核酸扩增技术在微生物检验上的评价
作者：刘恭植 潘志超
单位：镇江医学院
关键词：
临床检验杂志990501 核酸扩增技术是1985年Saiki等创建。本来DNA的复制均在细胞内，Mullis等通过多聚酶催化的链式反应(polymerase-catalyzed chain reaction,PCR)使DNA在体外扩增成为可能。但是由于多聚酶不耐热，每一个循环反应必须添加多聚酶，手续繁复，因此在微生物检验中无实用价值。直至1989年发现了耐热多聚酶，使方法简化，且该法在样品中能测出极微量的微生物特异DNA或RNA，受到了国内外检验微生物学家的重视。
大多数学者认为扩增技术应用在微生物检验上应受到一定限制，因为假阳性或假阴性结果较高；不能定量；不适合细菌的药敏试验；从样品中很难进行常规测定一般病原菌等。在优点方面，该技术能在样品中快速直接检出一些病原微生物，如病毒，慢生长的细菌或不易培养的细菌，真菌及原虫等。另外该技术可以从非特异性细菌污染中，筛选或确定正常无菌的标本。还可以用DNA指纹方法来鉴定细菌或作细菌分型。
, http://www.100md.com
究竟该技术在诊断微生物学(diagnostic microbiology)上的评价如何，尚无正式的肯定，为此作一简单的综述，供同道们参考。
1 在微生物检验应用上的限制性
核酸扩增技术有一些技术上的问题，不适于检测微生物，例如细菌的DNA很长，首先要研究出每一种细菌的一段特异性基因，才能制备特异性引物；在微生物的感染中，往往不是一种微生物，常有重叠感染，因此在扩增时，可能发生错误，交叉或灵敏度不高等。在实验过程中确证有较多的假阳性(false-positive)。也有报道假阴性(false-negative)。因而限制了在微生物检验上的应用。
1.1 假阳性反应 这是最重要的问题。Noordhock等在七个实验室进行结核分枝杆菌的扩增试验研究及比较中发现不少假阳性结果，分析原因可能为扩增技术高度的灵敏，有少量的污染即可为阳性。污染的主要原因，在以前进行扩增的病人标本污染了器材及环境，虽然目前均用一次性的器材，有时也很难避免。为此目前国际上在处理标本及提取DNA时改用自动核酸提取技术如Gene pure 341应用的生物系统，可能好一些；另外也有人应用尿嘧啶-N-糖苷酶(uracil-N-glycosylase,UNG)来预防污染，但仍然有假阳性出现。例如病人经抗结核化疗后，结核分枝杆菌已死亡，仍然可呈阳性反应。虽然也有人证明，病人经化疗后，PCR的阳性率明显下降，但也不易完全转阴。
, 百拇医药
结核分枝杆菌以RNA作为靶子时，往往不适用扩增技术，因RNA酶在环境中存在很广泛，造成假阴性，因此需用没有RNA酶的器材。最后扩增技术的低特异性也是造成假阴性的原因。因此，特异性扩增常需要用内在引物(internal primers)作为第二次扩增或用特异性探针进行分子杂交(hybridization)。现代商业提供检测系统已包括足够的特异性对照材料。
1.2 假阴性结果 主要由于内在较低的敏感性。虽然现在使用再扩增方法，如巢式PCR(nested PCR)应用在检测结核分枝杆菌，以ISOLLO作为靶DNA或采用分子杂交技术，但仍然很难克服。
另外造成假阴性的原因是，在标本中存在多聚酶的抑制物。因此进行该试验时，应采用阳性对照或较纯的提取DNA，但这些步骤很繁复又可能造成污染；扩增试验最大的量是10 μl～50 μl，而培养标本的量为0.5 ml～10 ml,这也是造成假阴性的原因，尤其是血液标本或某些食品标本，其阳性率反而比培养低，如应用半自动血培养，可以在10 ml血液中培养出几个细菌，诊断败血症很有意义。假使用浓缩DNA的方法，往往同时浓缩了血标本中白细胞的DNA可以抑制扩增试验，现在有人在研究免疫磁性方法(immunomagnetic procedures)检测Listeria monocytogenes(单核细胞李司特菌)有一定的效果，但尚需进一步研究。
, 百拇医药
除了上述的一些情况外，往往扩增技术在临床使用时，低于研究的报告。细菌细胞倾向发生集团，也是造成假阴性的原因。
1.3 定量问题 扩增技术定量很困难。定量是诊断感染上很重要的工作，有很多感染不是少数病原菌引起，只有达到一定的量，才有诊断价值。虽然目前商业上已提供5′-核酸酶测定(Тaqman TMLS-5OB PCR detection system;ABI Prism 7700 sequence detection system;Applied Bio systems)或许可以解决这个问题，可是价格昂贵，且不够快速。
总之核酸扩增技术在微生物学诊断上受到一定的限制，其基本问题是种、型特异性引物的获得和无法进行药敏试验。
2 在微生物检验应用上的可能性
2.1 从标本中快速检测较难培养或不能培养的病原微生物的DNA，如某些病毒(Virus),衣原体(Clamydia),疏螺旋体(Borrelia),支原体(Mycoplasma)以及困难培养的分枝杆菌等，仍具有现实意义。
, 百拇医药
2.2 若采用微生物群的共同引物(universal primer)可以检测某群的微生物帮助诊断，例如某些真菌群的检测，可以设计共同的引物，再在无菌的标本中作为筛选的应用。
2.3 在分离培养的基础上进行鉴定 分型及致病性(毒素)的测定，了解微生物的致病性及流行病学上的意义，仍然是良好的方法。
