RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞集落bcr/abl mRNA的表达
作者：罗志勇 陈汉春 罗赛群 汤立军 王吉伟 黄艳红 谭孟群
单位：罗志勇 陈汉春② 罗赛群 汤立军 王吉伟 分子生物学研究中心 长沙410078；黄艳红 谭孟群 血液生理研究室 长沙 410078
关键词：慢性粒细胞白血病；骨髓；细胞集落；bcr/abl融合mRNA*；RT-PCR
湖南医科大学学报990505 提要 采用RT-PCR技术对CML患者骨髓细胞14d的细胞集落群和部分14d或28d的单个细胞集落bcr/abl mRNA表达进行分析。结果显示：所检测的骨髓细胞集落bcr/abl基因的表达均呈阳性，即为CML集落，与细胞遗传学分析结果一致。该方法为研究CML造血前体细胞基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段；并可作为研究CML发病、治疗及筛选抗CML药物较为理想的方法。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R733.72
Detection of bcr/abl gene expression on bone marrow cell colonies
in chronic myelogenous leukemia by reverse transcriptase-
polymerase chain reaction
Luo Zhiyong Chen Hanchun Luo Saiqun Tang Lijun Wang Jiwei
(Research Center of Molecular Biology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
, 百拇医药
The t(9;22) (q34;q11) between abl and bcr genes plays a pivotal role in the diagnosis and pathogenesis of chronic myelogenous leukemia(CML). To explore the bcr/abl fusion mRNA expression on hematopoietic precursors, reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) was applied to detect bcr/abl mRNA expression on bone marrow cell colonies. Meanwhile, bcr/abl mRNA expressions on 14- or 28-day colonies using HPP-CFC and CFU-GM semisolid agar culture assay were also determined in 4 cases of confirmed Ph-positive CML by karyotyping analysis. The results showed that the bcr/abl mRNA expressions on 14-day colonies and some 14- or 28-day colonies detected singly were positive at presentation by RT-PCR, in agreement with results by karyotype analysis. Thus, a sensitive and powerful technique was offered for studying gene expression on hematopoietic precursors, diagnosis and therapeutic monitoring of CML. Furthermore, this can be used as an ideal method for revealing molecular mechanisms of pathogenesis of CML and screening anti-CML drugs.
, 百拇医药
Key words chronic myelogenous leukemia; bone marrow cell colonies; bcr/abl fusion mRNA*; RT-PCR
慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增生性血液病。该病的细胞遗传学特点是存在特异的Ph染色体，即t(9;22)。该易位使正常位于9q34上的c-abl基因与22q11上的bcr基因发生融合，形成bcr/abl融合基因并表达具有高酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性的BCR/ABL融合蛋白质(p210蛋白质)。为探讨CML患者骨髓细胞集落bcr/abl基因的表达情况，采用体外培养粒-巨噬系祖细胞(granulocyte and macrophage-colony forming, CFU-GM)和高增殖潜能集落形成细胞(high proliferation potential-colony forming cell, HPP-CFC)的方法培养生成细胞集落，并检测所形成的细胞集落的bcr/abl mRNA表达，以鉴别是正常造血集落或是白血病细胞集落，这一方法对进一步探讨CML分子病理学及其治疗机制有重要意义。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象和标本来源
