磷酸对硝基苯酚法检测细菌碱性磷酸酶的临床应用
作者：李金钟 段雄波 相青珍 李兰平
单位：新乐市医院
关键词：细菌；碱性磷酸酶；磷酸对硝基苯酚法
临床检验杂志990515
摘要 为探讨细菌碱性磷酸酶的临床应用价值，用磷酸对硝基苯酚法(4-NPP法)检测903株细菌碱性磷酸酶(ALP)活性。结果，微球菌、非发酵菌均阴性，肠球菌、马红球菌和肠杆菌科细菌均阳性，葡萄球菌、棒状杆菌因菌种不同反应各异。故细菌ALP可作为葡萄球菌种间，棒状杆菌种间鉴别的一个重要特性。
4-NPP assay for the detection of bacterium alkaline phosphatase activity and its preliminary clinical application
, http://www.100md.com
LI Jinzhong,DUAN Xiongbo,XIANG Qingzhen,et al.(Xinle Municipal Hospital Hebei Xinle 050700)
Abstract To study the applicable value of alkline phosphatase activity(ALP)in the detection of bacterium by p-nitrophenylphosphate(4-NPP)assay.4-NPP assay was used to detect ALP of 903 strains of bacterium separated in the clinical spe-
cimen.Micrococcus and nonfermenters were negative reaction.Enterococcus faecalis,Rhodococcus equi and Enterobacteriaceae were positive reaction.There exists difference reactions between the species of staphylococcus and corynebacterium,respectively.ALP of bacterium can be used to identify in species of staphylococcus and corynebacterium,respectively.4-NPP assay is simple,rapid and accurate,it is applicable to medical laboratories of different levels.
, 百拇医药
Key words Bacterium； Alkaline phosphatase； p-nitrophenylphosphate
细菌碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测多采用磷酸酚酞琼脂平板法[1，2]。最近有报告用纸片法检测细菌ALP[3]，使测定时间大大缩短。我们曾建立一种以磷酸对硝基苯酚(4-NPP)为ALP底物的快速微量法(下称4-NPP法)[4]，对其实验条件进行了探讨，并与平板法进行了比较研究。为进一步探讨4-NPP法检测细菌ALP的临床应用价值，以标准菌株做质控，对临床分离的903株各类细菌进行了ALP检测。
1 材料与方法
1.1 参考菌株 金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)均购自中国药品生物制品检定所。
, http://www.100md.com
1.2 实验菌株 共903株，均来自临床标本。其中，葡萄球菌230株，微球菌13株，肠球菌8株，棒状杆菌63株，马红球菌12株，肠杆菌科392株，非发酵菌185株。实验前均复核鉴定。
1.3 ALP底物液 A液为2 mol/L乙二醇胺缓冲液，每50 ml含乙二醇胺10 ml、MgCl2*6H2O 102 mg，用浓盐酸约1.95 ml调pH至10.0；B液为30 mmol/L 4-NPP。临用前将A、B液等量混合。或使用血清ALP试剂盒(IFCC推荐法)。
1.4 方法
1.4.1 细菌鉴定 细菌的分离培养按常规进行。肠杆菌科细菌、非发酵菌分别采用“生化编码15 e、11 e”进行鉴定；葡萄球菌、棒状杆菌均采用分组鉴定法鉴定[5，6]，部分菌株用API系统鉴定；其它细菌按常规鉴定[7]。
, 百拇医药
1.4.2 ALP检测 用接种环挑取适量新鲜待检菌落混悬于含有200 μl ALP底物液的ELISA微量反应孔中，35°C温育。60 min内出现明显黄色为ALP阳性，无色或微黄色为阴性。每次均做阳性、阴性和试剂空白对照。
2 结果
2.1 参考菌株ALP结果 金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌ALP均阳性；铜绿假单胞菌ALP阴性。
2.2 实验菌株ALP结果
