞状细胞癌(ESC)生物学行为的关系。方法 应用LSAB免疫组织化学方法检测65例ESC中p16蛋白表达的情况，探讨它与病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移和预后的关系。结果 64例ESC中p16蛋白的阳性率为47.7%，在53例癌旁鳞状上皮的阳性率为67.9%；高、中、低分化ESC中p16蛋白的阳性率分别为64.8%、45.5%和25.0%；在早中期和晚期ESC中p16蛋白阳性率分别为84.6%和38.5%；20例伴淋巴结转移的病例p16蛋白的阳性率为25.0%，而45例不伴淋巴结转移病例p16蛋白的阳性率为60.0%；生存期1 a及以上组p16蛋白阳性率为63.0%，显著高于1 a以下组的26.7%(P<0.05)。结论 p16基因的丢失或突变与ESC发生关系密切，而且p16蛋白与ESC的病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移和预后有关。p16蛋白的检测可作为ESC生物学行为和预后评价的参考指标。
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Significance of p16 protein expression in human esophageal squamous cell carcinoma
Zhang Huizhong, Li Haigang, Shen Ximing, et al.
Department of Cardiothoracic Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
Abstract Objective To investigate the expression of p16 protein in human esophageal squamous cell carcinoma(ESC) and its significance. Methods The expression of p16 protein in 65 cases of ESC was detected by immunohistochemical (S-P) method.Results The positive rate of p16 protein in ESC and squamous epithelium beside carcinoma tissue was 47.7% and 67.9% respectively. In well, mediate and low differentiated ESC, the rate was 64.85%, 45.5% and 25.0%, in early-middle and late stage was 84.6% and 38.5%, in with and without lymph node metastasis was 25.0% and 60.0%, in the group of the survival time over 1 year and below that period was 63.0% and 26.7% (P<0.05).Conclusions The deletion or mutation of p16 gene plays deep affection in the genesis and development of esophageal carcinoma, and p16 protein could be considered as a predictor of malignant potential and prognosis.
, 百拇医药
Key words Esophageal neoplasms p16 protein Immunohistochemistry
p16基因是新近鉴定的肿瘤抑制基因，又称MTS1(multiple tumor suppressor 1)。人类的95%癌细胞株有p16基因的缺失或突变[1]。为探讨p16基因与ESC病理组织学分级、临床分期、淋巴结转移和预后的关系，我们采用LSAB免疫组化方法，检测了65例ESC组织及53例癌旁组织的p16蛋白表达的情况。
1 材料与方法
1.1 材料 我院外科1984～1996年2月手术切除ESC的标本65例，其中42例有随访资料，其中早期5例，中期8例，晚期52例。全部病例术前均未经化疗、放疗。标本由10%福尔马林固定、石蜡包埋切片，厚4 μm。
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1.2 方法 p16单克隆抗体(F165)和LSAB试剂盒均购自广州基因公司。抗体滴度均为1∶50。按LSAB法进行操作，DAB显色。经微波炉作抗原修复处理，已知阳性的组织切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断 染色信号呈棕黄色。每张切片选取10个阳性细胞密集的视野(×400倍)，按阳性细胞所占的比例进行分级：(+++)：>70%，(++)：30%～70%，(+)：<30%，(-)：没有或几乎没有阳性细胞。