4例CML患者为本校附属湘雅医院血液科门诊初诊病人，男、女各2例，年龄36～49岁，均系Ph染色体阳性。各取骨髓2～3ml，肝素抗凝，经淋巴细胞分离液分离(Ficoll，相对密度1.077)，2500r.min-1，离心30min，取界面单个核细胞，PBS洗2次，用IMDM培养液稀释至适当浓度。
1.2 方法
1.2.1 细胞遗传学分析 骨髓单个核细胞培养、染色体制备及显带按文献[1]步骤进行。
1.2.2 CFU-GM和HPP-CFC培养 CFU-GM培养按文献[2]稍加改良。CFU-GM培养体系内含2×105.ml-1单个核细胞，10%人AB血清，20%马血清，10ng.ml-1 GM-CSF，0.3%琼脂，补充适量的IMDM培养液。HPP-CFC培养按文献[3]稍加改良。HPP-CFC培养体系内含105.ml-1单个核细胞，10%人AB血清，20%马血清，50ng.ml-1 SCF，60ng.ml-1 GM-CSF,25ng.ml-1 IL-3，0.3%琼脂，适量IMDM培养液；混匀，吸取1ml种于35mm玻璃培养皿内，每组3皿，室温放置10min，移入37℃，5% CO2饱和湿度孵箱培养28d，直径>0.5mm，细胞数超过50000为一个HPP-CFC集落。
, 百拇医药
1.2.3 CML患者骨髓14d或28d的细胞集落总RNA的提取 (1)14d细胞集落群总RNA提取：取1ml TRIzol试剂(Life Technologies)加至已生长集落的平皿中；(2)14d或28d的单个细胞集落总RNA分离：用微量移液器在倒置显微镜下吸出单个集落至1.5ml Eppendorf管中，同时加入105个不表达bcr/abl mRNA的HL-60细胞，分别加入1ml TRIzol。总RNA分离步骤详见TRIzol总RNA分离试剂盒说明书。
1.2.4 引物设计 bcr有义引物：5′-ATTCGCTGACCATCAATAAG-3′；abl反义引物：5′-GGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3′，产生397bp片段。β-actin有义引物1：5′-TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA-3′；β-actin反义引物2：5′-TTGATCTTCATGGTG(AGC)TAGGAGCGAGGGCA-3′，产生260bp片段。
, 百拇医药
1.2.5 RT-PCR (1)逆转录反应：取0.5μg总RNA，加入oligo(dT)15 0.5μg, 65℃加热5min后，冰浴5min，再加AMV 5×RT缓冲液4μl，RNasin 20U，4种dNTP(各含10mmol.L-1)混合液1μl，AMV逆转录酶(RT)10U，总体积20μl。42℃反应60min，95℃ 5min，置-20℃备用。(2)PCR：50μl反应体系内含1.5mmol.L-1 MgCl2, 200μmol.L-1 dNTPs, 10pmol bcr/abl基因引物或10pmol β-actin基因引物，Taq DNA聚合酶2.5U，5μl cDNA模板，反应管面覆盖等体积的矿物油。94℃变性5min，94℃ 30s,54℃ 40s,72℃ 1min,循环3次，72℃延伸5min。实验过程中严格设立内(β-actin作内参)、外对照(包括K562细胞系阳性及HL-60细胞系阴性对照)。(3)PCR产物的分析：取PCR产物10μl，2.5%琼脂糖凝胶电泳，0.5μg.ml-1溴化乙锭染色，以ΦX174/HaeⅢ DNA为分子量标准，紫外灯下摄影。
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2 结 果
4例初诊的CML经细胞遗传学分析，确认均为Ph染色体阳性CML患者(图1)，应用RT-PCR技术对Ph阳性CML患者骨髓细胞14d集落群和部分14d或28d单个集落bcr/abl mRNA表达进行分析，结果显示，bcr/abl mRNA表达均呈阳性(图2)，即为CML集落，与细胞遗传学方法分析结果一致。
图1 CML患者骨髓单个核细胞Ph阳性染色体分析
Fig. 1 Karyotypic analysis of interphase bone marrow cells in CML
图2 RT-PCR检测CML细胞集落中bcr/abl mRNA表达结果
, 百拇医药
1.HL-60细胞系阴性对照 2.K562细胞系阳性对照 3.14d单个细胞集落 4.28d单个细胞集落 5.14d细胞集落群 6.ΦX174/HaeⅢ DNA分子量标准
Fig. 2 The results of the fusion bcr/abl mRNA expression on colonies in CML by RT-PCR lane 1: HL-60 cell line negative control lane 2: K562 cell line positive control lane 3、4、5: single 14-day colony, single 28-day colony and 14-day colonies, respectively lane 6: ΦX174 DNA/HaeⅢ marker
3 讨 论