2.4 药敏试验上的应用 目前临床药敏试验仍是以K-B法为主。K-B法是检测已知病原菌对药物敏感的表型，往往在使用一次抗菌素后就诱导产生耐药，与临床治疗效果不符，造成临床与检验的分歧。自从分子生物技术应用，抗耐药测定就可能解决这个问题，目前已深入研究了耐药基因，直接检测该耐药基因就不会发生这种误解。例如1997年Towner研究不动杆菌对Carbapenem一类药物的耐药基因为aac(6′)-I基因，可用AL(5′-ATGAATATTAAACCTGCAT-3′)与AR(5′-TTAATCTATTTTTTTA-3′)作为引物，直接检测该耐药基因作为诊断。
, 百拇医药
3 结论
以上叙述了核酸扩增技术在微生物学诊断上的限制性和可能性，可以部分了解该技术的优缺点及使用时应注意的方面，但究竟如何对待该技术呢?作者认为有下列三点供参考。
3.1 核酸扩增技术是20世纪末的先进技术，应该广泛使用及深入研究，在使用及研究中排除其缺点及局限性，发扬其优势，精益求精，相信它在21世纪微生物检验中是一个重要的技术。我国对该技术研究很不够，虽然文章很多，但是很少涉及本质的研究，且对比及对照很少，值得改进。
3.2 在开展这项新技术时，不能不管条件如何一哄而起，而且有排除或代替常规微生物检验方法之势，这是不合适的。常规检验方法中如涂片染色镜检，分离培养及生化、血清鉴定，抗原测定以及动物试验等仍然有它们的优势，是目前重要的，不可缺少的微生物检验方法，绝对不能用核酸扩增技术来代替一切，这些老方法仍要不断深入研究及改进。
, 百拇医药
3.3 目前国际上认为可以用该技术直接从临床标本中测定或作为核实培养的微生物，以及鉴定分型的微生物见表1。
表1 可直接用PCR测定的临床微生物种类 培养核实及鉴定的微生物
可以直接测定的微生物
Mycobacterium tuberculosis complex
(结核分枝杆菌复合物)
Mycobacterium tuberculosis
(结核分枝杆菌)
Mycobacterium avium
(鸟型分枝杆菌)
, 百拇医药
Neisseria gonorrhoeae
(淋病奈瑟菌)
Mycobacterium avium complex
(鸟型分枝杆菌复合物)
Chlamydia trachomatis
(沙眼衣原体)
Mycobacterium gordonae
(戈氏分枝杆菌)
Legionella pneumophila
(嗜肺军团杆菌)
, 百拇医药
Neissena gonorrhoeae
(淋病奈瑟菌)
Mycoplasma pneumoniae
(人肺炎支原体)
Chlamydia trachomatis
(沙眼衣原体)
Bordetella pertussis
(百日咳杆菌)
Hemophilus influenzae
(流行性感冒杆菌)
, http://www.100md.com Entero viruses
(肠道病毒)
Listeria monocytogenes
(单核细胞李司特菌)
Human papilloma virus
(人类乳头瘤病毒)
Campylobacter species
(弯曲菌种)
Histoplasma capsulatum
(荚膜组织胞浆菌)
Coccidioides immitis
, http://www.100md.com
(厌酷球孢子菌)
Blastomyces dermatitidis
(皮炎芽生菌)
Human papilloma virus
(人类乳头瘤病毒)
参考文献
1 Melnick J,Adelberg S.Medical Microbiology.21 ed.Appleton & Lange Company:1998
2 Choutte M V,Van Eldere J.The possibilities and limitations of nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology.J Med Microbiology,1997,46:188—193
, 百拇医药
3 Saiki R K,et al.Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site anaylisis for diagnosis of sickle cell anemia.Science,1985,230:1350—1354
4 Mullis K B，et al.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymal,1987,155:335—350
5 Towner K J.Clinical importance and antibiotic resistance of Acinetobacter Spp.J Med Microbiology,1997,46;721—746
(1999-06-25收稿), 百拇医药
单位：镇江医学院
关键词：
