幽门螺杆菌改良无血培养基的研制
作者：王毅超 郭刚 解庆华 邹全明
单位：第三军医大学临床微生物学教研室
关键词：幽门螺杆菌；培养基
临床检验杂志990514 摘要 在无血脑心浸液卵黄琼脂培养基(BHI-EA)的基础上进行改良，建立一新型快速、简便的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)无血脑心浸液卵黄琼脂培养基(BHI-EA)。应用此改良培养基和含血脑心浸液培养基(BHIA)分别对82例胃粘膜标本进行分离培养，对两者在Hp阳性培养率、分离时间及Hp纯培养速度方面进行比较。改良培养基分离Hp阳性率为70%(57/82)，脑心浸液血培养基阳性率为63%(52/82)。采用改良培养基分离Hp时间缩短近24 h，纯培养时间缩短近12 h，且细菌各项检测指标典型。因此，改良培养基更适用于Hp的分离培养。
An improved medium without blood for Helicobacter pylori
, http://www.100md.com
WANG Yichao,GUO Gang,XIE Qinghua,ZOU Quanming(Department of Clinical Microbiology,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Establish a rapid and easy medium without blood for Helicobacter pylori.Improve the components to the brain heart infussion-egg yolk agar medium without blood(BHI-EA).Through isolation and cultivation of the Helicobacter pylori from 82 stomach mucosas with the improved medium and brain heart infusion agar containing blood(BHIA)to compared the difference between this improved medium and BHIA on the positive rate of the stomach mucosas,isolation time and grow speed of pure cultivation.The rate of Helicobacter pylori positive with the improved mediums was 70%(57/82),but with the BHIA was 63%(52/82).The time for pure cultivation could shorten 12 h,isolation shorten 24 h.All the test indexes were typically.The improved medium is easier to isolate and culture Helicobacter pylori.
, 百拇医药
Key words Helicobacter pylori； Medium
Helicobacter pylori(幽门螺杆菌,Hp)是一种与人类消化道疾病密切相关的病原菌。其体外培养的方法较多[1，3]，国内多采用含血脑心浸液培养基。由于其操作的繁琐及易污染性，近年来陆续有人采用无血培养基即卵黄培养基[4，5]，但该培养基仍存在培养时间较长的缺点。针对此情况，我们在卵黄培养基的基础上进行改良，使培养时间缩短，且细菌的各种生物学性状均较典型。
1 材料及方法
1.1 培养基的制备
1.1.1 含血脑心浸液培养基(BHIA) 取脑心浸液(BHI)[6]45 ml加入蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸馏水 55 ml，调节pH值至7.6～7.8，加琼脂粉1.5 g后高压，再加入已灭菌绵羊血5 ml，10 g/dl葡萄糖5 ml和万古霉素、磺胺增效剂(TMP)以及多粘菌素B，使其最终浓度分别达到10 mg/L、5 mg/L、0.38 mg/L，倒平板备用。
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1.1.2 卵黄脑心浸液培养基(BHI-EA) 取新鲜鸡蛋于75%酒精内消毒10分钟，以无菌手续将卵黄取出放入有玻璃珠的无菌生理盐水中，使最终体积比为1∶1，摇匀备用。向45 ml牛脑心浸液中加入胰蛋白胨1 g，1 g/dl可溶性淀粉，NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸馏水55 ml，调节pH值为7.6，加琼脂粉1.5 g高压，待温度降至60°C时加入上述卵黄水30 ml，再加入20 g/dl无菌葡萄糖溶液3 ml及抗生素混悬液，使最终浓度分别为，万古霉素10 mg/L，TMP 5 mg/L，多粘菌素B 0.38 mg/L，倒平板待用。
1.2 Hp分离培养 取82例我校附属医院消化科胃镜室就诊病人胃粘膜标本，分别置玻璃匀浆器内研磨后，取等量悬液均匀涂布于上述二种培养基上。将各接种平板置于密闭玻璃干燥器内，用抽气泵抽至负压73 kPa后，灌入气体使终浓度分别达到(5% O2、85% N2、10% CO2)，罐内放一盛水小瓶，使湿度>95%，37°C孵箱内孵育1～4天，观察Hp生长情况以及检测生物学性状。