Ph染色体t(9;22)(q34;q11)是CML的细胞遗传学标志，该易位形成的bcr/abl融合基因对CML的分子诊断及其发病机制方面起着关键性的作用[4]。目前，用细胞遗传学方法找到Ph染色体和采用Southern印迹分析检测嵌合bcr/abl融合基因仍然是诊断CML的“金标准”[5]。勿庸置疑，传统的核型分析在确认CML初诊结果、治疗监测及揭示其它细胞遗传学异常仍将发挥重要作用。但是核型和Southern印迹分析却受到检测速度较慢、灵敏度较低等因素限制，不再是CML融合基因检测的最佳途径。有文献报道[6]，经细胞遗传学检查和Southern印迹诊断为Ph阴性的白血病，用RT-PCR方法进一步确诊的结果是阳性。随着检测特异染色体易位在白血病的诊断和治疗中的作用日益增强，因而寻找一种灵敏度高、特异性强及经济简便的诊断技术将成为未来必然的选择。RT-PCR和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是符合以上技术要求，能够取代核型和Southern印迹分析且富有活力的分子诊断技术[7，8]。本研究结果显示，应用RT-PCR检测CML 14d或28d单个的骨髓细胞集落bcr/abl mRNA表达是可行的，而核型和Southern印迹分析却难于做到。此外，该方法亦可对存在于骨髓中Ph阴性造血祖细胞进行分析。因此，RT-PCR检测bcr/abl融合基因不仅克服了细胞遗传学和Southern印迹分析许多不足，并具有快速、灵敏度高、特异性好的优点，而且可对Ph染色体不明显的易位进行鉴别[9，10]。Tbakhi[7]和Cox[8]通过对FISH和RT-PCR比较研究后，认为FISH将是bcr/abl最适检测方法，但由于受该技术自动化和计算机化所带来的设备条件的限制，直到目前仍难以将其作为一种鉴定bcr/abl易位的常规诊断方法。本研究通过采用RT-PCR技术检测用体外培养CFU-GM、HPP-CFC方法生成的细胞集落bcr/abl mRNA的表达，可以鉴别正常造血集落与白血病细胞集落的生成情况，并可从分子水平研究CML发病、治疗机制及筛选抗CML药物。此法亦为检测CML患者基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段。
, http://www.100md.com
致谢：衷心感谢血液生理研究室王绮如教授热情指导和湘雅医院血液科谭柏林主治医师和陈方平教授提供慢性粒细胞白血病标本，并给予大力支持和帮助
参考文献
1 Rooney DE, Czepulolkowski BH. Human cytogentics: A practical approach. Oxford, England: IRL Press, 1992:160～161
2 罗志勇，谭孟群，王绮如，等.补益中药复方对环磷酰胺处理小鼠粒系造血的影响.中草药，1998，29(3)：181～184
3 By LK, Meniece FM, Stewart DM, et al. Detection of a human CFC with a high proliferation potential. Blood, 1989,74:609～612
, http://www.100md.com
4 Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature, 1973,243:290～291
5 Ayscue LH, Ross DW, Ozer H, et al. Bcr/abl recombinant DNA analysis versus karyotype in the diagnosis and therapeutic monitoring of chronic myelogenous leukemia. Am J Clin Pathol, 1990,94:404～409
6 Morris C, Kennedy M, Heisterkamp N, et al. A complex chromosome rearrangement forms the BCR-ABL fusion gene in leukemic cells with a normal karyotype. Genes Chromosomes Cancer, 1991,3:263～271
, 百拇医药
7 Tbakhi A, Pettay J, Sreenan JJ, et al. Comparative analysis of interphase FISH and RT-PCR to detect bcr/abl chimeric translocation in chronic myelogenous leukemia and related disorders. Am J Clin Pathol, 1997,108:16～23
8 Cox MC, Maffei L, Buffolino S, et al. A comparative analysis of FISH, RT-PCR and cytogenetics for the diagnosis of bcr-abl-positive leukemia. Am J Clin Pathol, 1998,109(1):24～31
9 Melo JV, Gordon DE, Cross NCP, et al. The BCR-ABL fusion gene is expressed in chronic myeloid leukemia. Blood, 1993,81:158～165
10 Wells SJ, Phillips CN, Winto EF, et al. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction for bcr/abl fusion in chronic myelogenous leukemia. Am J Clin Pathol, 1996,105(6):756～759, 百拇医药
单位：罗志勇 陈汉春② 罗赛群 汤立军 王吉伟 分子生物学研究中心 长沙410078；黄艳红 谭孟群 血液生理研究室 长沙 410078
关键词：慢性粒细胞白血病；骨髓；细胞集落；bcr/abl融合mRNA*；RT-PCR