临床检验杂志990501 核酸扩增技术是1985年Saiki等创建。本来DNA的复制均在细胞内，Mullis等通过多聚酶催化的链式反应(polymerase-catalyzed chain reaction,PCR)使DNA在体外扩增成为可能。但是由于多聚酶不耐热，每一个循环反应必须添加多聚酶，手续繁复，因此在微生物检验中无实用价值。直至1989年发现了耐热多聚酶，使方法简化，且该法在样品中能测出极微量的微生物特异DNA或RNA，受到了国内外检验微生物学家的重视。
大多数学者认为扩增技术应用在微生物检验上应受到一定限制，因为假阳性或假阴性结果较高；不能定量；不适合细菌的药敏试验；从样品中很难进行常规测定一般病原菌等。在优点方面，该技术能在样品中快速直接检出一些病原微生物，如病毒，慢生长的细菌或不易培养的细菌，真菌及原虫等。另外该技术可以从非特异性细菌污染中，筛选或确定正常无菌的标本。还可以用DNA指纹方法来鉴定细菌或作细菌分型。
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究竟该技术在诊断微生物学(diagnostic microbiology)上的评价如何，尚无正式的肯定，为此作一简单的综述，供同道们参考。
1 在微生物检验应用上的限制性
核酸扩增技术有一些技术上的问题，不适于检测微生物，例如细菌的DNA很长，首先要研究出每一种细菌的一段特异性基因，才能制备特异性引物；在微生物的感染中，往往不是一种微生物，常有重叠感染，因此在扩增时，可能发生错误，交叉或灵敏度不高等。在实验过程中确证有较多的假阳性(false-positive)。也有报道假阴性(false-negative)。因而限制了在微生物检验上的应用。
1.1 假阳性反应 这是最重要的问题。Noordhock等在七个实验室进行结核分枝杆菌的扩增试验研究及比较中发现不少假阳性结果，分析原因可能为扩增技术高度的灵敏，有少量的污染即可为阳性。污染的主要原因，在以前进行扩增的病人标本污染了器材及环境，虽然目前均用一次性的器材，有时也很难避免。为此目前国际上在处理标本及提取DNA时改用自动核酸提取技术如Gene pure 341应用的生物系统，可能好一些；另外也有人应用尿嘧啶-N-糖苷酶(uracil-N-glycosylase,UNG)来预防污染，但仍然有假阳性出现。例如病人经抗结核化疗后，结核分枝杆菌已死亡，仍然可呈阳性反应。虽然也有人证明，病人经化疗后，PCR的阳性率明显下降，但也不易完全转阴。
, 百拇医药
结核分枝杆菌以RNA作为靶子时，往往不适用扩增技术，因RNA酶在环境中存在很广泛，造成假阴性，因此需用没有RNA酶的器材。最后扩增技术的低特异性也是造成假阴性的原因。因此，特异性扩增常需要用内在引物(internal primers)作为第二次扩增或用特异性探针进行分子杂交(hybridization)。现代商业提供检测系统已包括足够的特异性对照材料。
1.2 假阴性结果 主要由于内在较低的敏感性。虽然现在使用再扩增方法，如巢式PCR(nested PCR)应用在检测结核分枝杆菌，以ISOLLO作为靶DNA或采用分子杂交技术，但仍然很难克服。
另外造成假阴性的原因是，在标本中存在多聚酶的抑制物。因此进行该试验时，应采用阳性对照或较纯的提取DNA，但这些步骤很繁复又可能造成污染；扩增试验最大的量是10 μl～50 μl，而培养标本的量为0.5 ml～10 ml,这也是造成假阴性的原因，尤其是血液标本或某些食品标本，其阳性率反而比培养低，如应用半自动血培养，可以在10 ml血液中培养出几个细菌，诊断败血症很有意义。假使用浓缩DNA的方法，往往同时浓缩了血标本中白细胞的DNA可以抑制扩增试验，现在有人在研究免疫磁性方法(immunomagnetic procedures)检测Listeria monocytogenes(单核细胞李司特菌)有一定的效果，但尚需进一步研究。
, 百拇医药
除了上述的一些情况外，往往扩增技术在临床使用时，低于研究的报告。细菌细胞倾向发生集团，也是造成假阴性的原因。
1.3 定量问题 扩增技术定量很困难。定量是诊断感染上很重要的工作，有很多感染不是少数病原菌引起，只有达到一定的量，才有诊断价值。虽然目前商业上已提供5′-核酸酶测定(Тaqman TMLS-5OB PCR detection system;ABI Prism 7700 sequence detection system;Applied Bio systems)或许可以解决这个问题，可是价格昂贵，且不够快速。
总之核酸扩增技术在微生物学诊断上受到一定的限制，其基本问题是种、型特异性引物的获得和无法进行药敏试验。
2 在微生物检验应用上的可能性
2.1 从标本中快速检测较难培养或不能培养的病原微生物的DNA，如某些病毒(Virus),衣原体(Clamydia),疏螺旋体(Borrelia),支原体(Mycoplasma)以及困难培养的分枝杆菌等，仍具有现实意义。
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2.2 若采用微生物群的共同引物(universal primer)可以检测某群的微生物帮助诊断，例如某些真菌群的检测，可以设计共同的引物，再在无菌的标本中作为筛选的应用。
2.3 在分离培养的基础上进行鉴定 分型及致病性(毒素)的测定，了解微生物的致病性及流行病学上的意义，仍然是良好的方法。