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1.3 Hp纯培养 取等量已分离纯化的Hp菌液转种到上述两种培养基上，L型玻璃棒均匀涂布后培养，培养条件同上，观察长出肉眼可见菌落所需时间。
1.4 Hp鉴定 生长出的菌株用革兰染色镜检，PCR鉴定，另作脲酶、氧化酶、触酶及动力实验对其生物学性状进行检测，步骤按常规法进行。
2 结果
2.1 两种培养基上胃标本中Hp分离培养速度的比较 标本接种后，每24小时观察一次，如出现可疑Hp菌落，则取菌涂片行革兰染色镜检，并作脲酶、氧化酶、触酶和PCR鉴定。如果形态染色典型，脲酶、氧化酶、触酶及PCR阳性则确认为标本Hp分离阳性。用BHI-EA培养基培养24小时后阳性例数在总阳性例数中的比率为21%(12/57)，高于BHIA上24 h的阳性比率2%(1/52)，两者相差显著(P<0.01)。培养48 h后BHI-EA上的阳性比率为88%(50/57)，也显著高于BHIA上的阳性比率60%(31/52)(见表1)，证明BHI-EA培养基能显著缩短胃标本中Hp的检出时间。
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表1 两种培养基上不同时间胃粘膜标本分离Hp的阳性例数
Table 1 The number of Hp positive from gastric mucosas with BHIA and BHI-EA in difference time
Medium
positive number
Total
24 h
48 h
72 h
96 h
BHIA
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BHI-EA
1
12
30
38
17
6
4
1
52
57
2.2 两种培养基上胃标本Hp分离阳性率比较 分别对82例不同胃病患者(胃癌9例，胃炎16例，胃溃疡23例，十二脂肠溃疡24例，其它胃疾病10例)胃粘膜标本进行分离培养。结果在BHIA上阳性分离率为63%(52/82)，而在BHI-EA上阳性率为70%(57/82)。培养结果表明，BHIA与BHI-EA对不同消化道疾病患者胃粘膜的Hp分离阳性率基本一致，BHI-EA稍高于BHIA，无统计学差异(P>0.05)。
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2.3 两种培养基上Hp纯培养生长速度的比较 所有Hp分离株在此两种培养基上均能顺利生长，但生长速度明显不同，分别取前述57例阳性标本的分离菌株进行纯培养。在BHI-EA上12 h即有4株菌长出肉眼可见菌落，24 h内阳性结果为41例，阳性率为72%(41/57)。而BHIA上12 h内无明显菌落出现，直到24 h才有8株菌株出现，阳性率仅为14%(8/57)，显著低于BHI-EA组(P<0.01)。
3 讨论
最近几年报道的针对Hp培养的无血培养基基本解决了应用含血培养基易污染的问题。但其培养速度仍较慢，我们采用的改良无血培养基充分解决了这一问题，在此培养基中，我们加入了相当于常规卵黄培养基中两倍的卵黄量，同时加入适量的胰蛋白胨成份，充分满足Hp生长营养需求，有效地刺激其生长，此外加入可溶性淀粉可吸附标本中有毒物质及Hp生长的代谢产物，保证Hp处于有利的生长环境。由实验结果可以得出，改良卵黄培养基能大大提高Hp的生长速度从而较大程度的节省培养时间，而且各项生物学性状均很典型，完全能满足临床诊断及Hp的研究所需，是一种实用的Hp培养方法。
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幽门螺杆菌作为人胃内定居菌，对营养成分、气体条件等均有较严格的要求，使其在体外培养中受到很多因素的影响，因此培养基在制备过程中应严格控制pH值和各种成份的含量，特别是抗生素浓度及葡萄糖的含量。此外，由于Hp生长需要一定湿度条件，故在培养基倾倒平板后，应密封放4°C冰箱待用，放置时间不宜超过两周，保证Hp在新鲜培养基中有一最佳生长环境。另外，由于此培养基能有效的促进Hp生长，故在培养过程中应掌握好时间以防生长过度导致细菌球性变。
参考文献
1 Sahay P,West A P,Hawkey P M,et al.Isolation of Helicobacter pylori from faeces.J Infect,1995,30:262～263
2 Ferguson D A J,Li C,Patel N R,et al.Isolation of Helicobacter pylori from saliva.J Clin Microbiol,1993,31:2802～2804
, 百拇医药
3 Hirata I,Itoh T,Masubuchi N，et al.Isoaltion identification and quantitative culture of Helicobacter pylori from gastric mucosa.Nippon Rinsho,1993,51:3170～3175
4 牟兆钦，尹秀云，李富裕，等.用无血脑心浸液卵黄琼脂培养基分离培养幽门螺杆菌的研究.军事医学科学院院刊，1995,19(1):63
5 吴开宇，吴平，潘秀珍，等.一种用于幽门螺杆菌培养和菌种保存的培养基——卵黄培养基.微生物学通报，1992，19(2):112
6 周殿元，等主编.幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京：中国科技出版社，1997.290
(1998-12-22收稿，1999-05-27修回), 百拇医药