湖南医科大学学报990505 提要 采用RT-PCR技术对CML患者骨髓细胞14d的细胞集落群和部分14d或28d的单个细胞集落bcr/abl mRNA表达进行分析。结果显示：所检测的骨髓细胞集落bcr/abl基因的表达均呈阳性，即为CML集落，与细胞遗传学分析结果一致。该方法为研究CML造血前体细胞基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段；并可作为研究CML发病、治疗及筛选抗CML药物较为理想的方法。
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中国图书分类号 R733.72
Detection of bcr/abl gene expression on bone marrow cell colonies
in chronic myelogenous leukemia by reverse transcriptase-
polymerase chain reaction
Luo Zhiyong Chen Hanchun Luo Saiqun Tang Lijun Wang Jiwei
(Research Center of Molecular Biology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
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The t(9;22) (q34;q11) between abl and bcr genes plays a pivotal role in the diagnosis and pathogenesis of chronic myelogenous leukemia(CML). To explore the bcr/abl fusion mRNA expression on hematopoietic precursors, reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) was applied to detect bcr/abl mRNA expression on bone marrow cell colonies. Meanwhile, bcr/abl mRNA expressions on 14- or 28-day colonies using HPP-CFC and CFU-GM semisolid agar culture assay were also determined in 4 cases of confirmed Ph-positive CML by karyotyping analysis. The results showed that the bcr/abl mRNA expressions on 14-day colonies and some 14- or 28-day colonies detected singly were positive at presentation by RT-PCR, in agreement with results by karyotype analysis. Thus, a sensitive and powerful technique was offered for studying gene expression on hematopoietic precursors, diagnosis and therapeutic monitoring of CML. Furthermore, this can be used as an ideal method for revealing molecular mechanisms of pathogenesis of CML and screening anti-CML drugs.
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Key words chronic myelogenous leukemia; bone marrow cell colonies; bcr/abl fusion mRNA*; RT-PCR
慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增生性血液病。该病的细胞遗传学特点是存在特异的Ph染色体，即t(9;22)。该易位使正常位于9q34上的c-abl基因与22q11上的bcr基因发生融合，形成bcr/abl融合基因并表达具有高酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性的BCR/ABL融合蛋白质(p210蛋白质)。为探讨CML患者骨髓细胞集落bcr/abl基因的表达情况，采用体外培养粒-巨噬系祖细胞(granulocyte and macrophage-colony forming, CFU-GM)和高增殖潜能集落形成细胞(high proliferation potential-colony forming cell, HPP-CFC)的方法培养生成细胞集落，并检测所形成的细胞集落的bcr/abl mRNA表达，以鉴别是正常造血集落或是白血病细胞集落，这一方法对进一步探讨CML分子病理学及其治疗机制有重要意义。
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1 对象和方法
1.1 对象和标本来源
4例CML患者为本校附属湘雅医院血液科门诊初诊病人，男、女各2例，年龄36～49岁，均系Ph染色体阳性。各取骨髓2～3ml，肝素抗凝，经淋巴细胞分离液分离(Ficoll，相对密度1.077)，2500r.min-1，离心30min，取界面单个核细胞，PBS洗2次，用IMDM培养液稀释至适当浓度。