1.4 病例临床分期 早期：癌组织位于粘膜下层以上，不管是否有局部淋巴结转移；中期：癌组织侵及肌层；晚期：癌组织侵及外膜和外膜外组织。
1.5 统计学分析 采用χ2检验或四格表确切概率法。
, 百拇医药
2 结果
65例ESC组织中，有31例p16蛋白呈阳性，阳性率为47.7%；在53例癌旁组织中，有36例呈阳性，阳性率为67.9%；两组比较，差异有显著性(χ2=4.87,P<0.05)。高、中、低分化ESC中p16蛋白的阳性率分别为64.8%、45.5%和25.0%；3组病例比较差异有非常显著性(χ2=24.67,P<0.001)。在早中期和晚期ESC中p16蛋白的阳性率分别为84.6%和38.5%；两组比较，差异有显著性(χ2=8.88,P<0.01)。20例伴淋巴结转移的病例p16蛋白的阳性率为25.0%；而45例不伴淋巴结转移病例p16蛋白的阳性率为60.0%，两组比较差异有显著性(χ2=6.79,P<0.01)。在42例有随访资料的ESC病例中，1 a及以上生存期组p16蛋白阳性率为63.0%，显著高于生存期1 a以下组的26.7%(χ2=5.08,P<0.05)。
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3 讨论
p16基因是新近鉴定的肿瘤抑制基因，又称为MTS1(multiple tumor suppressor 1)，它定位于9p21，整个基因由三个外显子和2个内含子构成，126 bp外显子1和307 bp的外显子2构成了该基因的97%编码区，其编码产物p16蛋白是CDK4的抑制因子，直接参与细胞周期调节，是细胞G1期重要的负调节蛋白[1]。在体内p16蛋白与蛋白竞争结合CDK4和CDK6，并抑制其催化Rb蛋白磷酸化的活性进而阻止细胞周期进展。当p16蛋白基因因失活而表达缺失时，失去了对CDK4和CDK6的抑制作用，CDK4和CDK6与蛋白结合而被活化，促使Rb磷酸化而失活，导致细胞失控性增殖而有利于肿瘤形成[2]。在人类原发性肿瘤如横纹肌肉瘤、食管癌、胃癌、黑色素瘤、恶性间皮瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤等都有高频率纯合性缺失和突变[2～4]。
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食管癌死亡率高，在我国占肿瘤死亡的第2位。食管癌在组织学上以鳞癌为主。研究表明，ESC可被检出多种细胞和分子遗传学方面的改变，如染色体数目结构畸变、抑瘤基因的突变和丢失、瘤基因突变和扩增、DNA修复基因受抑制等[5]。郑杰等[3]通过Southern杂交、Northern杂交和免疫组化技术检测了21对食管癌和其相邻的癌旁组织，提示p16基因异常参与食管癌的发生且其功能失活是较晚的分子改变。吕有勇等[4]对胃癌组织和细胞株的研究也提示p16基因异常是胃癌癌变的晚期事件，可能与胃癌转移有关。
本文65例ESC标本中p16蛋白阳性率为47.7%；53例癌旁组织中p16蛋白阳性率为67.9%，两组比较p16蛋白表达差异有显著性(P<0.05)。提示p16基因的缺失和突变与ESC的发生有密切关系。在65例ESC组织， 37例高分化、8例中度分化和5例低分化鳞癌组织p16蛋白的阳性率分别为64.8%、45.5%和25.0%，三者比较差异有高度显著性(P<0.001)，说明p16基因表达与ESC恶性程度呈负相关，随着ESC分化程度的降低而明显下降。在52例晚期和13例早中期ESC组织中，p16蛋白阳性率分别为38.7%和84.6%，两组比较差异有显著性(P<0.01)，支持p16基因突变是ESC较晚的分子改变的观点。在45例无淋巴结转移的ESC组织中p16阳性率为60.0%，在20例伴淋巴结转移的ESC组织中p16蛋白阳性率为25.0%，两组比较有明显差异(P<0.01)。在42例有随访资料的ESC病例中，1 a及以上生存期组p16蛋白阳性率为63.0%，显著高于生存期1 a以下组的26.7%(P<0.05)。我们认为，p16蛋白表达异常和ESC生物学行为密切相关，p16蛋白低表达是该肿瘤进入晚期、淋巴结转移和预后差的表现。p16蛋白的检测可作为判断ESC生物学行为和自然病程的参考指标。
, 百拇医药
参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver FJ, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor tyopes. Science, 1994,264:436
2 高志安.横纹肌肉瘤组织中p16基因及其蛋白表达的研究.中华病理学杂志，1998，27(4)：290
3 郑 杰，侯 萍，周传农，等.CDKN2(p16 INK/MTS1)基因丢失和cyclin D1扩增在食管癌发生中的意义.中华肿瘤杂志，1996，6(18)：408
4 吕有勇，高崇峰，崔建涛，等.胃癌中MTS 1/p16基因丢失及表达异常的研究.中华肿瘤杂志，1996，3(18)：189
5 吴 文，肖 枫，王秀琴.人食管癌的细胞和分子遗传学研究.中华肿瘤杂志，1996，18(1)：73, 百拇医药