2.2.1 革兰阴性菌 肠杆菌科细菌(大肠埃希菌118株、克雷伯菌68株、变形杆菌51株、摩根菌12株、沙雷菌38株、枸橼酸杆菌21株、志贺菌21株、沙门菌11株、肠杆菌49株、寒生克卢瓦菌3株)392株，ALP均阳性。非发酵菌(铜绿假单胞菌63株、其它假单胞菌56株、嗜麦芽窄食黄单胞菌23株、不动杆菌38株、无色杆菌3株、黄杆菌2株)185株，ALP均阴性。
, http://www.100md.com
2.2.2 革兰阳性菌 见表1。
表1 革兰阳性细菌ALP阳性率
Table 1 Positive rate of ALP in Gram-positive bacteria
speices
number
positive(%)
speices
number
positive(%)
S.aureus
, http://www.100md.com (金黄色葡萄球菌)
S.epidermidis
(表皮葡萄球菌)
S.saprophyticus
(腐生葡萄球菌)
S.intermedius
(中间型葡萄球菌)
S.xylosus
(木糖葡萄球菌)
S.haemolyticus
(溶血葡萄球菌)
, http://www.100md.com
S.cohnii
(孔氏葡萄球菌)
S.simulans
(模仿葡萄球菌)
S.sciuri
(松鼠葡萄球菌)
S.auricularis
(耳葡萄球菌)
Micrococcus
(微球菌)
E.faecalis
(粪肠球菌)
, http://www.100md.com
R.equi
(马红球菌)
87
54
37
18
13
7
5
4
3
2
13
8
, 百拇医药
12
87(100)
46(85.2)
0(0)
18(100)
11(84.6)
1(14.3)
0(0)
3(75.0)
3(100)
0(0)
0(0)
, http://www.100md.com 8(100)
12(100)
C.pseudodiphtheriae
(假白喉棒状杆菌)
C.xerosis
(干燥棒状杆菌)
C.minutissimum
(微小棒状杆菌)
C.kutscheri
(库氏棒状杆菌)
C.pseudotuberculosis
, http://www.100md.com
(假结核棒状杆菌)
C.bovis
(牛棒状杆菌)
C.jeikeium
(杰克棒状杆菌)
C.urealyticum
(解脲棒状杆菌)
C.ulcerans
(溃疡棒状杆菌)
C.cystitidis
(膀胱炎棒状杆菌)
C.matruchotii
, 百拇医药
(马初查特棒状杆菌)
CDC Group F1
(CDC F1群)
CDC Group G2
(CDC G2群)
13
9
7
5
5
4
4
4
, 百拇医药
3
3
2
3
1
1(7.7)
9(100)
7(100)
0(0)
0(0)
0(0)
4(100)
1(25)
, 百拇医药
3(100)
0(0)
0(0)
2(66.7)
1
3 讨论
4-NPP法是在测定葡萄球菌ALP的基础上建立的。因菌种不同，其产生ALP的量亦不相同。在实际工作中，应用此法检测肠杆菌科细菌ALP时发现，30 min内假阴性率约30%(尤其是志贺菌)，60 min内可全部呈现阳性反应，故将测定时间修订为60 min。另外，应用4-NPP法测定细菌ALP成败的关键在于菌液浓度，若加入菌量太少，则易出现假阴性，应特别注意。
关于细菌ALP检测的临床应用价值，国内很少报道。一般认为，主要用于致病性葡萄球菌与其它葡萄球菌的鉴别[1，2]。从本文结果看，微球菌ALP阴性，肠球菌阳性；非发酵菌阴性，肠杆菌科细菌阳性；葡萄球菌、棒状杆菌属的细菌，则因菌种不同，产生ALP的能力各异，且具有较强的特异性。因此，细菌ALP检测可作为肠杆菌科与非发酵菌、葡萄球菌属种间以及棒状杆菌属种间鉴别的一个重要特性[6，8]。应特别指出的是，肠杆菌科中除沙雷菌属的个别菌株外，绝大多数的克雷伯菌可产生大量ALP，在5 min内即呈阳性反应，有些菌株甚至在1 min呈现阳性，这对区别其它肠杆菌有一定帮助。
, 百拇医药
(蒙中日友好医院娄永新教授指导，特致谢意)
参考文献
1 朱忠勇.实用医学检验学.人民军医出版社，1992:534
2 娄永新，王金良.实用临床细菌学检验与进展.天津科技翻译出版公司，1993.346
3 王继贵，蔡乾英，童明华.细菌碱性磷酸酶试验纸片法.中华医学检验杂志，1997，20(1)：45
4 李金钟，段雄波，相青珍，等.快速微量法测定葡萄球菌碱性磷酸酶.临床检验杂志，1997，15(3)：166
5 李金钟.葡萄球菌属的分组鉴定研究.河北医学，1995，1(2)：86
6 李金钟，刘利平，段雄波，等.棒状杆菌属细菌分组鉴定与临床应用.中华医学检验杂志，1997，20(3)：178
7 李仲兴，郑家齐，李家宏.诊断细菌学.香港：黄河文化出版社，1992
8 Kloos W E,Bannerman T L.Staphylococcus and Micrococcus.in:Murray P R.Manual of Clinical Microbilolgy,6 th edition,Washington DC:American society for Microbiology,1995.282—298
(1998-09-18收稿，1999-05-27修回), 百拇医药