1.2 方法
1.2.1 细胞遗传学分析 骨髓单个核细胞培养、染色体制备及显带按文献[1]步骤进行。
1.2.2 CFU-GM和HPP-CFC培养 CFU-GM培养按文献[2]稍加改良。CFU-GM培养体系内含2×105.ml-1单个核细胞，10%人AB血清，20%马血清，10ng.ml-1 GM-CSF，0.3%琼脂，补充适量的IMDM培养液。HPP-CFC培养按文献[3]稍加改良。HPP-CFC培养体系内含105.ml-1单个核细胞，10%人AB血清，20%马血清，50ng.ml-1 SCF，60ng.ml-1 GM-CSF,25ng.ml-1 IL-3，0.3%琼脂，适量IMDM培养液；混匀，吸取1ml种于35mm玻璃培养皿内，每组3皿，室温放置10min，移入37℃，5% CO2饱和湿度孵箱培养28d，直径>0.5mm，细胞数超过50000为一个HPP-CFC集落。
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1.2.3 CML患者骨髓14d或28d的细胞集落总RNA的提取 (1)14d细胞集落群总RNA提取：取1ml TRIzol试剂(Life Technologies)加至已生长集落的平皿中；(2)14d或28d的单个细胞集落总RNA分离：用微量移液器在倒置显微镜下吸出单个集落至1.5ml Eppendorf管中，同时加入105个不表达bcr/abl mRNA的HL-60细胞，分别加入1ml TRIzol。总RNA分离步骤详见TRIzol总RNA分离试剂盒说明书。
1.2.4 引物设计 bcr有义引物：5′-ATTCGCTGACCATCAATAAG-3′；abl反义引物：5′-GGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3′，产生397bp片段。β-actin有义引物1：5′-TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA-3′；β-actin反义引物2：5′-TTGATCTTCATGGTG(AGC)TAGGAGCGAGGGCA-3′，产生260bp片段。
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1.2.5 RT-PCR (1)逆转录反应：取0.5μg总RNA，加入oligo(dT)15 0.5μg, 65℃加热5min后，冰浴5min，再加AMV 5×RT缓冲液4μl，RNasin 20U，4种dNTP(各含10mmol.L-1)混合液1μl，AMV逆转录酶(RT)10U，总体积20μl。42℃反应60min，95℃ 5min，置-20℃备用。(2)PCR：50μl反应体系内含1.5mmol.L-1 MgCl2, 200μmol.L-1 dNTPs, 10pmol bcr/abl基因引物或10pmol β-actin基因引物，Taq DNA聚合酶2.5U，5μl cDNA模板，反应管面覆盖等体积的矿物油。94℃变性5min，94℃ 30s,54℃ 40s,72℃ 1min,循环3次，72℃延伸5min。实验过程中严格设立内(β-actin作内参)、外对照(包括K562细胞系阳性及HL-60细胞系阴性对照)。(3)PCR产物的分析：取PCR产物10μl，2.5%琼脂糖凝胶电泳，0.5μg.ml-1溴化乙锭染色，以ΦX174/HaeⅢ DNA为分子量标准，紫外灯下摄影。
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2 结 果
4例初诊的CML经细胞遗传学分析，确认均为Ph染色体阳性CML患者(图1)，应用RT-PCR技术对Ph阳性CML患者骨髓细胞14d集落群和部分14d或28d单个集落bcr/abl mRNA表达进行分析，结果显示，bcr/abl mRNA表达均呈阳性(图2)，即为CML集落，与细胞遗传学方法分析结果一致。
图1 CML患者骨髓单个核细胞Ph阳性染色体分析
Fig. 1 Karyotypic analysis of interphase bone marrow cells in CML
图2 RT-PCR检测CML细胞集落中bcr/abl mRNA表达结果
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1.HL-60细胞系阴性对照 2.K562细胞系阳性对照 3.14d单个细胞集落 4.28d单个细胞集落 5.14d细胞集落群 6.ΦX174/HaeⅢ DNA分子量标准
Fig. 2 The results of the fusion bcr/abl mRNA expression on colonies in CML by RT-PCR lane 1: HL-60 cell line negative control lane 2: K562 cell line positive control lane 3、4、5: single 14-day colony, single 28-day colony and 14-day colonies, respectively lane 6: ΦX174 DNA/HaeⅢ marker
3 讨 论
