自制两种淋病奈瑟菌选择培养基的应用观察
作者：闫红琼 邓光贵 张文俊
单位：重庆万州区第四人民医院检验科(闫红琼)；第三军医大学大坪医院检验科(邓光贵 张文俊)
关键词：淋病奈瑟菌；选择培养基
临床检验杂志990517 摘要 研制一种质优价廉的新型Neissera gonorrhoeae(淋病奈瑟菌)选择培养基。以MH琼脂为基础添加营养成份和抗生素制成MH婴牛血清培养基(MHSM)与MH蛋黄培养基(MHEM)，将52株已分离纯化鉴定的淋病奈瑟菌和泌尿生殖道常见寄居菌等量接种至以上两种培养基和对照市售淋病奈瑟菌培养基(MNCM)上，相同条件下培养，观察3种培养基支持淋病奈瑟菌生长和杂菌抑制能力。结果，淋病奈瑟菌在所制培养基上生长快，菌落出现早且大，生长率高，与MNCM比较有显著性差异(P<0.05)，且MHSM及MHEM抑制杂菌的能力也明显优于MNCM。
N.gonorrhoeae(淋病奈瑟菌)培养虽困难，但目前为止WHO仍规定培养法是诊断淋病奈瑟菌感染的标准方法。我们以MH琼脂为基础制作的婴牛血清培养基(MHSM)和蛋黄培养基(MHEM)，经与市售商品培养基比较，效果满意。现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 培养基
1.1.1 自制MH婴牛血清培养基(MHSM) MH琼脂(购自浙江省军区后勤卫生防疫检验所)3.6 g，20 g/dl酵母透析液1.0 ml，玉米淀粉0.5 g，葡萄糖0.1 g，以上成份溶于100 ml H2O中，121°C，15 min灭菌后冷至60°C左右，加入室温预置的婴牛血清(天达生物工程有限公司)10 ml～15 ml，万古霉素0.3 mg，多粘菌素B 0.25 mg，制成MHSM。
1.1.2 自制MH蛋黄培养基(MHEM) 将上述培养基成份中的婴牛血清换成50 g/dl无菌蛋黄生理盐水液10 ml～15 ml即可。
1.1.3 市售改良淋病奈瑟菌选择培养基(购自浙江军区后勤卫生防疫检验所)，按说明制备时加入5%～10%羊/人红细胞，制成巧克力培养基(暂以MNCM命名)。
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1.1.4 TM培养基 英国OXIOD公司，用于淋病奈瑟菌的分离分纯培养。
1.1.5 奈瑟菌微量生化鉴定培养基，购自浙江军区后勤卫生防疫检验所，用于淋病奈瑟菌鉴定。
1.2 标本来源及鉴定 52株淋病奈瑟菌标本分别来自重庆市第一人民医院性病防治中心、解放军324医院及本院临床标本分离所得，全部由本室经过系统鉴定确认。涂片染色镜检，革兰阴性双球菌，呈肾型或蚕豆形，成对排列；氧化酶试验阳性；分解葡萄糖，不分解蔗糖、乳糖和麦芽糖；不还原硝酸盐；普通琼脂及22°C不生长。
1.3 三种培养基支持淋病奈瑟菌生长能力测定 将52株已分离纯化的淋病奈瑟菌单个菌落分别等量分区划线接种至3种培养基上，置烛缸(缸内保持充分湿度)，35°C～36°C培养，于24 h及48 h观察菌落形成情况及杂菌污染情况。
1.4 杂菌抑制试验 分别将大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、普通变形杆菌ATCC13315、结肠耶尔森菌(本室保留菌种)传代培养后，挑取单个菌落以生理盐水制成0.5麦氏浊度悬液(相当于1.5×108CFU/ml)并倍比稀释成1.5×107～1.5×102CFU/ml浓度，取不同浓度菌液分别等量(5 μl)接种至三种培养基上，置烛缸，35°C～36°C培养。逐日观察其生长情况。
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2 结果
2.1 52株淋病奈瑟菌的生长情况见表1。培养24 h观察，MHSM、MHEM上菌落形成有显著性差异(χ2分别为4.02和5.34，P值分别<0.05和<0.01)，而继续培养至48 h，两者的菌落形成率虽高于MNCM，但其差别无统计学意义。52株淋病奈瑟菌在MHSM、MHEM和MNCM上的平均菌落直径(x±s)分别为0.7±0.14 mm、0.76±0.18 mm、0.40±0.12 mm，与MNCM比较，t值分别为2.431和2.562；均P<0.05。可见，新培养基对于促进淋病奈瑟菌快速生长，提高早期阳性检出率可能有重要意义。
表1 52株淋病奈瑟菌在3种培养基上的生长率比较
MNCM
MHSM
MHEM
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24 h
48 h
36/52(69.23)
49/52(94.23)
47/52(90.38)
51/52(98.23)
48/52(92.31)
50/52(96.41)
(注：*MHSM与MNCM比较，χ2＝4.02，P<0.05；**MHEM与MNCM比较，χ2＝5.34，P<0.01)