单位：新乐市医院
关键词：细菌；碱性磷酸酶；磷酸对硝基苯酚法
临床检验杂志990515
摘要 为探讨细菌碱性磷酸酶的临床应用价值，用磷酸对硝基苯酚法(4-NPP法)检测903株细菌碱性磷酸酶(ALP)活性。结果，微球菌、非发酵菌均阴性，肠球菌、马红球菌和肠杆菌科细菌均阳性，葡萄球菌、棒状杆菌因菌种不同反应各异。故细菌ALP可作为葡萄球菌种间，棒状杆菌种间鉴别的一个重要特性。
4-NPP assay for the detection of bacterium alkaline phosphatase activity and its preliminary clinical application
, http://www.100md.com
LI Jinzhong,DUAN Xiongbo,XIANG Qingzhen,et al.(Xinle Municipal Hospital Hebei Xinle 050700)
Abstract To study the applicable value of alkline phosphatase activity(ALP)in the detection of bacterium by p-nitrophenylphosphate(4-NPP)assay.4-NPP assay was used to detect ALP of 903 strains of bacterium separated in the clinical spe-
cimen.Micrococcus and nonfermenters were negative reaction.Enterococcus faecalis,Rhodococcus equi and Enterobacteriaceae were positive reaction.There exists difference reactions between the species of staphylococcus and corynebacterium,respectively.ALP of bacterium can be used to identify in species of staphylococcus and corynebacterium,respectively.4-NPP assay is simple,rapid and accurate,it is applicable to medical laboratories of different levels.
, 百拇医药
Key words Bacterium； Alkaline phosphatase； p-nitrophenylphosphate
细菌碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测多采用磷酸酚酞琼脂平板法[1，2]。最近有报告用纸片法检测细菌ALP[3]，使测定时间大大缩短。我们曾建立一种以磷酸对硝基苯酚(4-NPP)为ALP底物的快速微量法(下称4-NPP法)[4]，对其实验条件进行了探讨，并与平板法进行了比较研究。为进一步探讨4-NPP法检测细菌ALP的临床应用价值，以标准菌株做质控，对临床分离的903株各类细菌进行了ALP检测。
1 材料与方法
1.1 参考菌株 金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)均购自中国药品生物制品检定所。
, http://www.100md.com
1.2 实验菌株 共903株，均来自临床标本。其中，葡萄球菌230株，微球菌13株，肠球菌8株，棒状杆菌63株，马红球菌12株，肠杆菌科392株，非发酵菌185株。实验前均复核鉴定。
1.3 ALP底物液 A液为2 mol/L乙二醇胺缓冲液，每50 ml含乙二醇胺10 ml、MgCl2*6H2O 102 mg，用浓盐酸约1.95 ml调pH至10.0；B液为30 mmol/L 4-NPP。临用前将A、B液等量混合。或使用血清ALP试剂盒(IFCC推荐法)。
1.4 方法
1.4.1 细菌鉴定 细菌的分离培养按常规进行。肠杆菌科细菌、非发酵菌分别采用“生化编码15 e、11 e”进行鉴定；葡萄球菌、棒状杆菌均采用分组鉴定法鉴定[5，6]，部分菌株用API系统鉴定；其它细菌按常规鉴定[7]。
, 百拇医药
1.4.2 ALP检测 用接种环挑取适量新鲜待检菌落混悬于含有200 μl ALP底物液的ELISA微量反应孔中，35°C温育。60 min内出现明显黄色为ALP阳性，无色或微黄色为阴性。每次均做阳性、阴性和试剂空白对照。
2 结果
2.1 参考菌株ALP结果 金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌ALP均阳性；铜绿假单胞菌ALP阴性。
2.2 实验菌株ALP结果
2.2.1 革兰阴性菌 肠杆菌科细菌(大肠埃希菌118株、克雷伯菌68株、变形杆菌51株、摩根菌12株、沙雷菌38株、枸橼酸杆菌21株、志贺菌21株、沙门菌11株、肠杆菌49株、寒生克卢瓦菌3株)392株，ALP均阳性。非发酵菌(铜绿假单胞菌63株、其它假单胞菌56株、嗜麦芽窄食黄单胞菌23株、不动杆菌38株、无色杆菌3株、黄杆菌2株)185株，ALP均阴性。