Ph染色体t(9;22)(q34;q11)是CML的细胞遗传学标志，该易位形成的bcr/abl融合基因对CML的分子诊断及其发病机制方面起着关键性的作用[4]。目前，用细胞遗传学方法找到Ph染色体和采用Southern印迹分析检测嵌合bcr/abl融合基因仍然是诊断CML的“金标准”[5]。勿庸置疑，传统的核型分析在确认CML初诊结果、治疗监测及揭示其它细胞遗传学异常仍将发挥重要作用。但是核型和Southern印迹分析却受到检测速度较慢、灵敏度较低等因素限制，不再是CML融合基因检测的最佳途径。有文献报道[6]，经细胞遗传学检查和Southern印迹诊断为Ph阴性的白血病，用RT-PCR方法进一步确诊的结果是阳性。随着检测特异染色体易位在白血病的诊断和治疗中的作用日益增强，因而寻找一种灵敏度高、特异性强及经济简便的诊断技术将成为未来必然的选择。RT-PCR和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是符合以上技术要求，能够取代核型和Southern印迹分析且富有活力的分子诊断技术[7，8]。本研究结果显示，应用RT-PCR检测CML 14d或28d单个的骨髓细胞集落bcr/abl mRNA表达是可行的，而核型和Southern印迹分析却难于做到。此外，该方法亦可对存在于骨髓中Ph阴性造血祖细胞进行分析。因此，RT-PCR检测bcr/abl融合基因不仅克服了细胞遗传学和Southern印迹分析许多不足，并具有快速、灵敏度高、特异性好的优点，而且可对Ph染色体不明显的易位进行鉴别[9，10]。Tbakhi[7]和Cox[8]通过对FISH和RT-PCR比较研究后，认为FISH将是bcr/abl最适检测方法，但由于受该技术自动化和计算机化所带来的设备条件的限制，直到目前仍难以将其作为一种鉴定bcr/abl易位的常规诊断方法。本研究通过采用RT-PCR技术检测用体外培养CFU-GM、HPP-CFC方法生成的细胞集落bcr/abl mRNA的表达，可以鉴别正常造血集落与白血病细胞集落的生成情况，并可从分子水平研究CML发病、治疗机制及筛选抗CML药物。此法亦为检测CML患者基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段。
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致谢：衷心感谢血液生理研究室王绮如教授热情指导和湘雅医院血液科谭柏林主治医师和陈方平教授提供慢性粒细胞白血病标本，并给予大力支持和帮助
参考文献
1 Rooney DE, Czepulolkowski BH. Human cytogentics: A practical approach. Oxford, England: IRL Press, 1992:160～161
2 罗志勇，谭孟群，王绮如，等.补益中药复方对环磷酰胺处理小鼠粒系造血的影响.中草药，1998，29(3)：181～184
3 By LK, Meniece FM, Stewart DM, et al. Detection of a human CFC with a high proliferation potential. Blood, 1989,74:609～612
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4 Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature, 1973,243:290～291
5 Ayscue LH, Ross DW, Ozer H, et al. Bcr/abl recombinant DNA analysis versus karyotype in the diagnosis and therapeutic monitoring of chronic myelogenous leukemia. Am J Clin Pathol, 1990,94:404～409
6 Morris C, Kennedy M, Heisterkamp N, et al. A complex chromosome rearrangement forms the BCR-ABL fusion gene in leukemic cells with a normal karyotype. Genes Chromosomes Cancer, 1991,3:263～271
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7 Tbakhi A, Pettay J, Sreenan JJ, et al. Comparative analysis of interphase FISH and RT-PCR to detect bcr/abl chimeric translocation in chronic myelogenous leukemia and related disorders. Am J Clin Pathol, 1997,108:16～23
8 Cox MC, Maffei L, Buffolino S, et al. A comparative analysis of FISH, RT-PCR and cytogenetics for the diagnosis of bcr-abl-positive leukemia. Am J Clin Pathol, 1998,109(1):24～31
9 Melo JV, Gordon DE, Cross NCP, et al. The BCR-ABL fusion gene is expressed in chronic myeloid leukemia. Blood, 1993,81:158～165
10 Wells SJ, Phillips CN, Winto EF, et al. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction for bcr/abl fusion in chronic myelogenous leukemia. Am J Clin Pathol, 1996,105(6):756～759, 百拇医药