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2.2 杂菌抑制情况见表2。
表2 试验杂菌在3种培养基上可生长浓度(CFU/ml)
大肠埃希菌
(ATCC25922)
金黄色葡萄球菌
(ATCC25923)
变形杆菌
(ATCC13315)
结肠耶尔森菌
(本室保存菌种)
MHSM
, 百拇医药 MHEM
MNCM
—
—
>2.5×102
—
—
>2.5×102
>2.5×104
>2.5×104
>2.5×102
>2.5×105
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>2.5×105
>2.5×102
2.3 环境中杂菌在3种培养基上的污染情况 随培养时间延长和启盖次数增加，杂菌污染程度愈重。24 h污染率分别为MHSM 0%，MHEM 0%，MNCM 8.3%，48 h污染率分别为4.0%，7.8%，20.4%。
3 讨论
淋病奈瑟菌生长需要丰富的营养，长期沿用以进口GC粉为基础的TM，MTM或NYC培养，因添加成份复杂，制作麻烦且成本高，使其在临床上的应用推广受到限制。国内许多单位尤其在基层仍然采用普通巧克力培养基或商品淋病奈瑟菌选择性培养基，不但成本高，有的效果也欠佳，造成许多漏检。
本文观察结果表明，MHSM、MHEM支持淋病奈瑟菌生长和杂菌抑制能力均明显优于MNCM，24 h生长率显著高于MNCM(P<0.05或<0.01)。MH主要成分为水解酪蛋白，而婴牛血清或蛋黄均含丰富营养成份，为淋病奈瑟菌生长提供了良好营养基础，酵母透析液已除去酵母中小分子毒性物质并含多种生长因子，玉米淀粉能吸附标本和培养基中对淋病奈瑟菌有毒的物质，可促进生长。培养48 h，在MHSM上形成中等大小、圆/椭圆形，浅灰白色，光滑湿润的菌落；在MHEM上则无色，半透明，呈露滴状，继续培养，菌落增大，边缘呈花瓣状。均易从颜色和形态上与其他类菌落相区别。与链球菌或类白喉棒状杆菌等菌落相似时，涂片染色镜检即可加以区别。而MNCM上淋病奈瑟菌的菌落太小，形态不够典型，易被杂菌覆盖而漏检。
实验中发现，温度和湿度对淋病奈瑟菌培养影响大，烛缸内应置无菌H2O并定期更换，以保持缸内有充分湿度并防止污染。同时，严格控制温度在35°C～36°C，超过此范围，则生长慢、菌落小、易漏检。
参考文献
1 郑彩兰主编.临床皮肤性病学指南.北京：北京科学技术出版社.1996.256
(1998-11-10收稿，1999-03-25修回), http://www.100md.com
单位：重庆万州区第四人民医院检验科(闫红琼)；第三军医大学大坪医院检验科(邓光贵 张文俊)
关键词：淋病奈瑟菌；选择培养基
临床检验杂志990517 摘要 研制一种质优价廉的新型Neissera gonorrhoeae(淋病奈瑟菌)选择培养基。以MH琼脂为基础添加营养成份和抗生素制成MH婴牛血清培养基(MHSM)与MH蛋黄培养基(MHEM)，将52株已分离纯化鉴定的淋病奈瑟菌和泌尿生殖道常见寄居菌等量接种至以上两种培养基和对照市售淋病奈瑟菌培养基(MNCM)上，相同条件下培养，观察3种培养基支持淋病奈瑟菌生长和杂菌抑制能力。结果，淋病奈瑟菌在所制培养基上生长快，菌落出现早且大，生长率高，与MNCM比较有显著性差异(P<0.05)，且MHSM及MHEM抑制杂菌的能力也明显优于MNCM。
N.gonorrhoeae(淋病奈瑟菌)培养虽困难，但目前为止WHO仍规定培养法是诊断淋病奈瑟菌感染的标准方法。我们以MH琼脂为基础制作的婴牛血清培养基(MHSM)和蛋黄培养基(MHEM)，经与市售商品培养基比较，效果满意。现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 培养基
1.1.1 自制MH婴牛血清培养基(MHSM) MH琼脂(购自浙江省军区后勤卫生防疫检验所)3.6 g，20 g/dl酵母透析液1.0 ml，玉米淀粉0.5 g，葡萄糖0.1 g，以上成份溶于100 ml H2O中，121°C，15 min灭菌后冷至60°C左右，加入室温预置的婴牛血清(天达生物工程有限公司)10 ml～15 ml，万古霉素0.3 mg，多粘菌素B 0.25 mg，制成MHSM。
1.1.2 自制MH蛋黄培养基(MHEM) 将上述培养基成份中的婴牛血清换成50 g/dl无菌蛋黄生理盐水液10 ml～15 ml即可。
1.1.3 市售改良淋病奈瑟菌选择培养基(购自浙江军区后勤卫生防疫检验所)，按说明制备时加入5%～10%羊/人红细胞，制成巧克力培养基(暂以MNCM命名)。
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1.1.4 TM培养基 英国OXIOD公司，用于淋病奈瑟菌的分离分纯培养。
1.1.5 奈瑟菌微量生化鉴定培养基，购自浙江军区后勤卫生防疫检验所，用于淋病奈瑟菌鉴定。