2.4 药敏试验上的应用 目前临床药敏试验仍是以K-B法为主。K-B法是检测已知病原菌对药物敏感的表型，往往在使用一次抗菌素后就诱导产生耐药，与临床治疗效果不符，造成临床与检验的分歧。自从分子生物技术应用，抗耐药测定就可能解决这个问题，目前已深入研究了耐药基因，直接检测该耐药基因就不会发生这种误解。例如1997年Towner研究不动杆菌对Carbapenem一类药物的耐药基因为aac(6′)-I基因，可用AL(5′-ATGAATATTAAACCTGCAT-3′)与AR(5′-TTAATCTATTTTTTTA-3′)作为引物，直接检测该耐药基因作为诊断。
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3 结论
以上叙述了核酸扩增技术在微生物学诊断上的限制性和可能性，可以部分了解该技术的优缺点及使用时应注意的方面，但究竟如何对待该技术呢?作者认为有下列三点供参考。
3.1 核酸扩增技术是20世纪末的先进技术，应该广泛使用及深入研究，在使用及研究中排除其缺点及局限性，发扬其优势，精益求精，相信它在21世纪微生物检验中是一个重要的技术。我国对该技术研究很不够，虽然文章很多，但是很少涉及本质的研究，且对比及对照很少，值得改进。
3.2 在开展这项新技术时，不能不管条件如何一哄而起，而且有排除或代替常规微生物检验方法之势，这是不合适的。常规检验方法中如涂片染色镜检，分离培养及生化、血清鉴定，抗原测定以及动物试验等仍然有它们的优势，是目前重要的，不可缺少的微生物检验方法，绝对不能用核酸扩增技术来代替一切，这些老方法仍要不断深入研究及改进。
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3.3 目前国际上认为可以用该技术直接从临床标本中测定或作为核实培养的微生物，以及鉴定分型的微生物见表1。
表1 可直接用PCR测定的临床微生物种类 培养核实及鉴定的微生物
可以直接测定的微生物
Mycobacterium tuberculosis complex
(结核分枝杆菌复合物)
Mycobacterium tuberculosis
(结核分枝杆菌)
Mycobacterium avium
(鸟型分枝杆菌)
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Neisseria gonorrhoeae
(淋病奈瑟菌)
Mycobacterium avium complex
(鸟型分枝杆菌复合物)
Chlamydia trachomatis
(沙眼衣原体)
Mycobacterium gordonae
(戈氏分枝杆菌)
Legionella pneumophila
(嗜肺军团杆菌)
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Neissena gonorrhoeae
(淋病奈瑟菌)
Mycoplasma pneumoniae
(人肺炎支原体)
Chlamydia trachomatis
(沙眼衣原体)
Bordetella pertussis
(百日咳杆菌)
Hemophilus influenzae
(流行性感冒杆菌)
, http://www.100md.com Entero viruses
(肠道病毒)
Listeria monocytogenes
(单核细胞李司特菌)
Human papilloma virus
(人类乳头瘤病毒)
Campylobacter species
(弯曲菌种)
Histoplasma capsulatum
(荚膜组织胞浆菌)
Coccidioides immitis
, http://www.100md.com
(厌酷球孢子菌)
Blastomyces dermatitidis
(皮炎芽生菌)
Human papilloma virus
(人类乳头瘤病毒)
参考文献
1 Melnick J,Adelberg S.Medical Microbiology.21 ed.Appleton & Lange Company:1998
2 Choutte M V,Van Eldere J.The possibilities and limitations of nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology.J Med Microbiology,1997,46:188—193
, 百拇医药
3 Saiki R K,et al.Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site anaylisis for diagnosis of sickle cell anemia.Science,1985,230:1350—1354
4 Mullis K B，et al.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymal,1987,155:335—350
5 Towner K J.Clinical importance and antibiotic resistance of Acinetobacter Spp.J Med Microbiology,1997,46;721—746
(1999-06-25收稿), 百拇医药