单位：第三军医大学临床微生物学教研室
关键词：幽门螺杆菌；培养基
临床检验杂志990514 摘要 在无血脑心浸液卵黄琼脂培养基(BHI-EA)的基础上进行改良，建立一新型快速、简便的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)无血脑心浸液卵黄琼脂培养基(BHI-EA)。应用此改良培养基和含血脑心浸液培养基(BHIA)分别对82例胃粘膜标本进行分离培养，对两者在Hp阳性培养率、分离时间及Hp纯培养速度方面进行比较。改良培养基分离Hp阳性率为70%(57/82)，脑心浸液血培养基阳性率为63%(52/82)。采用改良培养基分离Hp时间缩短近24 h，纯培养时间缩短近12 h，且细菌各项检测指标典型。因此，改良培养基更适用于Hp的分离培养。
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WANG Yichao,GUO Gang,XIE Qinghua,ZOU Quanming(Department of Clinical Microbiology,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Establish a rapid and easy medium without blood for Helicobacter pylori.Improve the components to the brain heart infussion-egg yolk agar medium without blood(BHI-EA).Through isolation and cultivation of the Helicobacter pylori from 82 stomach mucosas with the improved medium and brain heart infusion agar containing blood(BHIA)to compared the difference between this improved medium and BHIA on the positive rate of the stomach mucosas,isolation time and grow speed of pure cultivation.The rate of Helicobacter pylori positive with the improved mediums was 70%(57/82),but with the BHIA was 63%(52/82).The time for pure cultivation could shorten 12 h,isolation shorten 24 h.All the test indexes were typically.The improved medium is easier to isolate and culture Helicobacter pylori.
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Key words Helicobacter pylori； Medium
Helicobacter pylori(幽门螺杆菌,Hp)是一种与人类消化道疾病密切相关的病原菌。其体外培养的方法较多[1，3]，国内多采用含血脑心浸液培养基。由于其操作的繁琐及易污染性，近年来陆续有人采用无血培养基即卵黄培养基[4，5]，但该培养基仍存在培养时间较长的缺点。针对此情况，我们在卵黄培养基的基础上进行改良，使培养时间缩短，且细菌的各种生物学性状均较典型。
1 材料及方法
1.1 培养基的制备
1.1.1 含血脑心浸液培养基(BHIA) 取脑心浸液(BHI)[6]45 ml加入蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸馏水 55 ml，调节pH值至7.6～7.8，加琼脂粉1.5 g后高压，再加入已灭菌绵羊血5 ml，10 g/dl葡萄糖5 ml和万古霉素、磺胺增效剂(TMP)以及多粘菌素B，使其最终浓度分别达到10 mg/L、5 mg/L、0.38 mg/L，倒平板备用。
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1.1.2 卵黄脑心浸液培养基(BHI-EA) 取新鲜鸡蛋于75%酒精内消毒10分钟，以无菌手续将卵黄取出放入有玻璃珠的无菌生理盐水中，使最终体积比为1∶1，摇匀备用。向45 ml牛脑心浸液中加入胰蛋白胨1 g，1 g/dl可溶性淀粉，NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸馏水55 ml，调节pH值为7.6，加琼脂粉1.5 g高压，待温度降至60°C时加入上述卵黄水30 ml，再加入20 g/dl无菌葡萄糖溶液3 ml及抗生素混悬液，使最终浓度分别为，万古霉素10 mg/L，TMP 5 mg/L，多粘菌素B 0.38 mg/L，倒平板待用。
1.2 Hp分离培养 取82例我校附属医院消化科胃镜室就诊病人胃粘膜标本，分别置玻璃匀浆器内研磨后，取等量悬液均匀涂布于上述二种培养基上。将各接种平板置于密闭玻璃干燥器内，用抽气泵抽至负压73 kPa后，灌入气体使终浓度分别达到(5% O2、85% N2、10% CO2)，罐内放一盛水小瓶，使湿度>95%，37°C孵箱内孵育1～4天，观察Hp生长情况以及检测生物学性状。