1.2 标本来源及鉴定 52株淋病奈瑟菌标本分别来自重庆市第一人民医院性病防治中心、解放军324医院及本院临床标本分离所得，全部由本室经过系统鉴定确认。涂片染色镜检，革兰阴性双球菌，呈肾型或蚕豆形，成对排列；氧化酶试验阳性；分解葡萄糖，不分解蔗糖、乳糖和麦芽糖；不还原硝酸盐；普通琼脂及22°C不生长。
1.3 三种培养基支持淋病奈瑟菌生长能力测定 将52株已分离纯化的淋病奈瑟菌单个菌落分别等量分区划线接种至3种培养基上，置烛缸(缸内保持充分湿度)，35°C～36°C培养，于24 h及48 h观察菌落形成情况及杂菌污染情况。
1.4 杂菌抑制试验 分别将大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、普通变形杆菌ATCC13315、结肠耶尔森菌(本室保留菌种)传代培养后，挑取单个菌落以生理盐水制成0.5麦氏浊度悬液(相当于1.5×108CFU/ml)并倍比稀释成1.5×107～1.5×102CFU/ml浓度，取不同浓度菌液分别等量(5 μl)接种至三种培养基上，置烛缸，35°C～36°C培养。逐日观察其生长情况。
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2 结果
2.1 52株淋病奈瑟菌的生长情况见表1。培养24 h观察，MHSM、MHEM上菌落形成有显著性差异(χ2分别为4.02和5.34，P值分别<0.05和<0.01)，而继续培养至48 h，两者的菌落形成率虽高于MNCM，但其差别无统计学意义。52株淋病奈瑟菌在MHSM、MHEM和MNCM上的平均菌落直径(x±s)分别为0.7±0.14 mm、0.76±0.18 mm、0.40±0.12 mm，与MNCM比较，t值分别为2.431和2.562；均P<0.05。可见，新培养基对于促进淋病奈瑟菌快速生长，提高早期阳性检出率可能有重要意义。
表1 52株淋病奈瑟菌在3种培养基上的生长率比较
MNCM
MHSM
MHEM
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24 h
48 h
36/52(69.23)
49/52(94.23)
47/52(90.38)
51/52(98.23)
48/52(92.31)
50/52(96.41)
(注：*MHSM与MNCM比较，χ2＝4.02，P<0.05；**MHEM与MNCM比较，χ2＝5.34，P<0.01)
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2.2 杂菌抑制情况见表2。
表2 试验杂菌在3种培养基上可生长浓度(CFU/ml)
大肠埃希菌
(ATCC25922)
金黄色葡萄球菌
(ATCC25923)
变形杆菌
(ATCC13315)
结肠耶尔森菌
(本室保存菌种)
MHSM
, 百拇医药 MHEM
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2.3 环境中杂菌在3种培养基上的污染情况 随培养时间延长和启盖次数增加，杂菌污染程度愈重。24 h污染率分别为MHSM 0%，MHEM 0%，MNCM 8.3%，48 h污染率分别为4.0%，7.8%，20.4%。
3 讨论
淋病奈瑟菌生长需要丰富的营养，长期沿用以进口GC粉为基础的TM，MTM或NYC培养，因添加成份复杂，制作麻烦且成本高，使其在临床上的应用推广受到限制。国内许多单位尤其在基层仍然采用普通巧克力培养基或商品淋病奈瑟菌选择性培养基，不但成本高，有的效果也欠佳，造成许多漏检。
本文观察结果表明，MHSM、MHEM支持淋病奈瑟菌生长和杂菌抑制能力均明显优于MNCM，24 h生长率显著高于MNCM(P<0.05或<0.01)。MH主要成分为水解酪蛋白，而婴牛血清或蛋黄均含丰富营养成份，为淋病奈瑟菌生长提供了良好营养基础，酵母透析液已除去酵母中小分子毒性物质并含多种生长因子，玉米淀粉能吸附标本和培养基中对淋病奈瑟菌有毒的物质，可促进生长。培养48 h，在MHSM上形成中等大小、圆/椭圆形，浅灰白色，光滑湿润的菌落；在MHEM上则无色，半透明，呈露滴状，继续培养，菌落增大，边缘呈花瓣状。均易从颜色和形态上与其他类菌落相区别。与链球菌或类白喉棒状杆菌等菌落相似时，涂片染色镜检即可加以区别。而MNCM上淋病奈瑟菌的菌落太小，形态不够典型，易被杂菌覆盖而漏检。
实验中发现，温度和湿度对淋病奈瑟菌培养影响大，烛缸内应置无菌H2O并定期更换，以保持缸内有充分湿度并防止污染。同时，严格控制温度在35°C～36°C，超过此范围，则生长慢、菌落小、易漏检。
参考文献
1 郑彩兰主编.临床皮肤性病学指南.北京：北京科学技术出版社.1996.256
(1998-11-10收稿，1999-03-25修回), http://www.100md.com