, http://www.100md.com
2.2.2 革兰阳性菌 见表1。
表1 革兰阳性细菌ALP阳性率
Table 1 Positive rate of ALP in Gram-positive bacteria
speices
number
positive(%)
speices
number
positive(%)
S.aureus
, http://www.100md.com (金黄色葡萄球菌)
S.epidermidis
(表皮葡萄球菌)
S.saprophyticus
(腐生葡萄球菌)
S.intermedius
(中间型葡萄球菌)
S.xylosus
(木糖葡萄球菌)
S.haemolyticus
(溶血葡萄球菌)
, http://www.100md.com
S.cohnii
(孔氏葡萄球菌)
S.simulans
(模仿葡萄球菌)
S.sciuri
(松鼠葡萄球菌)
S.auricularis
(耳葡萄球菌)
Micrococcus
(微球菌)
E.faecalis
(粪肠球菌)
, http://www.100md.com
R.equi
(马红球菌)
87
54
37
18
13
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8
, 百拇医药
12
87(100)
46(85.2)
0(0)
18(100)
11(84.6)
1(14.3)
0(0)
3(75.0)
3(100)
0(0)
0(0)
, http://www.100md.com 8(100)
12(100)
C.pseudodiphtheriae
(假白喉棒状杆菌)
C.xerosis
(干燥棒状杆菌)
C.minutissimum
(微小棒状杆菌)
C.kutscheri
(库氏棒状杆菌)
C.pseudotuberculosis
, http://www.100md.com
(假结核棒状杆菌)
C.bovis
(牛棒状杆菌)
C.jeikeium
(杰克棒状杆菌)
C.urealyticum
(解脲棒状杆菌)
C.ulcerans
(溃疡棒状杆菌)
C.cystitidis
(膀胱炎棒状杆菌)
C.matruchotii
, 百拇医药
(马初查特棒状杆菌)
CDC Group F1
(CDC F1群)
CDC Group G2
(CDC G2群)
13
9
7
5
5
4
4
4
, 百拇医药
3
3
2
3
1
1(7.7)
9(100)
7(100)
0(0)
0(0)
0(0)
4(100)
1(25)
, 百拇医药
3(100)
0(0)
0(0)
2(66.7)
1
3 讨论
4-NPP法是在测定葡萄球菌ALP的基础上建立的。因菌种不同，其产生ALP的量亦不相同。在实际工作中，应用此法检测肠杆菌科细菌ALP时发现，30 min内假阴性率约30%(尤其是志贺菌)，60 min内可全部呈现阳性反应，故将测定时间修订为60 min。另外，应用4-NPP法测定细菌ALP成败的关键在于菌液浓度，若加入菌量太少，则易出现假阴性，应特别注意。
关于细菌ALP检测的临床应用价值，国内很少报道。一般认为，主要用于致病性葡萄球菌与其它葡萄球菌的鉴别[1，2]。从本文结果看，微球菌ALP阴性，肠球菌阳性；非发酵菌阴性，肠杆菌科细菌阳性；葡萄球菌、棒状杆菌属的细菌，则因菌种不同，产生ALP的能力各异，且具有较强的特异性。因此，细菌ALP检测可作为肠杆菌科与非发酵菌、葡萄球菌属种间以及棒状杆菌属种间鉴别的一个重要特性[6，8]。应特别指出的是，肠杆菌科中除沙雷菌属的个别菌株外，绝大多数的克雷伯菌可产生大量ALP，在5 min内即呈阳性反应，有些菌株甚至在1 min呈现阳性，这对区别其它肠杆菌有一定帮助。
, 百拇医药
(蒙中日友好医院娄永新教授指导，特致谢意)
参考文献
1 朱忠勇.实用医学检验学.人民军医出版社，1992:534
2 娄永新，王金良.实用临床细菌学检验与进展.天津科技翻译出版公司，1993.346
3 王继贵，蔡乾英，童明华.细菌碱性磷酸酶试验纸片法.中华医学检验杂志，1997，20(1)：45
4 李金钟，段雄波，相青珍，等.快速微量法测定葡萄球菌碱性磷酸酶.临床检验杂志，1997，15(3)：166
5 李金钟.葡萄球菌属的分组鉴定研究.河北医学，1995，1(2)：86
6 李金钟，刘利平，段雄波，等.棒状杆菌属细菌分组鉴定与临床应用.中华医学检验杂志，1997，20(3)：178
7 李仲兴，郑家齐，李家宏.诊断细菌学.香港：黄河文化出版社，1992
8 Kloos W E,Bannerman T L.Staphylococcus and Micrococcus.in:Murray P R.Manual of Clinical Microbilolgy,6 th edition,Washington DC:American society for Microbiology,1995.282—298
(1998-09-18收稿，1999-05-27修回), 百拇医药