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1.3 Hp纯培养 取等量已分离纯化的Hp菌液转种到上述两种培养基上，L型玻璃棒均匀涂布后培养，培养条件同上，观察长出肉眼可见菌落所需时间。
1.4 Hp鉴定 生长出的菌株用革兰染色镜检，PCR鉴定，另作脲酶、氧化酶、触酶及动力实验对其生物学性状进行检测，步骤按常规法进行。
2 结果
2.1 两种培养基上胃标本中Hp分离培养速度的比较 标本接种后，每24小时观察一次，如出现可疑Hp菌落，则取菌涂片行革兰染色镜检，并作脲酶、氧化酶、触酶和PCR鉴定。如果形态染色典型，脲酶、氧化酶、触酶及PCR阳性则确认为标本Hp分离阳性。用BHI-EA培养基培养24小时后阳性例数在总阳性例数中的比率为21%(12/57)，高于BHIA上24 h的阳性比率2%(1/52)，两者相差显著(P<0.01)。培养48 h后BHI-EA上的阳性比率为88%(50/57)，也显著高于BHIA上的阳性比率60%(31/52)(见表1)，证明BHI-EA培养基能显著缩短胃标本中Hp的检出时间。
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表1 两种培养基上不同时间胃粘膜标本分离Hp的阳性例数
Table 1 The number of Hp positive from gastric mucosas with BHIA and BHI-EA in difference time
Medium
positive number
Total
24 h
48 h
72 h
96 h
BHIA
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BHI-EA
1
12
30
38
17
6
4
1
52
57
2.2 两种培养基上胃标本Hp分离阳性率比较 分别对82例不同胃病患者(胃癌9例，胃炎16例，胃溃疡23例，十二脂肠溃疡24例，其它胃疾病10例)胃粘膜标本进行分离培养。结果在BHIA上阳性分离率为63%(52/82)，而在BHI-EA上阳性率为70%(57/82)。培养结果表明，BHIA与BHI-EA对不同消化道疾病患者胃粘膜的Hp分离阳性率基本一致，BHI-EA稍高于BHIA，无统计学差异(P>0.05)。
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2.3 两种培养基上Hp纯培养生长速度的比较 所有Hp分离株在此两种培养基上均能顺利生长，但生长速度明显不同，分别取前述57例阳性标本的分离菌株进行纯培养。在BHI-EA上12 h即有4株菌长出肉眼可见菌落，24 h内阳性结果为41例，阳性率为72%(41/57)。而BHIA上12 h内无明显菌落出现，直到24 h才有8株菌株出现，阳性率仅为14%(8/57)，显著低于BHI-EA组(P<0.01)。
3 讨论
最近几年报道的针对Hp培养的无血培养基基本解决了应用含血培养基易污染的问题。但其培养速度仍较慢，我们采用的改良无血培养基充分解决了这一问题，在此培养基中，我们加入了相当于常规卵黄培养基中两倍的卵黄量，同时加入适量的胰蛋白胨成份，充分满足Hp生长营养需求，有效地刺激其生长，此外加入可溶性淀粉可吸附标本中有毒物质及Hp生长的代谢产物，保证Hp处于有利的生长环境。由实验结果可以得出，改良卵黄培养基能大大提高Hp的生长速度从而较大程度的节省培养时间，而且各项生物学性状均很典型，完全能满足临床诊断及Hp的研究所需，是一种实用的Hp培养方法。
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幽门螺杆菌作为人胃内定居菌，对营养成分、气体条件等均有较严格的要求，使其在体外培养中受到很多因素的影响，因此培养基在制备过程中应严格控制pH值和各种成份的含量，特别是抗生素浓度及葡萄糖的含量。此外，由于Hp生长需要一定湿度条件，故在培养基倾倒平板后，应密封放4°C冰箱待用，放置时间不宜超过两周，保证Hp在新鲜培养基中有一最佳生长环境。另外，由于此培养基能有效的促进Hp生长，故在培养过程中应掌握好时间以防生长过度导致细菌球性变。
参考文献
1 Sahay P,West A P,Hawkey P M,et al.Isolation of Helicobacter pylori from faeces.J Infect,1995,30:262～263
2 Ferguson D A J,Li C,Patel N R,et al.Isolation of Helicobacter pylori from saliva.J Clin Microbiol,1993,31:2802～2804
, 百拇医药
3 Hirata I,Itoh T,Masubuchi N，et al.Isoaltion identification and quantitative culture of Helicobacter pylori from gastric mucosa.Nippon Rinsho,1993,51:3170～3175
4 牟兆钦，尹秀云，李富裕，等.用无血脑心浸液卵黄琼脂培养基分离培养幽门螺杆菌的研究.军事医学科学院院刊，1995,19(1):63
5 吴开宇，吴平，潘秀珍，等.一种用于幽门螺杆菌培养和菌种保存的培养基——卵黄培养基.微生物学通报，1992，19(2):112
6 周殿元，等主编.幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京：中国科技出版社，1997.290
(1998-12-22收稿，1999-05-27修回), 百拇医药